在線反應(yīng)-高效液相色譜聯(lián)用分析pH值對柑橘汁環(huán)氧佛手柑素水合反應(yīng)的影響

李貴節(jié)，程玉嬌，張群琳，周琦，談安群，張騰輝，吳厚玖，趙曉春，RUSSELL L ROUSEFF *，梁國魯

1(西南大學 柑桔研究所 國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶，400712) 2(重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶，400067)3(成都市華測檢測技術(shù)有限公司，四川 成都，610041) 4(西南大學 園藝園林學院，重慶，400715)

6′,7′-環(huán)氧佛手柑素(6′,7′-epoxybergamottin, 6′,7′-EB)是補骨脂素的5-O-取代衍生物，屬于呋喃香豆素(furanoucoumarins, FCs)類物質(zhì)。與之結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)還包括：佛手柑素、6′,7′-二羥佛手柑素(6′,7′-dihydroxybergamottin, 6′,7′-DHB)、異歐前胡素(isoimperatorin, IIR)、氧化前胡素、水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯及佛手酚等(見圖1)。FCs廣泛分布于以蕓香科和傘形科為代表的高等植物中[1-2]，具有抗艾滋病、抗菌、抗血小板凝集、抗癌、抗結(jié)核、抗驚厥以及護肝等生理活性[3-9]。

R=a-佛手柑素;b-6′,7′-環(huán)氧佛手柑素;c-6′,7′-二羥佛手柑素;d-異歐前胡素;e-氧化前胡素;f-水合氧化前胡素;g-佛手柑內(nèi)酯；h-佛手酚圖1 柑橘中常見5-O-取代呋喃香豆素的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of common 5-O-substituted furanocoumarins in citrus species

以葡萄柚為代表的某些柑橘中含有6′,7′-EB及其衍生物，它們還具有抑制哺乳動物細胞色素P450(cytochrome P450, CYP)的作用[10]，使CYP依賴的藥物代謝減緩，對于正在服藥的患者具有一定的風險[11-13]。該抑制作用的強弱與側(cè)鏈取代基的結(jié)構(gòu)有關(guān)[14]。ROW等[15]認為5-O-側(cè)鏈烴基長度與FCs的抑制效果呈正相關(guān)，取代基上存在烯鍵和6′,7′-親水基團也會增強抑制作用，并研究得到上述FCs對小腸S9組分CYP3A4的半抑制濃度為6′,7′-EB

柑橘汁是柑果的主要加工產(chǎn)品，不同品種的柑橘汁中FCs的組成和含量各不相同，如甜橙和寬皮桔汁幾乎不含F(xiàn)Cs，葡萄柚汁含6′,7′-DHB和佛手柑素等[3]，而柚子汁含有氧化前胡素和6′,7′-EB等[16]；不同成熟期、灌裝方法和貯藏條件對同一品種柑橘汁所含F(xiàn)Cs也有影響[17]；果肉的不同組分如汁胞液、汁胞壁、囊瓣壁等在加工破碎過程中對果汁FCs的貢獻比例也有顯著差異[18]。因此，要深入研究柑橘汁產(chǎn)品對人體CYP的作用，需能準確地定性、定量分析其中的FCs并進一步了解其變化情況。前期研究[19]發(fā)現(xiàn)，對pH 3.5的葡萄柚汁做6′,7′-EB和6′,7′-DHB的加標回收實驗，前者回收率低于75%，而后者回收率高達120%以上。由此推測在該酸性條件下部分6′,7′-EB轉(zhuǎn)化為6′,7′-DHB，即5-O-取代側(cè)鏈上的環(huán)氧基開環(huán)并與水分子結(jié)合生成對應(yīng)的鄰二醇。此類反應(yīng)的開環(huán)速率與質(zhì)子酸催化劑的強度密切相關(guān)[20]，因而柑橘汁酸度將對反應(yīng)速率和進程產(chǎn)生重要的影響。

迄今尚未有果汁中6′,7′-EB等FCs的變化及反應(yīng)產(chǎn)物和速率的報道。過往對食品成分化學反應(yīng)的動力學研究大多關(guān)注單一反應(yīng)物的簡單反應(yīng)速率[21-22]，所用檢測方法常為滴定、比色等傳統(tǒng)方法[22-23]，近年來才逐步采用色譜法及其聯(lián)用技術(shù)，并同時對反應(yīng)產(chǎn)物進行定性和定量分析[24-27]。然而，它們都采用人工定時取樣的方式，且部分研究取樣后并未立即終止反應(yīng)，難以避免誤差。本研究開發(fā)了一套柱前在線反應(yīng)-高效液相色譜-二極管陣列檢測聯(lián)用的方法，通過全程自動控制，精確分析25 ℃常溫下不同酸度的模擬柑橘汁中6′,7′-EB的反應(yīng)產(chǎn)物和反應(yīng)速率，并通過實際果汁樣品予以驗證，從而探究柑橘汁加工過程中FCs的變化情況，為評價柑橘汁對CYP的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅葡萄柚(星路比)成熟果實，國家果樹種質(zhì)資源柑橘圃(重慶)。

蔗糖、果糖、葡萄糖、維生素C和檸檬酸(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；NaOH(分析純)，天津市風船化學試劑科技有限公司。

標準對照品(HPLC級)：6′,7′-環(huán)氧佛手柑素、佛手酚、佛手柑素，美國ChromaDex公司；佛手柑內(nèi)酯，加拿大TRC公司；6′,7′-二羥佛手柑素、異歐前胡素、氧化前胡素、水合氧化前胡素，上海源葉生物有限公司。乙腈、甲醇、四氫呋喃、H3PO4(色譜純)，美國Honeywell公司；乙酸乙酯(分析純)，成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

裝配恒溫自動進樣器的HPLC-DAD系統(tǒng)(Infinity 1260)，安捷倫科技有限公司；阿貝折射儀(CAR-02)，Contech Instruments Ltd.；全自動數(shù)字pH計(FE28)，梅特勒-托利多(上海)有限公司；超純水系統(tǒng)(Milli-Q Reference)，德國Merck-Millpore公司；十萬分之一天平(SQP)，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；高速冷凍離心機(Sorvall ST 16R)，賽默飛世爾科技有限公司；超聲波清洗器(SB-5200 DTN)、真空冷凍干燥機(Scientz-10ND)、組織研磨器(Scientz-192)，寧波新芝生物科技股份有限公司；DouR@SPT-H型氮空吹掃濃縮儀，北京斯珀特科技有限公司；攪拌器(MultiQuick)，德國博朗電器。

1.3 實驗方法

1.3.1 模擬柑橘汁的配制

按PELEG等[28]方法并作修改：配制100.0 g糖溶液，含6.0 g蔗糖、3.0 g果糖和3.0 g葡萄糖，其余用水補足。配制1.0 mol/L檸檬酸溶液100 mL。分別取適量糖、酸溶液均勻混合，加入維生素C使其質(zhì)量濃度為500.0 mg/L，得到模擬青檸汁(pH 2.0、7.8°Brix)、模擬葡萄柚汁(pH 3.5、9.2°Brix)和模擬沙田柚汁(pH 5.0、12.0°Brix)。準確吸取各模擬果汁950 μL于2.0 mL棕色樣品瓶中。

1.3.2 模擬柑橘汁在線反應(yīng)控制

進樣器樣品盤控溫25 ℃，樣品準備和反應(yīng)于樣品瓶中在線進行，設(shè)置并優(yōu)化自動化程序如下：

進樣針提針→甲醇潤洗進樣針外壁→吸取6′,7′-EB甲醇溶液50 μL→移入模擬柑橘汁樣品瓶→瓶內(nèi)吹打(100 μL×3次)混勻→[甲醇清洗進樣針內(nèi)外壁2次→吸取模擬柑橘汁反應(yīng)液5 μL→吸取反應(yīng)終止液5 μL→進樣，六通閥切換至旁路→進樣針提針→持續(xù)吹打(100 μL/min)混勻模擬柑橘汁反應(yīng)液→單次HPLC分析結(jié)束前2 min提針]×N次→分析結(jié)束，徹底清洗進樣系統(tǒng)和全流路

其中反應(yīng)終止液為NaOH溶液，pH 2.0反應(yīng)體系對應(yīng)濃度為10.0 mmol/L，pH 3.5/5.0反應(yīng)體系對應(yīng)濃度為0.3 mmol/L。

1.3.3 模擬反應(yīng)體系的樣品分析條件

色譜柱：Thermo Scientific Accucore PFP(2.6 μm, 150 mm×4.6 mm)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min。流動相條件根據(jù)不同酸度下反應(yīng)速率的快慢進行優(yōu)化。對pH 2.0體系采用等度洗脫，0～7 min保持V(水)∶V(乙腈)=35∶65。對pH 3.5和5.0體系采用梯度洗脫，流動相組成為：A水、B乙腈、CV(水)∶V(四氫呋喃)=50∶50；梯度程序為：0～4 min，57%A、15%B、28%C；6～10.5 min，35%A、35%B、30%C；10.51～20 min，后運行。檢測器設(shè)置：DAD掃描波長為 210～400 nm，定量檢測波長設(shè)為250 nm。

1.3.4 果肉和果汁樣品的前處理和色譜條件

成熟葡萄柚果實去外果皮后，小心清理囊衣上附著的白皮層和殘留筋絡(luò)，將裸露果球稱重。

果肉FCs提?。簩⒁阎|(zhì)量的鮮果球粗分為4～6瓣，置于-45 ℃真空冷凍干燥機中脫水至恒重，經(jīng)組織研磨器粉碎，加入適量乙酸乙酯進行超聲輔助提取(25 ℃, 300 W, 10 min)，重復3次，合并提取液并在40 ℃氮氣流下吹干，用甲醇重溶解并過0.22 μm濾膜后，得到葡萄柚果肉原始FCs粗提物。

果汁FCs提?。簩?批已知質(zhì)量的鮮果球快速打碎成果漿，再分別進行超聲處理(25 ℃, 300 W)30和60 min，迅速加入適量0.1 mol/L NaOH溶液，將果漿pH調(diào)至5.0～7.0之間，終止酸誘導反應(yīng)。果漿過單層紗布濾出果汁，果渣用少量清水洗滌3次，合并果汁和洗滌液，加入適量乙酸乙酯萃取，重復3次后合并有機相，后續(xù)步驟同果肉萃取。

色譜條件：采用安捷倫Poroshell 120 EC-C8色譜柱(2.7 μm，4.6 mm×150 mm)，流動相流速為1 mL/min，四元流動相組成：0.025%磷酸水溶液(A)、甲醇(B)、乙腈(C)和體積分數(shù)20%四氫呋喃水溶液(D)，采用周琦等[29]的HPLC梯度洗脫方法；DAD設(shè)置同模擬果汁檢測條件。

1.3.5 FCs成分的定性和定量分析

以紫外吸收光譜和色譜峰保留時間相結(jié)合的方法對模擬柑橘汁反應(yīng)體系樣品以及葡萄柚樣品的FCs成分做定性分析。準確稱取各FCs標準物質(zhì)溶于甲醇中，配制成濃度為40.0 mmol/L儲備液，逐級稀釋得到摩爾濃度為2.0、1.5、1.0、0.5、0.25、0.10和0.01 mmol/L的系列稀釋液，經(jīng)HPLC測定后求出各物質(zhì)的峰面積-濃度線性關(guān)系，采用外標法對樣品中的目標成分做定量分析。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)均平行測定3次，結(jié)果表示為平均值±標準偏差。數(shù)據(jù)分析及圖表繪制由Excel 2016和Origin 8.5軟件完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 環(huán)氧佛手柑素在線反應(yīng)與自動化控制

傳統(tǒng)上，化學反應(yīng)過程的在線分析一般依賴于專用或自研設(shè)備。隨著商品化液相色譜功能的日益增強，利用其恒溫、可編程的自動進樣系統(tǒng)作為原位在線反應(yīng)控制單元，結(jié)合HPLC的分離和分析能力，使得對反應(yīng)體系的定時取樣、反應(yīng)生成物的定性鑒定以及反應(yīng)速率的分析確定得以實現(xiàn)。進樣器六通閥可使流路在主路(main-pass)和旁路(by-pass)間切換：主路模式下，流動相經(jīng)定量器、進樣環(huán)、進樣針和針座，推動樣品進入色譜柱；旁路模式下，上述進樣部件被短接，流動相直接泵送至色譜柱以維持流路。基于對六通閥的充分利用，通過程序設(shè)置在分析樣品的同時維持反應(yīng)液的吹打、混勻操作，保證了反應(yīng)平穩(wěn)、充分。

為進一步消除從吸取反應(yīng)液到反應(yīng)終止前一小段時間對反應(yīng)速率精確計算的影響，設(shè)計了進樣針連續(xù)吸取反應(yīng)液和終止液而后迅速進樣的程序。由于進樣針內(nèi)徑狹窄，兩段液柱接觸面極小，反應(yīng)并不會立即終止；進樣后，針內(nèi)液柱被流動相迅速帶到色譜柱前端，遇填料顆粒產(chǎn)生湍流而充分混合，此時反應(yīng)終止。故每次進樣的時間點即為反應(yīng)過程中的數(shù)據(jù)采集點，時間精度達0.01 min。由于從反應(yīng)到分析的全過程操作均由機器完成，最大限度地排除了包括人工在內(nèi)的各種偶然因素，因而分析誤差僅取決于儀器的系統(tǒng)誤差，具有很高的精度優(yōu)勢。

2.2 5-O-取代FCs的紫外光譜和定量方程

利用DAD對8個5-O-取代呋喃香豆素(a～h)標準品溶液進行掃描，得到各物質(zhì)的紫外吸收光譜,如圖2所示。

a-佛手柑素;b-6′,7′-環(huán)氧佛手柑素;c-6′,7′-二羥佛手柑素;d-異歐前胡素;e-氧化前胡素;f-水合氧化前胡素;g-佛手柑內(nèi)酯;h-佛手酚圖2 常見5-O-取代呋喃香豆素的紫外吸收光譜Fig.2 UV absorbance spectra of common 5-O-substituted furanocoumarins

母環(huán)上相同位置取代的FCs紫外光譜具有相似性，但精確對比發(fā)現(xiàn)各物質(zhì)的主峰(310 nm附近)和肩峰(250 nm附近)仍有2～5 nm的區(qū)別，其中佛手酚(5-羥補骨脂素)差異最明顯，羥基的存在減弱了母環(huán)的共軛效應(yīng)，從而使主峰和肩峰都產(chǎn)生了約5 nm的藍移。通過與標準物質(zhì)比對光譜和保留時間，能夠?qū)δM反應(yīng)體系和真實樣品中的目標FCs準確定性。為避免溶劑在低波長端的干擾，選擇相對響應(yīng)值較高的250 nm作為定量檢測波長。各物質(zhì)的回歸方程如表1所示，相關(guān)系數(shù)R2在0.999 4～1.000 0之間。

表1 各呋喃香豆素的定量線性關(guān)系Table 1 Linearity of each furanocoumarins for quantitative analysis

注：A為色譜峰面積，c為濃度(μmol/L)

2.3 模擬果汁中6′,7′-EB的反應(yīng)產(chǎn)物和速率分析

在25 ℃、pH 5.0的相對低酸性模擬果汁中6′,7′-EB基本穩(wěn)定，經(jīng)過48 h反應(yīng)僅有約0.3%損失，生成微量水合產(chǎn)物6′,7′-DHB，未檢出其他FCs(色譜圖略)。對常見酸果類柑橘(pH≈2.0)和汁用柑橘(pH≈3.5)模擬體系中6′,7′-EB反應(yīng)進行分析，發(fā)現(xiàn)酸度是影響反應(yīng)產(chǎn)物和速率的關(guān)鍵因素，酸性越強反應(yīng)速率越快。

2.3.1 pH 2.0模擬體系

6′,7′-EB酸誘導反應(yīng)過程中連續(xù)自動取樣分析的色譜圖如圖3-A所示。追蹤反應(yīng)物和準確定性的2個產(chǎn)物的濃度變化情況，結(jié)果顯示，6′,7′-EB首先發(fā)生了平行反應(yīng)(parallel reaction)，6′,7′-DHB為主反應(yīng)產(chǎn)物，IIR為副反應(yīng)產(chǎn)物；兩者的摩爾濃度都呈現(xiàn)先升高、后降低的趨勢，且極大值于約28 min同時出現(xiàn)(見圖3-B)，由此判斷6′,7′-DHB和IIR還發(fā)生了后續(xù)反應(yīng)(consecutive reaction)，生成了其他未知物質(zhì)。圖3-C顯示6′,7′-EB的ln(C0/Ct)值與反應(yīng)時間的線性關(guān)系優(yōu)良(R2=0.998 1)，表明其濃度降低的過程符合一級反應(yīng)規(guī)律。根據(jù)擬合方程得出6′,7′-EB在25 ℃ pH 2.0的模擬柑橘汁中表觀反應(yīng)速率常數(shù)k’=0.071 4 min-1，其半壽期為9.71 min。

A-各取樣點反應(yīng)樣品色譜圖;B-6′,7′-EB及其主要反應(yīng)產(chǎn)物的濃度-時間曲線;C-6′,7′-EB按一級反應(yīng)規(guī)律擬合的線性曲線b-6′,7′-環(huán)氧佛手柑素；c-6′,7′-二羥佛手柑素；d-異歐前胡素；由于系統(tǒng)誤差低，圖中未顯示誤差線圖3 25 ℃, pH 2.0模擬柑橘汁中6′,7′-EB酸誘導反應(yīng)主要產(chǎn)物和動力學分析Fig.3 Major products and kinetic analysis of 6′,7′-EB acid induced reaction in pH 2.0 imitated citrus juice at 25 ℃

進一步分析反應(yīng)過程，設(shè)6′,7′-DHB和IIR的后續(xù)反應(yīng)表觀級數(shù)也是一級，將模擬柑橘汁中的復雜反應(yīng)簡化如下(k1～k4為各簡化反應(yīng)的表觀速率常數(shù))：

考察6′,7′-EB、6′,7′-DHB和IIR的實時濃度：

得到各反應(yīng)速率方程為：

(1)

(2)

(3)

6′,7′-DHB和IIR的濃度y1、y2積分通式為：

(4)

(5)

當[B]、[C]出現(xiàn)極大值時，公式(4)、(5)的一階導數(shù)為零，此時有：

(6)

(7)

(8)

(9)

如圖3-B所示，t1max=t2 max=28.0 min，y1max=1 206.2 μmol/L，y2max=168.4 μmol/L，C0=1 900 μmol/L，解出k1=0.066 7 min-1、k2=0.010 2 min-1、k3=0.016 2 min-1、k4=0.086 5 min-1。其中k1+k2與6′,7′-EB降低的速率常數(shù)k’接近(相對誤差約7.7%)，進一步驗證了6′,7′-EB發(fā)生2個平行反應(yīng)的模型與實際情況相符。對于酸度接近pH 2.0的酸果類柑橘，在測得果肉中6′,7′-EB初始含量C0的基礎(chǔ)上，利用各速率常數(shù)通過公式(4)和(5)即可計算果實榨汁后任一時刻果汁中6′,7′-DHB和IIR的含量。

2.3.2 pH 3.5模擬體系

反應(yīng)體系色譜圖及各物質(zhì)濃度變化情況如圖4所示。由于酸度降低導致反應(yīng)速率減緩，取樣間隔適當放寬，色譜分析時間也隨之延長。pH 3.5條件下，

A-各取樣點反應(yīng)樣品色譜圖;B-6′,7′-EB及其主要反應(yīng)產(chǎn)物的濃度-時間曲線;C-6′,7′-EB按一級反應(yīng)規(guī)律擬合的線性曲線b-6′,7′-環(huán)氧佛手柑素;c-6′,7′-二羥佛手柑素;d-異歐前胡素圖4 25 ℃, pH 3.5模擬柑橘汁中6′,7′-EB酸誘導反應(yīng)主要產(chǎn)物和動力學分析Fig.4 Major products and kinetic analysis of 6′,7′-EB acid induced reaction in pH 3.5 imitated citrus juice at 25 ℃注：由于系統(tǒng)誤差低，圖中未顯示誤差線

6′,7′-EB的降解仍服從一級反應(yīng)規(guī)律，表觀速率常數(shù)k’=0.005 79 min-1，半壽期增至119.7 min，約是pH 2時的12倍。主副反應(yīng)產(chǎn)物仍是6′,7′-DHB和IIR，但其濃度-時間曲線單調(diào)遞增并逐步趨緩，反應(yīng)物和產(chǎn)物的物質(zhì)總量也基本保持穩(wěn)定(圖4-B)，因此可以判斷模擬體系中只發(fā)生了平行反應(yīng)的第一步，pH 3.5酸度不足以催化后續(xù)反應(yīng)的進行。

此時2.3.1中公式(2)、(3)簡化為：

兩式相除有：

在6′,7′-DHB和IIR初始濃度均為0的條件下，上式進一步簡化為：

(10)

由圖4-B中6′,7′-DHB和IIR兩條曲線在各時間點對應(yīng)的高度求得，k1/k2=12.22±0.57，代入公式(1)中得到：k1=0.005 35 min-1，k2=0.000 438 min-1。

2.4 葡萄柚汁中FCs組成和含量變化的計算預測和實驗驗證

葡萄柚是柚類的一種，在我國又稱西柚，是全球僅次于甜橙的第二大汁用柑橘類別，其中的紅肉品系在西方也用于鮮食。由于紅葡萄柚果汁色澤粉紅誘人，具有獨特的香氣和風味，近年來已逐漸被國人接受和喜愛。葡萄柚汁加工從榨汁、精濾、均質(zhì)到脫氣等程序均在常溫中進行，耗時約半小時到數(shù)小時不等；非濃縮還原(not from concentrate, NFC)汁和濃縮汁還要經(jīng)過短時高溫滅菌和蒸發(fā)等熱處理，而當前最高檔的超高壓處理(high pressure processing, HPP)果汁則全程都處于常溫狀態(tài)。可利用已獲得的6′,7′-EB反應(yīng)機理和動力學參數(shù)，對常溫處理過程中葡萄柚汁FCs的組成和含量變化進行預測。

6′,7′-環(huán)氧佛手柑素與酸接觸反應(yīng)從果實破碎即已開始，而果汁粗提物的前處理時間長達30 min以上，難以通過對果汁的檢測獲取FCs的準確初始含量，故采用冷凍干燥使紅葡萄柚果肉脫水再進行有機溶劑萃取。干燥果肉提取物及榨汁破碎30、60 min后的粗濾汁提取物的色譜圖如圖5所示，果肉和果汁中均未檢出氧化前胡素(e)和水合氧化前胡素(f)，而干燥原始果肉中未檢出異歐前胡素。

按果肉初始FCs含量計算果汁在2個時間點取樣的FCs含量，比較計算預測值與實測值之間的差異，結(jié)果如表2所示。由表2可見，6′,7′-EB(b)、6′,7′-DHB(c)和IIR(d)的預測值與實測值的相對偏差在10.1%～14.9%之間；同時發(fā)現(xiàn)佛手柑素(a)在果肉和果汁中的實測含量也呈現(xiàn)較大的偏差(9.9%和11.0%)。由于常溫下佛手柑素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不發(fā)生酸誘導反應(yīng)，其濃度應(yīng)基本不隨時間推移而變化，因而果肉與果汁間的測定差異應(yīng)主要來源于前處理，即干燥果肉中的佛手柑素提取效率比果汁中更高；以干燥果肉提取效率為100%，30、60 min時果汁的相對提取效率為89.0%和90.1%，又由于b、c、d三物質(zhì)的保留時間與a接近，可粗略認為它們的提取效率基本相同。據(jù)此，分別對2個時間點果汁中各FCs實測濃度進行修正，則果汁的實測修正值與預測值之間的相對偏差僅為：6′,7′-EB 0.8%和1.6%，6′,7′-DHB 2.2%和2.3%，IIR 3.4%和5.6%。該結(jié)果說明25 ℃模擬果汁動力學方程與實際反應(yīng)基本相符，利用本方法能夠較準確地預測pH約為3.5的柑橘汁加工過程中，6′,7′-EB及其相關(guān)FCs產(chǎn)物的組成和含量變化。

a-佛手柑素;b-6′,7′-環(huán)氧佛手柑素;c-6′,7′-二羥佛手柑素，d-異歐前胡素;e-氧化前胡素;f-水合氧化前胡素;g-佛手柑內(nèi)酯;h-佛手酚；同時標示其他主要次生代謝物圖5 25 ℃, pH約3.4～3.6紅葡萄柚汁中與6′,7′-EB相關(guān)的主要FCs色譜圖Fig.5 Chromatograms of major FCs related to 6′,7′-EB in pH 3.4～3.6 red grapefruit juice at 25 ℃

表2 紅葡萄柚汁中FCs隨時間變化的預測值、實測值及實測修正值的比較Table 2 Comparison of predicted value, measured value and corrected measured value showing FCs changes with timein red grapefruit juice

注：NA，未涉及化學變化，無需計算預測值；ND，未檢出，計算中作0處理；*，利用a物質(zhì)在果汁和果肉中的提取量之比為換算系數(shù)，對果汁實測值作換算修正；-，h和g物質(zhì)保留時間距a較遠，不符合修正條件，未做修正及相對偏差2計算；對于物質(zhì)h/g/a，相對偏差1(%)=(果肉提取物實測值-果汁提取物實測值)/果肉提取物實測值× 100；對于物質(zhì)c/d/b，相對偏差1(%)=(果汁提取物預測值-果汁提取物實測值)/果汁提取物預測值×100，相對偏差2(%)=(果汁提取物預測值-果汁提取物實測修正值)/果汁提取物預測值×100

3 結(jié)論

構(gòu)建在線柱前反應(yīng)-HPLC-DAD系統(tǒng)，開發(fā)了全套程序化自動監(jiān)測柑橘汁呋喃香豆素側(cè)鏈環(huán)氧基酸誘導反應(yīng)的方法，在鑒定反應(yīng)產(chǎn)物的同時實現(xiàn)對反應(yīng)速率的研究，具有精確度高和節(jié)省人力的突出特點。利用該方法研究了模擬柑橘汁體系中6′,7′-環(huán)氧佛手柑素的側(cè)鏈反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其主要通過開環(huán)水合生成6′,7′-二羥佛手柑素，還發(fā)生碳鏈縮短反應(yīng)產(chǎn)生少量異歐前胡素。動力學研究表明上述反應(yīng)均符合一級反應(yīng)規(guī)律，pH越低、反應(yīng)速率越快。驗證實驗結(jié)果顯示，應(yīng)用模擬體系反應(yīng)速率常數(shù)能夠較準確地計算紅葡萄柚汁中6′,7′-EB及其產(chǎn)物的實時濃度，與修正后測量值的偏差范圍僅為0.8%～5.6%。研究加深了對柑橘FCs采后加工變化的認識，為評估柑橘汁生物活性作用提供了新的工具和途徑。