飲用天然礦泉水中產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)方法的改良

章海通，承海，邢家溧，，*，王紹輝，周霞霞，徐曉蓉，嚴(yán)小軍

（1.寧波市食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，浙江寧波315048；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211；3.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江寧波315211）

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）因能分解肌肉和結(jié)締組織中的糖類產(chǎn)生大量氣體并在體內(nèi)形成莢膜而得名[1]，該菌是后壁菌門梭狀芽胞桿菌屬的一種，呈粗短的大桿狀，無(wú)鞭毛，專性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性菌[2]。多以芽胞形式分布于土壤等自然界中，也存在于人、動(dòng)物及其腸道中，是腸道的正常菌群之一，同時(shí)也是一種條件致病菌[3-4]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌在GB 8537-2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水》[5]標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)其要求為從一批樣品中采集5 件樣品，每件樣品的采樣量50 mL，均不得檢出。檢驗(yàn)方法按GB 8538-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》[6]將礦泉水過(guò)濾后的濾膜緊貼在亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂（sulfitepolymyxin-sulphadiazine agar，SPS） 上 36 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)濾膜上的黑色菌落，并取黑色可疑菌落做進(jìn)一步的驗(yàn)證試驗(yàn)。但實(shí)際檢驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)完全按照GB 8538-2016 方法檢驗(yàn)，濾膜上截留的產(chǎn)氣莢膜梭菌在SPS 培養(yǎng)基上36 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，并無(wú)明顯的黑色菌落，在此情況下容易誤認(rèn)為被檢樣品中不含產(chǎn)氣莢膜梭菌，而導(dǎo)致漏檢。為此，本文對(duì)國(guó)標(biāo)法進(jìn)行改良，并對(duì)適用的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)選，以使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

1 材料與方法

1.1 菌株

產(chǎn)氣莢膜梭菌CICC22949：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，-70 ℃磁珠保藏。

1.2 主要培養(yǎng)基和試劑

亞硫酸鹽-多黏菌素-磺胺嘧啶瓊脂、胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂（tryptose-sulfite-cycloserine agar，TSC）、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（thioglycollate medium，F(xiàn)TG）、動(dòng)力-硝酸鹽培養(yǎng)基、緩沖動(dòng)力-硝酸鹽培養(yǎng)基、含鐵牛奶培養(yǎng)基、卵黃瓊脂培養(yǎng)基、血平板、革蘭氏染色液：北京陸橋技術(shù)股份有限責(zé)任公司；孔徑為0.22 μm的無(wú)菌濾膜：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；飲用礦泉水：華潤(rùn)萬(wàn)家超市。

1.3 主要儀器

1378 二級(jí)生物安全柜：美國(guó)Thermo Fisher 公司；IF750 恒溫培養(yǎng)箱：德國(guó) memmert 公司；Anaer obox IV多組分氣體培養(yǎng)系統(tǒng)：中國(guó)江雪公司；illiflex RLUS Pump 微生物過(guò)濾系統(tǒng)：美國(guó)Millipore 公司。

1.4 方法

1.4.1 菌懸液的制備

將保藏于磁珠中的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株接種于血平板上并置于36 ℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，待血平板上長(zhǎng)出明顯菌落，再挑取上述血平板上的單菌落接種于FTG 培養(yǎng)基并于36 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，用0.85%的無(wú)菌生理鹽水連續(xù)梯度稀釋培養(yǎng)后的FTG 培養(yǎng)基，控制菌濃度在10 CFU/mL～102CFU/mL，無(wú)菌吸取1 mL 稀釋后的菌液加入到50 mL 無(wú)菌礦泉水中作為人工污染樣品。

1.4.2 國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)

按照國(guó)標(biāo)方法GB 8538-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》，取50 mL 用產(chǎn)氣莢膜梭菌CICC22949 人工污染的水樣經(jīng)孔徑為0.22 μm 的無(wú)菌濾膜過(guò)濾，將濾膜移至SPS 培養(yǎng)基上，于36 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.4.3 改良方法1——雙層培養(yǎng)基覆蓋法

水樣過(guò)濾同1.4.2 方法，將濾膜緊貼于SPS 培養(yǎng)基上后，先覆蓋一層（約10 mL）SPS 培養(yǎng)基，待其凝固后再加蓋一層（約5 mL）SPS 培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后于36 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.4.4 改良方法2——培養(yǎng)基優(yōu)選

采用雙層培養(yǎng)基改良法，分別選擇低濃度、中濃度、高濃度標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液，應(yīng)用SPS 培養(yǎng)基和TSC培養(yǎng)基對(duì)人工污染水樣進(jìn)行檢測(cè)，各自計(jì)數(shù)黑色菌落，對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析比對(duì)。同時(shí)取無(wú)菌礦泉水，采用雙層培養(yǎng)基覆蓋改良法檢測(cè)作為空白對(duì)照。

1.4.5 確證試驗(yàn)

將可疑菌落接種于FTG 36 ℃培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)24 h，參照國(guó)標(biāo)法分別做革蘭氏染色鏡檢、硝酸鹽還原試驗(yàn)、牛奶發(fā)酵試驗(yàn)、卵磷脂分解試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 國(guó)標(biāo)法和改良法1的試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

改良方法1 和國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)礦泉水中產(chǎn)氣莢膜梭菌在SPS 培養(yǎng)基上的菌落特征見圖1。

圖1 產(chǎn)氣莢膜梭菌在SPS 培養(yǎng)基上的菌落特征Fig.1 Colony characteristics of Clostridium perfringens on SPS medium

由圖1 可知，國(guó)標(biāo)法濾膜上的菌落無(wú)黑色，采用雙層培養(yǎng)基覆蓋改良方法1 濾膜上有典型的黑色菌落，效果明顯。產(chǎn)氣莢膜梭菌在厭氧條件下能把TSC 和SPS 培養(yǎng)基中的亞硫酸鹽還原為硫化物，再與檸檬酸鐵銨反應(yīng)產(chǎn)生硫化鐵而使菌落呈黑色[7]。除產(chǎn)氣莢膜梭菌外，其它的梭狀芽孢桿菌則被添加的抗生素所抑制[8]，因此濾膜上的黑色菌落具有一定的特征性[9]。產(chǎn)氣莢膜梭菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)過(guò)程中，硫化物的產(chǎn)生和鐵離子的直接接觸是菌落呈現(xiàn)黑色的關(guān)鍵因素[10]。由此推測(cè)，國(guó)標(biāo)法因?yàn)闉V膜的阻隔使細(xì)菌不能直接接觸到培養(yǎng)基中的鐵離子，從而不能產(chǎn)生黑色的硫化鐵，故菌落不呈黑色。在濾膜上加蓋一層培養(yǎng)基后，目標(biāo)菌能和培養(yǎng)基充分接觸，因此能有效的避免上述情況，使平板上出現(xiàn)明顯的黑色菌落。當(dāng)濾膜上的目標(biāo)菌較多的時(shí)候，覆蓋第一層培養(yǎng)基的過(guò)程中可能會(huì)把部分濾膜上的產(chǎn)氣莢膜梭菌帶到培養(yǎng)基表面，使菌落不顯黑色或者黑色不明顯而影響計(jì)數(shù)結(jié)果。當(dāng)其凝固后濾膜上的產(chǎn)氣莢膜梭菌已固定在培養(yǎng)基里面或者表面，最后再加蓋一層培養(yǎng)基，這樣可以讓所有的產(chǎn)氣莢膜梭菌都完全在培養(yǎng)基里面，經(jīng)36 ℃厭氧培養(yǎng)后都能顯示明顯的黑色。

2.2 不同培養(yǎng)基的檢測(cè)結(jié)果比較

產(chǎn)氣莢膜梭菌在兩種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果見表1 和圖2。

表1 產(chǎn)氣莢膜梭菌在兩種培養(yǎng)基上的計(jì)數(shù)結(jié)果（，n=5）Table 1 Enumeration results of Clostridium perfringens on two media（，n=5）

表1 產(chǎn)氣莢膜梭菌在兩種培養(yǎng)基上的計(jì)數(shù)結(jié)果（，n=5）Table 1 Enumeration results of Clostridium perfringens on two media（，n=5）

菌濃度選擇 SPS 上黑色菌落數(shù) SPS 空白 TSC 上黑色菌落數(shù) TSC 空白低濃度 4±1 0 8±1 0中濃度 17±1 0 37±1 0高濃度 68±3 0 132±5 0

圖2 產(chǎn)氣莢膜梭菌在TSC 和SPS 兩種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果Fig.2 Growth counting results of Clostridium perfringens on two media of TSC and SPS

目前檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的選擇性培養(yǎng)基主要是TSC 和SPS，其中以TSC 最為常用，該培養(yǎng)基亦是美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)推薦用于分離產(chǎn)氣英膜梭菌的選擇性培養(yǎng)基[11]。采用雙層培養(yǎng)基覆蓋改良方法，產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌在TSC 平板和SPS 平板上均可形成典型的黑色菌落。同一水樣濾膜在TSC 平板上所形成的典型黑色菌落計(jì)數(shù)值高于SPS 平板上計(jì)數(shù)值，兩者間存在顯著性差異（P＜0.05）。由此推測(cè)，相比于SPS 培養(yǎng)基TSC 培養(yǎng)基更適合產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)。圖2 為產(chǎn)氣莢膜梭菌在TSC 和SPS 兩種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)計(jì)數(shù)情況。為了提高礦泉水中產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢出率，防止漏檢，建議使用TSC 培養(yǎng)基作為計(jì)數(shù)用的選擇性培養(yǎng)基。綜合兩種改良方法，我們認(rèn)為礦泉水中產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測(cè)方法可優(yōu)化為TSC 培養(yǎng)基代替SPS 培養(yǎng)基，再用雙層培養(yǎng)基加以覆蓋，能使試驗(yàn)現(xiàn)象更加明顯，計(jì)數(shù)效果更好，提高檢出率，盡量避免因方法原因帶來(lái)的漏檢。

2.3 確證試驗(yàn)結(jié)果

按照國(guó)標(biāo)方法，挑取濾膜上單個(gè)黑色可疑菌進(jìn)行確證試驗(yàn)，結(jié)果見表2、圖3～圖5。

表2 產(chǎn)氣莢膜梭菌確證試驗(yàn)結(jié)果及現(xiàn)象Table 2 Confirmatory test results and phenomena of Clostridium perfringens

圖3 產(chǎn)氣莢膜梭菌染色鏡檢和卵磷脂分解試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of microscopic examination and lecithin decomposition test of Clostridium perfringens

圖4 動(dòng)力硝酸鹽試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Dynamic nitrate test results

圖5 產(chǎn)氣莢膜梭菌牛奶分解試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of milk decomposition test of Clostridium perfringens

鏡檢可見該菌為革蘭氏陽(yáng)性粗大桿菌，偶見芽孢，硝酸鹽還原試驗(yàn)、卵磷脂分解試驗(yàn)和牛奶發(fā)酵試驗(yàn)均為陽(yáng)性。產(chǎn)氣莢膜梭菌能產(chǎn)卵磷脂酶分解卵黃平板中的卵磷脂，因此點(diǎn)種點(diǎn)周圍會(huì)出現(xiàn)乳白色的渾濁帶；且此菌無(wú)動(dòng)力，穿刺線不呈擴(kuò)散生長(zhǎng)，能還原硝酸鹽，培養(yǎng)基變紅色；產(chǎn)氣莢膜梭菌會(huì)發(fā)酵乳糖，凝固酪蛋白，呈“爆裂發(fā)酵”現(xiàn)象，培養(yǎng)基不變黑。此外，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與動(dòng)力硝酸鹽培養(yǎng)基相比，采用緩沖動(dòng)力硝酸鹽培養(yǎng)基進(jìn)行硝酸鹽還原試驗(yàn)，顯色反應(yīng)更快速，色差顯示更明顯。

3 討論

在實(shí)際工作中積累的一些經(jīng)驗(yàn)也有利于對(duì)檢測(cè)方法的準(zhǔn)確掌握和運(yùn)用。首先，當(dāng)樣品污染程度較高的時(shí)候，取樣過(guò)濾時(shí)，為了獲得較好的計(jì)數(shù)效果，可將原液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尅１M量使用新鮮配制的培養(yǎng)基，如果培養(yǎng)基在空氣中長(zhǎng)時(shí)間暴露，表面的氧化還原電勢(shì)下降，會(huì)影響厭氧菌的生長(zhǎng)發(fā)育，相關(guān)文獻(xiàn)也有類似的報(bào)道[12]。其次，TSC 培養(yǎng)基并非能抑制其他所有的雜菌，挑取可疑的黑色菌落接種至FTG 培養(yǎng)基培養(yǎng)后，若鏡檢發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液不純，則需將黑色菌落劃線至TSC 分離純化[13]，再挑取單個(gè)典型的黑色菌落接種至FTG 培養(yǎng)基，用于后續(xù)的確證試驗(yàn)。最后，在確證試驗(yàn)過(guò)程中，“爆裂發(fā)酵”現(xiàn)象與含鐵牛奶培養(yǎng)基的配制方式有一定的相關(guān)性，經(jīng)高溫高壓滅菌的培養(yǎng)基的試驗(yàn)效果沒有煮沸滅菌法配制的含鐵牛奶培養(yǎng)基效果佳，這可能是由于在高溫高壓下部分牛奶會(huì)出現(xiàn)變性而影響牛奶發(fā)酵試驗(yàn)的效果。分別采用動(dòng)力硝酸鹽培養(yǎng)基和緩沖動(dòng)力硝酸鹽培養(yǎng)基進(jìn)行硝酸鹽還原試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論是顏色的辨識(shí)度還是顯色速度都是緩沖動(dòng)力硝酸鹽培養(yǎng)基優(yōu)于動(dòng)力硝酸鹽培養(yǎng)基，因此建議用緩沖動(dòng)力硝酸鹽培養(yǎng)基代替動(dòng)力硝酸鹽培養(yǎng)基做硝酸鹽還原試驗(yàn)。

本文從檢測(cè)方法完善和培養(yǎng)基優(yōu)選兩方面對(duì)礦泉水中產(chǎn)氣莢膜梭菌濾膜檢測(cè)國(guó)標(biāo)法進(jìn)行改良，用新鮮配制的TSC 培養(yǎng)基經(jīng)雙層培養(yǎng)基覆蓋改良后的方法檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌，現(xiàn)象更明顯，結(jié)果更可靠，更適合飲用天然礦泉水中產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢驗(yàn)。提高了飲用礦泉水中產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)的準(zhǔn)確性。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，微生物的鑒定手段更加多樣，有條件的實(shí)驗(yàn)室也可以同步采用全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法進(jìn)行鑒定[14-16]，結(jié)合對(duì)傳統(tǒng)檢測(cè)方法的改進(jìn)，必將進(jìn)一步提高產(chǎn)氣莢膜梭菌鑒定結(jié)果的高效性和準(zhǔn)確性。