中藥成分干預(yù)線粒體自噬對(duì)慢性心力衰竭影響的研究進(jìn)展及強(qiáng)心顆粒的潛在作用機(jī)制探討

林 浩1，龐 延，唐梅玲1，余梅平1，盧健棋

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是多種原因致使心肌出現(xiàn)損傷，導(dǎo)致心臟射血分?jǐn)?shù)顯著降低，進(jìn)而不能滿足機(jī)體代謝需要的一種終末期疾病[1]。目前研究表明，CHF的發(fā)生及發(fā)展的主要機(jī)制是心室重構(gòu)[2]。線粒體自噬是機(jī)體的一種保護(hù)措施，在應(yīng)激程度超過(guò)生理范圍的情況下，線粒體自噬過(guò)程過(guò)于繁亂，導(dǎo)致功能“不健全”的線粒體基數(shù)大量增加，而且該過(guò)程不能得到及時(shí)干預(yù)，常導(dǎo)致左心室重構(gòu)、血小板活化、血管內(nèi)皮損傷及炎性因子增高等不良結(jié)果，最終導(dǎo)致CHF的發(fā)生或加速其進(jìn)程[3-5]。因此干預(yù)線粒體自噬水平對(duì)改善CHF的癥狀及延緩CHF的進(jìn)展有著重要臨床意義，目前中藥成分通過(guò)調(diào)控線粒體自噬以改善CHF心功能等方面的研究取得了令人滿意的進(jìn)展，本研究將近年來(lái)相關(guān)進(jìn)展進(jìn)行歸納總結(jié)，并以廣西名中醫(yī)盧健棋教授強(qiáng)心顆粒中君藥紅參與桂枝為例，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析兩者對(duì)CHF療效影響的潛在作用機(jī)制，以期為未來(lái)研究提供參考。

1 線粒體自噬與CHF相關(guān)的經(jīng)典通路

普通自噬是細(xì)胞將內(nèi)部缺陷、過(guò)剩、衰老的物質(zhì)輸送到溶酶體內(nèi)降解的過(guò)程，是適應(yīng)外界環(huán)境孕育而生的一種“維護(hù)穩(wěn)態(tài)清理狀態(tài)”的措施，具體為與自噬相關(guān)的關(guān)鍵蛋白被外部環(huán)境刺激后致使線粒體去極化，并被自噬特異體包裹送往溶酶體進(jìn)行降解的過(guò)程[5]。雖然兩者自噬過(guò)程均受到蛋白分子以及多種機(jī)制調(diào)控，但線粒體自噬存在高度選擇性，因此不同條件下，被激活的通路也不盡相同，但目前公認(rèn)的哺乳動(dòng)物中調(diào)控線粒體自噬來(lái)影響CHF的主要通路有線粒體膜蛋白磷酸酶和PTEN induce putative kinase 1(PINK1)和Parkin基因、Bcl-2、腺病毒E1B19 000結(jié)合蛋白(Bc1-2 and adenovirus E1B19 000 interacting protein，BNIP3)/線粒體外膜類NIP3蛋白(NIP3-like protein X，NIX)等，它們共同調(diào)控線粒體自噬的整個(gè)過(guò)程，現(xiàn)就其具體機(jī)制進(jìn)行闡述。

1.1 PINK1/Parkin通路 PINK1和Parkin最先被證明與神經(jīng)退行性疾病的產(chǎn)生與發(fā)展關(guān)系密切，例如帕金森綜合征[6-8]。隨著研究愈來(lái)愈多，PINK1和Parkin逐漸被證明與線粒體自噬有著密切關(guān)系，PINK1雖然有時(shí)可通過(guò)外模轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的介導(dǎo)順利進(jìn)入線粒體內(nèi)，并與線粒體內(nèi)膜結(jié)合，但是隨后仍被水解酶降解，所以通常情況下，PINK1在線粒體膜的表達(dá)較少。而在病理情況下，PINK1線粒體去極化以致無(wú)法進(jìn)入線粒體，而僅在線粒體外膜聚集。并且自行磷酸化與活化，從而招募Parkin并進(jìn)行磷酸化來(lái)增強(qiáng)RING種類的泛素連接酶E3活性，促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Parkin向線粒體移動(dòng)，最后在線粒體融合蛋白酶2的介導(dǎo)下與微管蛋白輕鏈3(LC3)結(jié)合后，開(kāi)始啟動(dòng)線粒體自噬[9-10]。同時(shí)相關(guān)研究顯示，沉默PINK1基因后的心肌細(xì)胞中線粒體功能明顯受損，氧化應(yīng)激水平相應(yīng)增高，引起心力衰竭，而沉默Parkin基因?qū)τ谛募〖?xì)胞的線粒體及心臟功能并沒(méi)有明顯影響[11]。

1.2 BNIP3/NIX通路 BH3蛋白和Bc1-2種族中的促凋亡成員等線粒體標(biāo)記蛋白，也參與了調(diào)控線粒體自噬的整個(gè)過(guò)程，BNIP3、NIX將自身所含有的LC3結(jié)構(gòu)域(LIR)磷酸化，增強(qiáng)自噬相關(guān)因子LC3B間的連接作用，同時(shí)與LC3相結(jié)合，從而啟動(dòng)線粒體自噬[12]。BNIP3和NIX在調(diào)控自噬方面作用顯著，并且在缺氧的特定條件下作用更甚。研究顯示，BNIP3可通過(guò)抑制PINK1的分解來(lái)增加心肌線粒體的自噬水平[13]。Dhingra等通過(guò)阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，發(fā)現(xiàn)BNIP3通路調(diào)控可明顯降低心肌細(xì)胞的壞死率，從而延緩心血管疾病進(jìn)入終末期的進(jìn)程，其潛在作用機(jī)制可能與改變線粒體信號(hào)有關(guān)[14]。

1.3 其他相關(guān)通路 FUNDC1通過(guò)與視神經(jīng)萎縮相關(guān)蛋白(optic atrophy protein，OPA)1及動(dòng)力相關(guān)蛋白(dynamin related protein，DRP)1相結(jié)合可調(diào)控線粒體的融合和分裂；E3連接酶腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TNF receptor-associated factor，TRAF)2也可單獨(dú)或與Parkin結(jié)合以介導(dǎo)線粒體自噬，最終發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用；解偶聯(lián)蛋白(mitochondrial uncoupling protein，Ucp)2；內(nèi)膜蛋白抗增殖蛋白(prohibitin，PHB)2等通路可通過(guò)促進(jìn)PINK1的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)線粒體自噬程度[15]。此外E3連接酶SMURF(smad ubiquitination regulatory factor)-1、線粒體外膜蛋白破裂后PHB2等蛋白均不同程度的干預(yù)線粒體自噬，從而影響心力衰竭的進(jìn)程[16]。

2 線粒體自噬對(duì)CHF及相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展影響的相關(guān)機(jī)制

CHF是一種以心臟進(jìn)行性重構(gòu)為主要病變特點(diǎn)的疾病，同時(shí)也是許多疾病發(fā)展的終末期。CHF產(chǎn)生時(shí)，心肌細(xì)胞線粒體自噬增強(qiáng)致使線粒體酶活性降低，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體鈣超負(fù)荷、基因突變等不良后果，導(dǎo)致線粒體物質(zhì)結(jié)構(gòu)與生理功能紊亂[17]。國(guó)內(nèi)研究表明，在CHF病人的心臟組織中，Beclin-1和LC3Ⅱ表達(dá)顯著升高，因?yàn)閮烧哓?fù)荷降低后表達(dá)均有不同程度下降，證實(shí)CHF與自噬明顯相關(guān)[18]。在心臟壓力超負(fù)荷的開(kāi)始階段，應(yīng)激反應(yīng)致使心臟代償性肥厚，線粒體自噬通過(guò)清除“故障”的線粒體，介導(dǎo)線粒體能量代謝使心肌細(xì)胞產(chǎn)能增加，提高三磷酸腺苷(ATP)的轉(zhuǎn)運(yùn)能力與利用效率，進(jìn)而使心肌細(xì)胞得到保護(hù)。但持續(xù)不斷的超負(fù)荷壓力最后發(fā)展為失代償。首先，持續(xù)性超負(fù)荷壓力能致使心肌細(xì)胞Beclin-1過(guò)度表達(dá)，促進(jìn)自噬水平，進(jìn)而使ATP的產(chǎn)生和利用障礙，導(dǎo)致心肌纖維化及病理性重構(gòu)，加速CHF的產(chǎn)生與進(jìn)程。另一方面，持續(xù)性的壓力超載使線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，ATP生成和轉(zhuǎn)運(yùn)失于調(diào)控，心室舒縮功能障礙，致使心室肌重構(gòu)。線粒體自噬在CHF早期可代償性改善心臟功能，是一種保護(hù)心肌的機(jī)制，但隨著時(shí)間的推移，心臟重構(gòu)也逐漸進(jìn)展為失代償，過(guò)度的線粒體自噬則使大量的蛋白質(zhì)降解，加快心力衰竭的發(fā)展，并且氧化應(yīng)激反應(yīng)、異常的能量代謝活動(dòng)可致心臟代謝失代償，加速CHF的進(jìn)程[19-20]。因此，在CHF發(fā)展的整個(gè)過(guò)程中，需將線粒體自噬水平保持在最佳區(qū)域以保持一個(gè)平衡點(diǎn)來(lái)適應(yīng)心臟壓力負(fù)荷的變化，需探究線粒體自噬在心臟功能由代償轉(zhuǎn)變?yōu)槭Т鷥斶^(guò)程中的具體機(jī)制，并從線粒體自噬角度揭示CHF的相關(guān)分子機(jī)制，對(duì)線粒體自噬靶向防治CHF具有重要意義，為臨床治療CHF提供新的研究方向。

除CHF以外，目前線粒體自噬也通過(guò)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床研究證明與心肌梗死(myocardial infarction，MI)、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化及糖尿病性心臟病等心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系密切，并且近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)帕金森病發(fā)病與PINK1與Parkin等線粒體自噬關(guān)鍵分子基因突變有密切關(guān)系，而老年性心肌病與帕金森病有流行病學(xué)上的關(guān)聯(lián)性[21-23]。同時(shí)國(guó)外研究顯示，帕金森病人新發(fā)心力衰竭的概率是非帕金森病人的兩倍或以上[24]。

3 中藥成分調(diào)節(jié)線粒體自噬水平的相關(guān)機(jī)制研究

非病理性的線粒體自噬過(guò)程可及時(shí)清除結(jié)構(gòu)或功能缺陷線粒體，是維持心肌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及保證線粒體細(xì)胞器質(zhì)量的首要前提，也是防治及延緩CHF與防治心血管疾病進(jìn)入終末期重要目標(biāo)。近年來(lái)，由于多項(xiàng)研究證實(shí)中藥成分對(duì)心血管疾病存在多靶點(diǎn)、多途徑起作用的優(yōu)勢(shì)，在CHF的診療方面有明顯的優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用前景，并且多項(xiàng)國(guó)內(nèi)外研究表明，中藥成分治療心血管疾病的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)與線粒體有密不可分的關(guān)系[25-26]。

國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于缺血再灌注損傷模型大鼠，參族提取物人參皂苷Rg1具有抑制心肌細(xì)胞凋亡、延緩線粒體結(jié)構(gòu)損傷、促進(jìn)自噬水平、調(diào)節(jié)ATP代謝、改善心肌血流量的作用[27-29]。線粒體自噬能夠清除MI后細(xì)胞內(nèi)有“故障”的線粒體，因此提高線粒體自噬程度可保持細(xì)胞內(nèi)正常ATP水平、防治細(xì)胞凋亡、延緩MI后心肌重構(gòu)的進(jìn)程，對(duì)MI后心臟功能起保護(hù)作用，這意味著調(diào)控線粒體自噬水平將成為MI后進(jìn)展成CHF的一個(gè)重要策略[30]。Wang等[31]發(fā)現(xiàn)黨參中的提取物可致使心肌線粒體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物、H2O2及丙二醛含量明顯下降，表明黨參提取物可通過(guò)抗氧化酶活性而抑制運(yùn)動(dòng)造成的線粒體氧化損傷。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸B可以通過(guò)增進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)通路的表達(dá)來(lái)增加mortalin蛋白含量，從而維持心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)及功能的穩(wěn)定性，同時(shí)還可通過(guò)增進(jìn)LC3Ⅱ和Beclin-1以及Parkin的表達(dá)，提升線粒體自噬效率，減少受損線粒體的積累，進(jìn)而保護(hù)缺血心肌細(xì)胞[32-33]。此外，大量研究顯示，白藜蘆醇、人參皂苷、木犀草素、紫荊黃酮、黃芪甲苷等中藥成分可通過(guò)多途徑調(diào)控心肌細(xì)胞線粒體自噬水平及相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)揮心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，從而達(dá)到延緩CHF疾病的進(jìn)展及相關(guān)心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展[34-38]?？傊?，挖掘中藥成分干預(yù)線粒體自噬水平治療CHF的相關(guān)潛在機(jī)制及相關(guān)靶點(diǎn)為未來(lái)研究的重要方向之一。

4 基于BATMAN-TCM分析盧健棋教授經(jīng)驗(yàn)方強(qiáng)心顆粒中君藥紅參-桂枝治療CHF的潛在機(jī)制

強(qiáng)心顆粒是廣西名中醫(yī)盧健棋教授在總結(jié)CHF的病因病機(jī)基礎(chǔ)上改進(jìn)的經(jīng)驗(yàn)方，方中紅參補(bǔ)氣、桂枝溫陽(yáng)，為君藥。現(xiàn)基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)強(qiáng)心顆粒君藥治療CHF的潛在作用機(jī)制進(jìn)行剖析。

4.1 分析紅參-桂枝的疾病富集 在BATMAN-TCM系統(tǒng)中，將“Adjusted P-value”設(shè)置0.05，并將“Score cutoff”設(shè)置80，得到紅參與桂枝富集的疾病共139種，與CHF疾病關(guān)系密切相關(guān)的有10種，得到相關(guān)靶點(diǎn)13個(gè)(其中紅參1個(gè)，桂枝12個(gè))。詳見(jiàn)表1。

表1 紅參-桂枝的疾病富集

4.2 探析紅參-桂枝潛在作用信號(hào)通路 在BATMAN-TCM系統(tǒng)中，通過(guò)KEGG通路途徑得到紅參和桂枝的生物學(xué)通路共有19條(紅參中設(shè)置連接化合物的目標(biāo)≥1，桂枝中設(shè)置的連接化合物≥1)，其中與紅參相關(guān)的信號(hào)通路為Tryptophan Metabolism、Glycolysis/Gluconeogenesis、Arginine and Proline Metabolism、Fatty Acid Degradation、Metabolism of Xenobiotics by Cytochrome P450、Retinol Metabolism、Tyrosine Metabolism；與桂枝相關(guān)的信號(hào)通路為Inflammatory Mediator Regulation of TRP Channels、Calcium Signaling Pathway、AMPK Signaling Pathway、One Carbon Pool by Folate、Adipocytokine Signaling Pathway、Retinol Metabolism、Neuroactive Ligand-Receptor Interaction、CGMP-PKG Signaling Pathway、Adrenergic Signaling in Cardiomyocytes。紅參與桂枝的全部靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)化展示(見(jiàn)圖1、圖2)。

圖1紅參靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)化展示圖

圖2桂枝靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)化展示圖

5 展 望

大量國(guó)內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)證據(jù)表明，中藥成分可通過(guò)調(diào)控線粒體自噬的方式改善CHF的癥狀或延緩該病的進(jìn)程。雖然線粒體自噬、結(jié)構(gòu)缺損及功能損傷在心肌損傷的機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。但線粒體自噬也是一把鋒利的“雙刃劍”，自噬過(guò)度對(duì)機(jī)體有害，適度自噬有益于機(jī)體代謝。目前，針對(duì)CHF疾病線粒體自噬的相關(guān)中藥成分干預(yù)研究仍處于初級(jí)探索階段，以盧健棋教授強(qiáng)心顆粒為例，現(xiàn)階段應(yīng)當(dāng)盡力挖掘并利用有益的一面，接著根據(jù)初級(jí)成果以期更多專家學(xué)者及團(tuán)隊(duì)開(kāi)展更深層次的探索，為其防治CHF疾病提供對(duì)臨床有指導(dǎo)意義的理論和新靶點(diǎn)，同時(shí)提高醫(yī)療資源使用效率。