RT-PCR結(jié)合高分辨率熔解曲線對兩種致病菌的快速檢測

姚艷玲

（嘉興市食品藥品檢驗(yàn)檢測院，浙江嘉興314050）

近年來，生食海產(chǎn)品、果蔬沙拉、水果飲料等現(xiàn)制現(xiàn)售即食類食品因其鮮嫩的口感、豐富的營養(yǎng)在餐桌上頻頻出現(xiàn)，且備受歡迎。但由于其未經(jīng)熟制加工，存在致病菌污染風(fēng)險(xiǎn)。而金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌是肉類、奶類、果蔬等食品中常見的污染致病菌，易感人群尤其容易感染[1-2]。其中金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素能引起食物中毒[3]，據(jù)報(bào)道，每100 g食物中含有不足18 μg 的腸毒素便能引起金黃色葡萄球菌食物中毒癥狀[4]；而單核增生李斯特氏菌廣泛存在于土壤、人和動物的糞便中，容易污染食品，引起食物中毒的致病因子為李氏溶血素和內(nèi)化素[5]。有報(bào)道顯示，金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌等致病菌在奶類、肉類、鮮切蔬菜等產(chǎn)品中均有不同程度的檢出[6-10]。而現(xiàn)制現(xiàn)售類食品由于涉及原料種類繁多，制作過程、銷售形式和食用方式具有多樣性，因此對微生物的控制則顯得更加重要。傳統(tǒng)的微生物檢測方法大都需要經(jīng)過增菌、分離、純化和鑒定等步驟，過程繁瑣，耗時(shí)較長，對現(xiàn)制現(xiàn)售類食品的微生物情況不能作出迅速反應(yīng)。因此，開展致病菌快速檢測方法的研究，是食品安全檢測的一個重要方向。

目前，針對金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌的檢測方法多集中于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法（polymerase chain reaction，PCR）[11-13]和實(shí)時(shí)熒光 PCR（realtime polymerase chain reaction，RT-PCR）的檢測方法[14-16]，而利用PCR 技術(shù)結(jié)合高分辨率熔解曲線（high-resolution melting curve，HRM）的多重檢測報(bào)道則較少。因此，本試驗(yàn)以現(xiàn)制現(xiàn)售的果蔬飲料為樣本，采用實(shí)時(shí)熒光PCR 結(jié)合高分辨率熔解曲線分析方法，建立快速檢測食品中金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌的多重方法體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

試驗(yàn)采用的菌株均采購自美國菌種保藏中心（american type conservation center，ATCC），如表 1 所示。

表1 菌株名稱及編號Table 1 Name and number of the bacteria

1.1.2 主要試劑

緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；LightCycler 480 高分辨率熔解分析預(yù)混液：羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.1.3 引物

查閱標(biāo)準(zhǔn)，參考SN/T 1689-2007《食品中多種致病菌快速檢測方法PCR 法》標(biāo)準(zhǔn)中列出的引物序列，見表2，所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.4 主要儀器

LightCycler 480-Ⅱ熒光定量PCR 儀：羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；MK-10 干式恒溫器：杭州奧盛儀器有限公司；Legend Micro 21R 冷凍離心機(jī)：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；XK96-A 快速混勻器：江蘇新康醫(yī)療器械有限公司；NanoDrop OneC超微量分光光度計(jì)：賽默飛世爾科技公司；SPX-400-Ⅱ生化培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

表2 兩種致病菌的引物序列Table 2 Primers of 2 pathogenic bacteria

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣本制作及DNA 模板提取

將目標(biāo)菌人工接種于果蔬汁樣本中，作為原始試驗(yàn)樣本，并進(jìn)行梯度稀釋。36 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)過程中每隔一定時(shí)間進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。培養(yǎng)完成后，吸取1 mL 樣液到1.5 mL 滅菌離心管中，12 000 r/min 離心5 min，棄上清液；隨后加入50 μL 滅菌蒸餾水，并用快速混勻器混勻，放入100 ℃干式恒溫器中裂解10 min，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液于另一滅菌離心管中，該溶液即為DNA 提取液，同時(shí)測定DNA 模板濃度及純度。吸取上清液時(shí)注意不要吸到底部沉淀物。

1.2.2 RT-PCR 體系的建立

根據(jù)LightCycler 480 High Resolution Melting Mas ter 試劑盒說明書，配置 20 μL 的 PCR 反應(yīng)體系，其中包含 10 μL Master Mix（2×conc.），1μL 上游引物（4 μmol/L），1μL 下游引物 （4 μmol/L），2 μL MgCl2（25 mmol/L），5 μL DNA（樣品以目標(biāo)菌 DNA 為模板，對照以無菌去離子水為模板）。

反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；以95 ℃變性10 s，58 ℃退火 15 s，72 ℃延生 15 s，擴(kuò)增 40 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物隨后進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，熔解程序?yàn)椋?5 ℃ 1min，40 ℃ 1 min，65 ℃ 1 s；然后升溫至 95 ℃（此時(shí)熔解速率為0.01 ℃/s），最后40 ℃冷卻。

1.2.3 RT-PCR 反應(yīng)特異性

在RT-PCR 反應(yīng)體系建立的基礎(chǔ)上，混合表1 所示的5 種常見致病菌的DNA 模板，分別對金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌進(jìn)行了特異性試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣本的培養(yǎng)及DNA模板測定

人工接種兩種目標(biāo)菌的樣本在BPW 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，按 10 倍梯度稀釋成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的培養(yǎng)液，分別在 0、3、6 、24 h 進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，選取原始試驗(yàn)樣本在0 h 時(shí)平板計(jì)數(shù)結(jié)果數(shù)量級為102的樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，此時(shí)的金黃色葡萄球菌稀釋梯度為10-5，單核增生李斯特氏菌的稀釋梯度為10-6，結(jié)果見表3。

表3 樣本中兩種致病菌的平板計(jì)數(shù)Table 3 The content of 2 pathogenic bacteria in samples

由表3 可知，金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌在BPW 培養(yǎng)液中均能有效繁殖，且呈現(xiàn)相似的生長速率，因此試驗(yàn)采用的BPW 培養(yǎng)液能應(yīng)用于實(shí)際樣品。試驗(yàn)按1.2.1 方法對制作的原始樣本液進(jìn)行DNA 提取，并測定其濃度及純度。檢測結(jié)果顯示，含金黃色葡萄球菌樣本的DNA 濃度為12.3 μg/mL，純度范圍為1.67～1.86，含單核增生李斯特氏菌的DNA 濃度為 19.7 μg/mL，純度范圍為 1.75～1.82，均能滿足 PCR試驗(yàn)要求。

2.2 RT-PCR方法的建立

在RT-PCR 反應(yīng)時(shí)，由于引物長度不同、堿基不同，因此退火溫度對兩種菌的檢測影響較大。針對以上兩種目標(biāo)菌的退火溫度，在55 ℃～60 ℃范圍內(nèi)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果表明，在55 ℃～59 ℃金黃色葡萄球菌能有效擴(kuò)增，58 ℃～59 ℃時(shí)單核增生李斯特氏菌能有效擴(kuò)增，且非特異性擴(kuò)增均不明顯。雖然單重試驗(yàn)時(shí)，退火溫度在58 ℃和59 ℃時(shí)兩種菌均能擴(kuò)增，但結(jié)合熔解曲線分析，發(fā)現(xiàn)58 ℃時(shí)擴(kuò)增效果更好，因此建立方法時(shí)選取58 ℃作為退火溫度，DNA 濃度稀釋10 倍時(shí)的結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 DNA 濃度稀釋10 倍時(shí)金黃色葡萄球菌熔解曲線峰Fig.1 The HRM peak of Staphylococcus aureus at the DNA concentration of 10-1

圖2 DNA 濃度稀釋10 倍時(shí)單核增生李斯特氏菌熔解曲線峰Fig.2 The HRM peak of Listeria monocytogenes at the DNA concentration of 10-1

把2.1 制備的兩種目標(biāo)菌的DNA 溶液進(jìn)行梯度稀釋，分別稀釋至原來濃度的 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，按建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增，并計(jì)算兩種目標(biāo)菌的平均Tm 值，結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌的Tm 值為77.05 ℃，最大偏差為0.51 ℃；單核增生李斯特氏菌的Tm 值為79.39 ℃，最大偏差為 0.46 ℃。由圖1、圖 2 可見，兩種目標(biāo)菌的熔解曲線峰型均較好，且無非特異性熔解峰，因此退火溫度選取58 ℃時(shí)，該方法針對兩種致病菌能進(jìn)行有效地定性分析。

2.3 雙重RT-PCR試驗(yàn)

試驗(yàn)在做雙重反應(yīng)時(shí)，將兩種目標(biāo)菌的原始DNA提取液經(jīng)適度稀釋后，按等比例混合，制成混合模板，然后將混合模板按10 倍比例梯度稀釋。PCR 反應(yīng)體系中同時(shí)加入兩種目標(biāo)菌的引物及DNA 混合模板，按1.2.2 配制反應(yīng)體系，不足20 μL 用無菌去離子水補(bǔ)足。然后按2.2 方法條件進(jìn)行雙重試驗(yàn)，PCR 擴(kuò)增曲線結(jié)果見圖3。

圖3 雙重試驗(yàn)的擴(kuò)增曲線Fig.3 The RT-PCR curve of duplex reaction

在雙重試驗(yàn)中，也比較了58 ℃和59 ℃兩種退火溫度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，退火溫度為59 ℃時(shí)，單核增生李斯特氏菌擴(kuò)增較好，且熔解曲線峰明顯，但金黃色葡萄球菌擴(kuò)增效果不理想，熔解曲線峰型較小，與單核增生李斯特氏菌區(qū)分不明顯，存在交叉區(qū)域；而當(dāng)退火溫度設(shè)置為58 ℃時(shí)，兩者均得到有效擴(kuò)增，且熔解曲線峰能徹底分開。

雙重試驗(yàn)的高分辨率熔解曲線圖見圖4、圖5。

圖4 雙重試驗(yàn)的高分辨率熔解曲線圖Fig.4 The HRM of duplex reaction

圖5 雙重試驗(yàn)的熔解曲線峰Fig.5 The HRM peaks of duplex reaction

由此推測，在雙重試驗(yàn)時(shí)兩種目標(biāo)菌的擴(kuò)增存在競爭，不同退火溫度下競爭效果不同，試驗(yàn)結(jié)果顯示，退火溫度設(shè)置為58 ℃時(shí)，混合體系能實(shí)現(xiàn)最優(yōu)擴(kuò)增。

由圖3～圖5 可知，退火溫度設(shè)置為58 ℃時(shí)雙重試驗(yàn)效果較為理想，金黃色葡萄球菌的Tm 值范圍為76.72 ℃～76.90 ℃，單核增生李斯特氏菌的Tm 值范圍為 79.54 ℃～79.85 ℃，與 2.1 結(jié)果相符，均在偏差范圍內(nèi)。因此，試驗(yàn)建立的雙重試驗(yàn)方法，擴(kuò)增時(shí)退火溫度選擇58 ℃，能同時(shí)對兩種目標(biāo)菌進(jìn)行定性分析。此時(shí)，金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌的檢測靈敏度分別達(dá)到 2.29×10-3、2.08×10-2μg/mL；按平板計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算，金黃色葡萄球菌檢測靈敏度達(dá)到102CFU/g，單核增生李斯特氏菌的檢測靈敏度達(dá)到103CFU/g。

試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，在雙重反應(yīng)中利用高分辨率熔解曲線進(jìn)行分析時(shí)，采用高飽和染料比SYBR GREEN 效果好，熒光信號采集更為靈敏；另外，熔解速率對試驗(yàn)影響也較大，溫度分辨率越高越好，本試驗(yàn)在設(shè)定熔解速率為0.01 ℃/s 時(shí)，2 種目標(biāo)菌的熔解曲線峰徹底分開。

2.4 RT-PCR反應(yīng)體系中引物的特異性

在特異性反應(yīng)試驗(yàn)時(shí)，混合表1 中5 種致病菌的DNA 模板，分別對2 組引物進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果見圖6。

圖6 2 種致病菌的高分辨率熔解曲線峰Fig.6 The HRM peaks of 2 pathogenic bacteria

由圖6 可知，兩種目標(biāo)菌均能很好地?cái)U(kuò)增，未受其他菌的干擾，金黃色葡萄球菌和單核增生李斯特氏菌的Tm 值分別為76.67、79.68 ℃，與2.2 試驗(yàn)中偏差范圍相符。由此可見，該反應(yīng)體系中2 種目標(biāo)菌的引物均具有較好的特異性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了RT-PCR 結(jié)合高分辨率熔解曲線對金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌的雙重檢測方法。試驗(yàn)通過對退火溫度的比較，確定雙重試驗(yàn)的退火溫度為58 ℃，這時(shí)的檢測靈敏度分別可以達(dá)到金黃色葡萄球菌102CFU/g，單核增生李斯特氏菌103CFU/g。兩種目標(biāo)菌的Tm 值分別為金黃色葡萄球菌77.05 ℃，單核增生李斯特氏菌79.39 ℃。試驗(yàn)采用直接提取法提取樣品中的DNA，其操作簡單，提取時(shí)間短，DNA 純度范圍均在1.6～1.9 之間，能滿足PCR 檢測要求。通過雙重檢測方法體系的建立，針對以上兩種致病菌，檢驗(yàn)過程簡單方便，與常規(guī)微生物檢測方法比較，大大提高了檢測時(shí)效性，且該方法的靈敏度、特異性均滿足要求，為實(shí)現(xiàn)餐飲食品中微生物的快速篩選提供參考。

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)體系建立時(shí)，退火溫度至關(guān)重要，根據(jù)目標(biāo)菌的特性適當(dāng)調(diào)整退火溫度，使得在相同退火溫度等PCR 參數(shù)條件下實(shí)現(xiàn)多重檢測的目的。另外，在做高分辨率熔解曲線時(shí)，采用高飽和染料在多重試驗(yàn)中有更好的應(yīng)用，且試驗(yàn)條件中熔解速率較為關(guān)鍵，本試驗(yàn)經(jīng)比較，最終確定熔解速率為0.01 ℃/s，在該條件下，熒光信號采集較為靈敏，能很好地利用高分辨率熔解曲線進(jìn)行定性分析。由此可知，在做高分辨率曲線時(shí)，高飽和染料、溫度分辨率等條件是影響試驗(yàn)結(jié)果的主要因素。