滇產(chǎn)紅花的高效液相指紋圖譜研究

吳晶，楊懷鏡，周萍

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000；2.大理白族自治州食品藥品檢驗所，云南大理671000）

紅花為菊科植物紅花（Carthamus tinctorius L.）的干燥管狀花[1]，又名次紅、紅藍(lán)花、紅花菜、紅花草等，紅花的種植歷史悠久，在我國新疆、浙江、云南、河南等地均有種植。紅花傳入我國中原地區(qū)的時間大約在漢武帝時代張騫出使西域，最開始紅花只被人們用來作為染料，后來才被運(yùn)用到藥物中，至今紅花引入我國作為藥用、食用、栽培已有2100 多年的歷史[2-3]，紅花現(xiàn)已被應(yīng)用到食品、藥品和保健品等各個領(lǐng)域。紅花的化學(xué)成分主要有黃酮類、生物堿類、木脂素類、脂肪酸類和多糖類等，且很多成分的藥理作用已經(jīng)明確。紅花現(xiàn)代臨床應(yīng)用主要有活血化瘀，通經(jīng)止痛；紅花主要有抗凝血、抗血栓形成，興奮心臟，增加冠狀動脈血流量和降低冠狀動脈阻力，增加心肌營養(yǎng)性，擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)，降低血壓及調(diào)節(jié)血脂，對抗炎性因子，興奮子宮，耐缺氧，保肝，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫的免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤等作用[4-9]。由于其豐富的藥理作用，紅花現(xiàn)已成為一種藥食同用的保健品，但是目前的中藥市場魚龍混雜，各種紅花價格不一，且沒有比較標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量控制方法，紅花的質(zhì)量還是令人堪憂，因此有必要對紅花藥材的質(zhì)量進(jìn)行控制。

目前指紋圖譜被用來對中藥材的質(zhì)量控制進(jìn)行評價，建立中藥指紋圖譜將能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而對中藥材質(zhì)量進(jìn)行整體的描述和評價。紅花的色素是從紅花的管狀花中提取的色素，其中羥基紅花黃色素A 是紅花的主要有效成分[10-18]，由多種查耳酮類化合物組成，現(xiàn)代藥理研究表明，紅花黃色素具有擴(kuò)張血管、改善心肌供血、抑制血小板聚集、抑制血栓形成、抗血栓、降血脂、抗氧化等功能[19-22]。為了有效地控制紅花黃色素的質(zhì)量，實驗采用高效液相（high performance liquid chromatography，HPLC）方法，建立紅花藥材的指紋圖譜分析方法，為其質(zhì)量評價提供一定的參考信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

紅花樣品：采集于云南大理和麗江2 個城市的多個不同地方，共25 批，均經(jīng)大理白族自治州食品藥品檢驗所楊懷鏡主任藥師鑒定為菊科植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花，憑證標(biāo)本放于大理白族自治州食品藥品檢驗所標(biāo)本室，樣品自然陰干后粉碎，放入干燥容器中于室溫（25 ℃）下避光保存，樣品信息見表1。

表1 紅花樣品信息Table 1 Safflower sample information

1.1.2 試劑

羥基紅花黃色素A 對照品（批號111637-201810，ID：5QEY-4UAQ，純度≥93.1%）：中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：上海優(yōu)試化工有限公司；磷酸（分析純）：浙江建德化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100 高效液相色譜儀、AgilentZORBOXC18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱：美國安捷倫科技有限公司；色譜柱：Waters SymmetryR-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm） 色譜柱、Waters XSELECETTMGSHTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱：沃特世科技公司；UltimateRXB-C18（GD）（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱：月旭科技上海有限公司；XSE205 十萬分之一電子分析天平：美國梅特勒公司；360W1519-6 型雙頻超聲清洗機(jī)：廣東省梅州市固特科技園；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的制備

供試品溶液的制備：稱取過3 號篩（50 目）的紅花粉末約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，用移液管精密加入25%的甲醇50 mL，精密稱定質(zhì)量，然后超聲處理（功率 300 W，頻率 50 kHz）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用25%的甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，用0.45 μm 的有機(jī)微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

羥基紅花黃色素A 對照品的制備：精密稱取羥基紅花黃色素A 對照品適量于100 mL 的容量瓶中，用25%的甲醇定容稀釋至刻度，得到濃度為22.22 μg/mL羥基紅花黃色素A 對照品溶液。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Waters SymmetryR-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：254 nm；流動相：甲醇-0.4%磷酸水溶液；柱溫 30 ℃；流速 1.0 mL/min，進(jìn)樣 10 μL。梯度洗脫程序如表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure

1.4 最佳提取方法的確定

1.4.1 提取方法的考察

水浴回流提取：取過3 號篩的紅花粉末約0.4 g，精密稱取，置于具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇溶液50 mL，然后稱定質(zhì)量，置于水浴上回流提取40 min后迅速冷卻，稱定質(zhì)量，補(bǔ)重，搖勻，濾過，用0.45 μm的微孔濾膜過濾后，即得供試品溶液。

超聲提取法：取過3 號篩的紅花供試品粉末約0.4 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇溶液50 mL，然后稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率 50 kHz）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，補(bǔ)重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用0.45 μm 的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

1.4.2 參照物的選擇

2015 年版《中華人民共和國藥典》對紅花中山奈素和羥基紅花黃色素A 的含量進(jìn)行了測定，山奈素和羥基紅花黃色素A 的性質(zhì)穩(wěn)定，謝國祥等[23]以羥基紅花黃色素A 為參照，建立了10 個省紅花的指紋圖譜獲得34 個共有峰。周曉英等[24]以山奈素為參照物，建立了10 批紅花的指紋圖譜。

1.4.3 提取溶劑的考察

根據(jù)文獻(xiàn)報道紅花藥材中含有酚酸類、黃酮類和生物堿等化合物，其極性較強(qiáng)，因此試驗考察了不同濃度甲醇對圖譜的影響，甲醇的濃度分別為15%、25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%、100%，試驗提取方法采用超聲提取法。

1.4.4 超聲時間的考察

試驗考察了超聲時間對樣品信息的影響，分別超聲 20、30、40、50、60 min 后，在其他條件與“1.3.1”相同的條件下，按“1.3.2”項下的色譜條件進(jìn)行測定。

1.4.5 檢測波長的選擇

本試驗分別對同一份樣品在 214、254、274、303、330、360、390、403 nm 波長下進(jìn)行測定，在其他條件與“1.3.1”相同的條件下，按“1.3.2”項下的色譜條件進(jìn)行測定，并記錄了各波長下的圖譜。

1.4.6 流動相和梯度洗脫程序的優(yōu)選

考察甲醇-0.4%的磷酸水溶液，甲醇-0.7%的磷酸水溶液，甲醇-水，乙腈-0.01%三氟乙酸溶液，乙腈-0.02%的磷酸水溶液等5 個流動相，觀察比較各個流動相下色譜圖的變化，記錄紅花藥材HPLC 圖譜，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化梯度洗脫程序。

1.4.7 色譜柱的選擇

考察WatersSymmetryR-C18（150mm×4.6mm，5μm）；AgilentZORBOX-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；UltimateRXB-C18（GD）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Waters XSELECETTMGSHTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）4 個不同廠家的色譜柱，分析比較不同色譜柱分離色譜峰對同一樣品的分離情況。

1.4.8 柱溫的考察

同一份樣品按“1.3.1”項下的方法制備供試品溶液，在“1.3.2”的色譜條件下進(jìn)行測定，柱溫分別為20、25、30、35 ℃時所得樣品色譜峰的分離效果。

1.5 紅花HPLC指紋圖譜系統(tǒng)適用性試驗

1.5.1 方法學(xué)考察與說明

按“1.3.1”項下的方法，分別制備25 批云南紅花藥材的供試品溶液，在“1.3.2”的色譜條件下進(jìn)行測定，并記錄分析HPLC 色譜圖。羥基紅花黃色素A 為紅花水溶性成分藥理功效的主要活性之一，是檢驗紅花質(zhì)量的指標(biāo)性成分，在梯度洗脫的過程中，羥基紅花黃色素A 的峰比較突出明顯，且在色譜峰中間位置出峰，性質(zhì)較為穩(wěn)定，因此，選擇羥基紅花黃色素A 作為其他特征峰的參考峰。參考峰的標(biāo)號為S。

1.5.2 精密度試驗

稱取S2 紅花樣品0.4 g，精密稱定，按“1.3.1”項下的方法制備供試品溶液，按“1.3.2”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄相應(yīng)的HPLC 圖譜。

1.5.3 穩(wěn)定性試驗

稱取S2 的紅花樣品0.4 g，精密稱定，按“1.3.1”項下方法制備供試品溶液，室溫（25 ℃）下自然放置0、2、4、8、16、24 h，按“1.3.2”下的色譜條件進(jìn)行測定。

1.5.4 重復(fù)性試驗

取S2 號樣品6 份，按“1.3.1”項下方法制備供試品溶液，在“1.3.2”項下的色譜條件進(jìn)行測定，測定峰面積值。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的考察

采用水浴回流提取和超聲提取法制備的供試品進(jìn)行HPLC 測定，結(jié)果表明，超聲提取法樣品色譜峰信息量多，分離度良好，靈敏度高。

2.2 提取溶劑的考察

采用超聲提取的方法制備供試品溶液，按“1.3.2”項下的方法進(jìn)行測定，記錄下色譜圖信息，不同濃度提取溶劑的HPLC 色譜圖如圖1 所示。

圖1 不同提取溶劑所得色譜圖Fig.1 Chromatogram obtained from different extraction solvents

對比所得圖譜發(fā)現(xiàn)，用水作為提取溶劑時，樣品色譜峰數(shù)量較少，而不同濃度的甲醇則相對于水所得色譜峰要多，但不同濃度的甲醇對色譜峰影響有所差別，綜合考慮，選擇25%的甲醇作為提取溶劑。

2.3 超聲時間的考察

按“1.3.2”項下的色譜條件進(jìn)行測定，不同超聲時間所得的色譜圖如圖2。

由圖 2 可知，超聲 20、30、40、50、60 min 所得的色譜圖中峰的數(shù)量基本無差異，但超聲40 min 所得的色譜圖，各色譜峰分離效果較好，分離度較高，因此選擇超聲40 min 提取。

2.4 檢測波長的選擇

同一供試品溶液在不同波長下所得的色譜圖如圖3 所示。

通過色譜圖比較，樣品在 214、254、274 nm 波長處所得色譜圖中具有較多的色譜峰，而在303、330、360、390、403 nm 波長下所得的色譜峰較少。在254 nm 波長下所得圖譜基線平滑，色譜峰數(shù)目多，信息量大，且分離度良好。因此，選擇254 nm 作為波長。

圖2 不同超聲時間對色譜圖的影響Fig.2 Influence of different ultrasonic time on chromatogram

圖3 不同波長條件下同一樣品所得色譜圖Fig.3 Chromatogram of the same sample at different wavelengths

2.5 流動相的選擇與梯度洗脫程序的優(yōu)化

觀察比較了甲醇-0.4%的磷酸水溶液，甲醇-0.7%的磷酸水溶液，甲醇-水，乙腈-0.01%三氟乙酸溶液，乙腈-0.02%的磷酸水溶液等5 個流動相所得圖譜，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 不同流動相所得色譜圖Fig.4 Chromatogram obtained from different mobile phases

甲醇-0.4%的磷酸水溶液作為流動相時，色譜圖中各色譜峰分離度較高，色譜峰數(shù)量較多。因此為了記錄分離滇紅花藥材中更多的化學(xué)成分信息，采用甲醇-0.4%磷酸水溶液作為流動相。

2.6 色譜柱的考察

分析比較不同色譜柱分離色譜峰對同一樣品的分離情況，結(jié)果表明沃特世科技公司的色譜柱Waters SymmetryR-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）分離效果較好樣品色譜峰信息豐富，因此選擇Waters SymmetryRC18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱。

2.7 柱溫的考察

在相同色譜條件下，同一樣品不同柱溫所得HPLC 色譜圖見圖5。

圖5 不同柱溫對同一樣品色譜圖的影響Fig.5 Effect of different column temperatures on chromatogram of the same sample

結(jié)果表明，柱溫對樣品的保留時間對45 min 后的分離效果有影響，且隨著柱溫的升高，樣品中色譜峰保留時間提前，30 ℃時樣品分離效果較好，色譜峰數(shù)較多，保留時間居中，綜合考慮色譜柱的壽命，實驗采用30 ℃作為柱溫。

2.8 方法學(xué)考察結(jié)果

2.8.1 系統(tǒng)適用性實驗

按“1.3.1”項下的方法制備對照品溶液和S2 樣品溶液，按“1.3.2”色譜條件進(jìn)樣測定，得特征峰，對照品溶液和S2 樣品溶液色譜圖見圖6、圖7。

供試品溶液中羥基紅花黃色素A 與其他成分峰分離良好，無干擾。

2.8.2 精密度考察

以羥基紅花黃色素A 的保留時間和峰面積作為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，精密度試驗結(jié)果見表3～表4。

圖6 對照品色譜圖Fig.6 Control standard chromatogram

圖7 紅花樣品色譜圖Fig.7 Chromatogram of safflower samples

表3 以羥基紅花黃色素A 的保留時間為參照的精密度試驗結(jié)果Table 3 Precision test results with reference to retention time of hydroxysafflor yellow A

表4 以羥基紅花黃色素A 的峰面積為參照的精密度試驗結(jié)果Table 4 Precision test results with reference to the peak area of hydroxysafflor yellow A

由表結(jié)果發(fā)現(xiàn)，連續(xù)6 次進(jìn)樣所得共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.8.3 穩(wěn)定性試驗考察

吸取供試品溶液按“1.3.2”色譜條件，分別在0、2、4、8、16、24 h 進(jìn)樣分析測定，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表5 和表6。

表5 以羥基紅花黃色素A 的保留時間為參照的穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 5 Stability test results with reference to retention time of hydroxysafflor yellow A

由結(jié)果數(shù)據(jù)可知，結(jié)果各共有峰的相對保留時間和相對峰面積相對穩(wěn)定RSD 均小于3.0%，結(jié)果表明，紅花供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

表6 以羥基紅花黃色素A 的峰面積為參照的穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 6 Stability test results based on peak area of hydroxysafflor yellow A

2.8.4 重復(fù)性試驗考察

取同一份供試品（S2 樣品）6 份，按“1.3.1”項下的方法制備供試品溶液，按“1.3.2”色譜條件進(jìn)樣，以羥基紅花黃色素A 的保留時間和峰面積為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果14 個共有峰的相對保留時間和相對峰面積穩(wěn)定，RSD 均小于3.0%，結(jié)果表明該方法的穩(wěn)定性良好。結(jié)果見表7～表8。

表7 以羥基紅花黃色素A 的保留時間為參照的重復(fù)性試驗結(jié)果Table 7 Repeatability test results with reference to the retention time of hydroxysafflor yellow A

表8 以羥基紅花黃色素A 的峰面積為參照的重復(fù)性試驗結(jié)果Table 8 Repeatability test results with reference to the peak area of hydroxysafflor yellow A

2.9 滇產(chǎn)紅花HPLC指紋的建立

將25 批紅花樣品供試品溶液按“1.3.2”項下色譜條件進(jìn)樣10 μL，得到25 批紅花的HPLC 指紋圖譜，如圖6。得到的圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2.0 版），對25 批云南紅花藥材指紋圖譜分析，以S2 樣品為參照圖譜，自動匹配得到14 個共有峰，生成紅花的對照圖譜，見圖8。

圖8 25 批云南紅花樣品HPLC 色譜圖Fig.8 25 batches of HPLC chromatograms of safflower samples from Yunnan

圖9 紅花共有模式HPLC 圖譜Fig.9 HPLC map of safflower common pattern

紅花樣品在該色譜條件下，62 min 內(nèi)紅花所有成分的色譜峰全部出現(xiàn)，且色譜峰分離效果較好，羥基紅花黃色素A 的保留時間在該色譜條件下為34.25 min，處于色譜峰的中間位置，以羥基紅花黃色素A 色譜峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和峰面積，結(jié)果見表9、表10。

表9 25 批紅花藥材共有峰相對保留時間RSDTable 9 Total peak relative retention time RSD of 25 batches of safflower medicinal materials

表10 25 批紅花藥材共有峰峰面積的RSDTable 10 RSD of total peak-to-peak area of 25 batches of safflower medicinal materials

由表可知，不同產(chǎn)地紅花藥材HPLC 指紋圖譜的多個共有峰的相對保留時間基本相同，25 批紅花相對保留時間的RSD 均在3.0%以下表明多個產(chǎn)地紅花藥材所含主要成分一致。而相對峰面積的RSD 差異較大，表明每個產(chǎn)地藥材所含成分含量不同。

將25 批紅花樣品與生成的對照圖譜進(jìn)行比較，計算其相似度。結(jié)果見表11。

表11 25 批紅花藥材指紋圖譜相似度結(jié)果Table 11 Results of similarity of fingerprints of 25 batches of safflower medicinal materials

結(jié)果顯示，25 批云南紅花藥材與對照圖譜進(jìn)行比較，所得相似度均大于0.9，符合指紋圖譜研究要求。表明25 批紅花藥材的質(zhì)量相對穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本試驗建立了紅花藥材HPLC 指紋圖譜，通過方法學(xué)考察驗證，該方法穩(wěn)定性好，操作簡捷，特征明顯。25 批紅花指紋圖譜自動匹配14 個共有峰，基本特征一致，所得指紋圖譜為云南紅花藥材的鑒別提供了相對全面的信息，可作為藥材真?zhèn)舞b別的標(biāo)準(zhǔn)，具有一定的參考價值。

由相似度結(jié)果表明個產(chǎn)地紅花藥材有一定的差異，可能與土壤pH 值、氣候和光照等地理因素有關(guān)，也可能因為紅花藥材的采集時間，采集方式和儲存條件等的影響，具體的原因有待進(jìn)一步考察。