PCR-DGGE技術(shù)檢測速凍餃子餡料中微生物區(qū)系

游新俠，賈慶超，劉曉華，張杰

（鄭州科技學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，河南鄭州450064）

速凍食品又稱急凍食品，是一種以低溫快速凍結(jié)方式生產(chǎn)的食品，是指在強冷的環(huán)境下，在15 min 左右完成凍結(jié)過程，使其在-18 ℃或更低溫度條件下貯藏運輸、長期保存的食品，能最大限度保持食品本身的色澤風(fēng)味及營養(yǎng)成分，但是在生產(chǎn)、運輸和貯藏過程中微生物的生長繁殖，一直是困擾冷卻肉發(fā)展的關(guān)鍵問題之一[1]。速凍食品將成為世界上發(fā)展最快的食品，其銷售量在發(fā)達(dá)國家將占全部食品的60%～70%。隨著人民生活水平的提高，對食品的衛(wèi)生、營養(yǎng)、保鮮和方便性等方面的追求，速凍食品的發(fā)展前景十分廣闊[2]。

速凍餃子的組成主要包括餡料和面皮兩部分。餡料組成較為復(fù)雜，可由肉類、禽類、蛋類、水產(chǎn)品、蔬菜及調(diào)味品等一種或多種配料為餡料。速凍餃子為生制品，比較適合微生物（尤其是腐敗菌和致病菌）的生長繁殖。在實際生產(chǎn)加工中，從生產(chǎn)車間到冷凍車間，從運輸?shù)绞袌觯俚较M者購買的整個過程，都會出現(xiàn)溫度的波動從而導(dǎo)致水餃中微生物的變化以致影響產(chǎn)品的品質(zhì)[3]。因此，對速凍餃子冷凍前菌系結(jié)構(gòu)的分析，為后續(xù)食品衛(wèi)生安全的加工、保藏條件等提供參考。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

速凍餃子：市售。

1.2 儀器

SX500 滅菌鍋：日本 TOMY 公司；BCD-221 冰箱：河南新飛電器集團有限公司；DT200A 電子天平：江蘇常熟市長青儀器儀表廠；SW-C7-LCU 潔凈工作臺：博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；QL-861 漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DRP-9052 電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；303A-2 電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；EMF2116MS1 微波爐：合肥榮事達(dá)三洋電器股份有限公司；HYG-A 全溫?fù)u瓶柜：太倉市豪成實驗儀器制造有限公司；Biometra PCR 儀：德國 Biometra 公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；XRS+凝膠成像系統(tǒng)ChemiDoc：美國Bio-Rad 生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；LX-200 迷你離心機：海門市其林貝爾儀器；NIKOU E100顯微鏡：北京冠普佳有限公司；MIKRO 22R 臺式離心機：德國Hettich 公司。

1.3 試劑

1.3.1 試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（BR）：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉（AR）：鄭州化學(xué)試劑一廠；蛋白胨（BR）：上海市松江區(qū)香閔路；牛肉浸膏（BR）：上海市奶公司第九牧場；革蘭氏染色試劑盒（BR）：四川省邁克科技有限責(zé)任公司；2×Taq Master Mix（Dye）（AR）、DM2000 DNA Marker（AR）：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；6×Loading Buffer（AR）：北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖（AR）：美國英杰生命技術(shù)有限公司；冰凍無水乙醇（CP）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；EDTA（AR）：北京鵬彩精細(xì)化工有限公司；蛋白酶K（初始酶活30 U/mg）、溶菌酶（初始酶活 40 000 U/mg）：美國 Sigma公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、Tris 飽和酚（AR）：北京索萊寶科技有限公司。

1.3.2 試液的配制

Tris-EDTA（TE）溶液：取 1 mol/L Tris-HCl 100 mL，0.5 mol/L EDTA 100 mL，加入800 mL 去離子水混勻，定容后，高溫滅菌，20 ℃下保存?zhèn)溆?；蛋白酶K：用無菌水稀釋至 20 mg/mL，-20 ℃冷存?zhèn)溆茫籗DS：制備10%SDS 溫水浴溶解后，調(diào)pH 值至7.2 備用；溶菌酶：50 mg/mL，-4 ℃冷存?zhèn)溆谩?/p>

2 試驗方法

工藝流程：采樣-培養(yǎng)基的制備（平板、斜面培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基）-平板（菌株）序列編號-分離純化-平板計數(shù)-形態(tài)鑒定-DNA 提取-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增-凝膠電泳分析-16S rDNA 測序。

2.1 采樣

采樣地點：河南省鄭州市金水區(qū)；采樣時間：2018年 3 月 29 日；樣品分類：速凍米面制品；pH 值：6；采樣數(shù)量：10 個；樣品產(chǎn)地：河南省鄭州市。

2.2 平板序列編號

試驗主要平板編號見表1 所列。

表1 主要平板序列編號Table 1 Primary plate serial number

2.3 菌株序列編號

菌株編號說明：JHX 代表某品牌。梯度編號見表2。

表2 主要菌株序列編號統(tǒng)計Table 2 Major strain serial number statistics

2.4 DNA提取

將新鮮培養(yǎng)的菌液用小型臺式離心機離心10 min（12 000 r/min、4 ℃），離心后倒去上清，以收集菌體細(xì)胞[4]。加少量無菌水懸洗細(xì)胞，吸打沉淀菌體，分散菌體，再次離心 10 min（12 000 r/min、4 ℃），棄上清。加入334 μL TE Buffer 及 16 μL 溶菌酶，漩渦振蕩器混合均勻，放置37 ℃恒溫水浴鍋中1.5 h；加入100 μL 10%SDS上下顛倒搖動離心管；加入2.5 μL 濃度為20 mg/mL 的蛋白酶K，放置55 ℃水浴鍋中3 h 期間輕輕上下?lián)u動離心管，使混合液充分混合）。加250 μL Tris 飽和酚（pH 8.0），輕輕上下顛倒 5 min，再加等體積 250 μL 氯仿，上下顛倒 5 min，離心 10 min（12 000 r/min、4 ℃）。用大口槍尖小心吸取上清液，移至干凈的離心管中。加無水冰凍乙醇，上下輕柔顛倒沉淀DNA，離心10 min（12 000 r/min、4 ℃），棄上清，將離心管中的 DNA 晾干后，加入 TE 溶液，放至 4 ℃冰箱中溶 24 h 備用[5-6]。

2.5 PCR擴增

用于PCR 擴增反應(yīng)體系的試劑，如表3 所列。

表3 16S rDNA 的 PCR 擴增反應(yīng)體系（總 25 μL）Table 3 PCR amplification reaction system of 16S rDNA（total 25 μL）

以提取DNA 為模板，對JHX-系列的16S rDNA基因進行PCR 擴增，通用引物使用27F 和1492R。引物序列 27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：TACGGTACCTTGTTACGACTT。

將溶好的DNA 吸打均勻，備用。按照用量，配置PCR 總體系，并按照每管 24 μL，分裝于 PCR 管中，再在每個PCR 管中加入1 μL 模板，每次擴增需要有一個陰性對照。設(shè)置PCR 儀的反應(yīng)條件：預(yù)變性，94 ℃5 min；變性，94 ℃ 1 min，退火，55 ℃ 1 min；延伸，72 ℃90 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，終止。PCR 結(jié)束后，取出各管，可放至-4 ℃暫存[7-10]。

2.6 凝膠電泳分析

將制好的1%瓊脂糖凝膠，加熱至沸，后在膠模中倒膠，放梳子，靜置20 min 凝固，凝固后，用移液槍先將loading buffer 每滴2 μL 滴在油紙上，將擴增的16S rDNA 按照順序點在loading buffer 中，然后用槍尖將混合液滴點在相應(yīng)孔內(nèi)。第一個位置上加入Marker（采用D2000）以用于對所得PCR 產(chǎn)物的分子量指示。電泳設(shè)備安裝完畢后，先用80 V，5 min 進行電泳，待樣品都已跑出孔后，將電壓調(diào)至180 V，20 min，當(dāng)指示染料到達(dá)膠的2/3 處時，即可停止。把電泳膠放入溴化乙啶（EB）液體中染色約15 min，清水漂洗，放至紫外凝膠成像儀下觀察。如果在紫外儀下看到的是在1 500 bp處唯一一條明帶，且陰性正常，則可送交測序公司測序，否則需重新擴增[11-12]。

2.7 樣品菌株16S rDNA測序

將擴增成功PCR 產(chǎn)物，封口膜密封，送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序，要求測序27F 端一個反應(yīng)，約600 bp。

2.8 速凍餃子凍前菌株進化史分析

2.8.1 試驗材料菌株16S rDNA 序列

JHX 系列（共 30 株菌）：JHX-1，JHX-2，JHX-3，JHX-4，JHX-5，JHX-6，JHX-7，JHX-8，JHX-9，JHX-10，JHX-11，JHX-12，JHX-13，JHX-14，JHX-15，JHX-16，JHX-17，JHX-18A1，JHX-18A2，JHX-19，JHX-20，JHX -21，JHX -22，JHX -23，JHX -24A1，JHX -24A2，JHX-25，JHX-26，JHX-27，JHX-50。

2.8.2 Mega 6 軟件畫圖

菌株進化史序列樹繪圖專用軟件：Mega 6 軟件[13]。

2.8.3 比對分析方法與步驟

將所得30 株菌株按照門、綱、目、科、屬、種的分類方式將所有細(xì)菌分類。

3 結(jié)果與分析

3.1 凝膠電泳成像結(jié)果

把電泳膠放入溴化乙啶（EB）液體中染色約15 min，清水漂洗，放至紫外凝膠成像儀下觀察，結(jié)果如圖1所示。

圖1 16S rDNA 擴增凝膠成像圖譜Fig.1 16S rDNA amplification gel imaging

DNA Marker 由 100、250、500、750、1 000、2 000 bp大小的DNA 片段組成，試驗組都能夠看到明顯條帶，且主要集中在1 500 bp 附近，符合細(xì)菌DNA 片段大小，說明此次細(xì)菌DNA 片段擴增成功。

3.2 測序比對菌株歸屬結(jié)果

用Chromas 讀圖軟件讀圖，截取測序成功的有效序列片段，用于序列的比對分析。結(jié)果采用EzBioCloud軟件進行比對分析[14-16]，比對結(jié)果如表4 所列。

表4 JHX-系列菌株16S rDNA 序列比對分析結(jié)果Table 4 The blast results of 16S rDNA sequences of JHX-series strains

續(xù)表4 JHX-系列菌株16S rDNA 序列比對分析結(jié)果Continue table 4 The blast results of 16S rDNA sequences of JHX-series strains

3.3 菌株進化史分析結(jié)果

選擇具有代表性的6 個綱畫進化樹，且占總比例最高的γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）中的假單胞菌屬（Pseudomonas）作為代表，結(jié)果見圖2 所示。

3.4 樣品菌系結(jié)構(gòu)和多樣性分析

分離菌株共33 株。其中28 株測得16S rDNA 27F端序列（JHX-1，JHX-2，JHX-3，JHX-4，JHX-5，JHX-6，JHX-7，JHX-8，JHX-9，JHX-10，JHX-11，JHX-12，JHX-13，JHX-14，JHX-15，JHX-16，JHX-17，JHX-18A1，JHX-18A2，JHX-19，JHX-20，JHX-21，JHX-22，JHX-23，JHX-24A1，JHX-24A2，JHX-25，JHX-26，JHX-27，JHX-50）。2 株測的全序列（JHX-23，JHX-25）（由于這 2 株菌比對的相似度較低，所以測通便于比對分析）。3 株死亡（JHX-51A1，JHX-51A2，JHX-52）（由于分離培養(yǎng)的過程中，細(xì)菌可能會受到外界污染、培養(yǎng)基、溫度等方面會影響細(xì)菌的生長能力）。

有效序列30 株菌中，有14 個屬，22 個種。其中得到 γ-變形菌綱 5 個屬，12 個種，共 19 株菌，占總數(shù)的63%，γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）是占總數(shù)量最大的，放線菌和β-變形菌綱（Betaproteobacteria）數(shù)量居中，異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）數(shù)量最少。詳細(xì)細(xì)菌所歸門類統(tǒng)計見表5 所列。

從表5 可以得出，JHX-系列中，γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）中的假單胞菌屬數(shù)量最多，可以認(rèn)為假單胞菌屬（Pseudomonas）為優(yōu)勢菌群。β-變形菌綱3 個屬，3 個種，共3 株菌，占總數(shù)的10%。厚壁菌門1 個屬，2 個種，共2 株菌，占總數(shù)的6.7%。放線菌門2 個屬，3 個種，共3 株菌，占總數(shù)的 10 %。擬桿菌門2個屬，2 個種，共2 株菌，占總數(shù)的6.7%。異常球菌-棲熱菌門1 個屬，1 個種，共1 株菌，占總數(shù)的3%。

4 分析及討論

經(jīng)過對上述代表性的細(xì)菌屬分析，可以基本上斷定，餃子餡料中的材料，受到過不同程度的污染，首先是假單胞菌屬（Pseudomonas）為優(yōu)勢菌，說明餡料中的菜已經(jīng)有一定程度的腐敗菜葉，沒有將腐敗的菜葉去除干凈，所以才會導(dǎo)致假單胞菌為優(yōu)勢菌的原因。奈瑟菌屬（Neisseria）的生長環(huán)境及營養(yǎng)需求比較復(fù)雜，初步可以判定是人為衛(wèi)生情況所導(dǎo)致的此類細(xì)菌屬。微桿菌屬（Microbacterium）的存在說明餡料中的菜被昆蟲爬過或生長過，沒有清洗干凈[17]。

通過進一步的分析，餃子的衛(wèi)生情況，人員的衛(wèi)生情況以及前處理的衛(wèi)生情況有待提高。此次分離存活的30 株菌中，沒有分離到致病菌，但是不排除沒有致病菌的存在，因為本次實驗采用國標(biāo)細(xì)菌總數(shù)檢測方法，選用NA 培養(yǎng)基，對致病菌的分離培養(yǎng)存在局限性，如沒有血液培養(yǎng)基，非動物適溫的37 ℃等。雖然本研究未分離培養(yǎng)到致病菌細(xì)胞，但不能判定該樣品中一定不存在致病菌。

圖2 JHX-系列假單胞菌屬（Pseudomonas）的種群結(jié)構(gòu)和進化史分析Fig.2 Population structure and evolutionary history of JHX-series Pseudomonas

表5 JHX 系列菌種數(shù)量結(jié)構(gòu)分析Table 5 Quantitative structure analysis of JHX strains

續(xù)表5 JHX 系列菌種數(shù)量結(jié)構(gòu)分析Continue table 5 Quantitative structure analysis of JHX strains