正交試驗(yàn)優(yōu)化鲬魚(yú)微凍復(fù)合保鮮劑配方研究

徐倩，劉曉攀，趙永慧，胡馨月，劉冰，趙行，王祥鵬，盤(pán)賽昆，3，4，*

（1.淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港222005；2.江蘇天邊漁村食品有限公司，江蘇連云港222100；3.江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院，江蘇連云港222005；4.淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇連云港222005）

鲬魚(yú)（Platycephalus indicus）又名印度鲬、牛尾魚(yú)，廣泛分布于中國(guó)沿海各水域以及日本南部海域，為我國(guó)近海常見(jiàn)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一，也是我國(guó)重要的出口魚(yú)類(lèi)[1]。因其味道鮮美，富含高蛋白、多種維生素和礦物質(zhì)等，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值深受消費(fèi)者歡迎。但是，由于鲬魚(yú)水分含量高，蛋白含量豐富，在儲(chǔ)運(yùn)、加工及銷(xiāo)售過(guò)程中極易腐敗變質(zhì)，從而導(dǎo)致資源浪費(fèi)和經(jīng)濟(jì)損失。因此，尋找一種適宜的保鮮技術(shù)來(lái)延長(zhǎng)鲬魚(yú)的貨架期具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。國(guó)內(nèi)外對(duì)水產(chǎn)品保鮮的研究更趨向于保鮮劑結(jié)合其他處理方式，以發(fā)揮其協(xié)同效應(yīng)，達(dá)到抑菌保鮮的效果[2]。現(xiàn)有的保鮮方式主要有低溫保鮮、保鮮劑保鮮、氣調(diào)保鮮與輻照保鮮，其中保鮮劑結(jié)合低溫保鮮是水產(chǎn)品常用保鮮技術(shù)[3]?，F(xiàn)有研究表明，復(fù)合保鮮劑的綜合保鮮效果優(yōu)于單一保鮮劑。如張璟晶等[4]將0.4 g/L溶菌酶、0.4 g/L Nisin 與5 g/L 殼聚糖復(fù)配使用，在冷藏條件下可將銀鯧的一級(jí)鮮度延長(zhǎng)2 d～3 d，二級(jí)鮮度延長(zhǎng)6 d～7 d。國(guó)外研究者發(fā)現(xiàn)Nisin、茶多酚與殼聚糖復(fù)配協(xié)同效果良好，能明顯抑制微生物的生長(zhǎng)[5]。

茶多酚（tea polyphenols，TP）是茶葉中多羥基酚類(lèi)化合物的混合物。其易溶于水和有機(jī)溶劑，具有抗氧化和清除自由基、抑制微生物生長(zhǎng)、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等多種生物活性，應(yīng)用于食品貯藏與醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域，尤其在水產(chǎn)品保藏中得到較好應(yīng)用[6]。殼聚糖（chitosan，CH）是甲殼素經(jīng)化學(xué)處理脫乙酰基后的產(chǎn)物。殼聚糖含有游離氨基，能溶于低酸度水溶液中，是一種堿性多糖，其抑菌范圍廣、抗菌活性強(qiáng)、安全無(wú)毒，作為一種新型的動(dòng)物源保鮮劑，在果蔬與水產(chǎn)品保鮮中得到普遍應(yīng)用[7]。普魯蘭多糖（pullulan polysaccha ride，PP）是一種由出芽短梗霉發(fā)酵所產(chǎn)生的類(lèi)似葡聚糖、黃原膠的胞外水溶性黏質(zhì)多糖，其分子量在20 kDa～2 000 kDa，易溶于水，無(wú)毒無(wú)害，成膜性、阻氣性、可塑性和黏性均較強(qiáng)，己廣泛應(yīng)用于果蔬、肉類(lèi)等保鮮[8]。且GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[9]規(guī)定，以上3 種添加劑均允許在水產(chǎn)品及其制品中使用。成媛媛等[10]將0.5%普魯蘭多糖液用于草魚(yú)魚(yú)肉，在25 ℃條件下儲(chǔ)藏12 h 后其菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值均顯著低于空白對(duì)照組，保鮮效果最好。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)鲬魚(yú)的研究甚少，主要集中在生物學(xué)方面，對(duì)研究鲬魚(yú)的貯藏保鮮缺乏相關(guān)報(bào)道。另外，水產(chǎn)領(lǐng)域常用的低溫保鮮技術(shù)有冷藏保鮮、冰溫保鮮、微凍保鮮以及凍結(jié)等保鮮技術(shù)[11]。其中，微凍保鮮技術(shù)是公認(rèn)的低溫條件下可較好維持食物品質(zhì)的方法[12]。微凍保鮮所需溫度區(qū)域介于冷藏和凍結(jié)之間。在這一溫度區(qū)域內(nèi)微生物活性受到抑制，大多數(shù)細(xì)菌無(wú)法正常生長(zhǎng)，同時(shí)內(nèi)源酶的活力也受到抑制。鑒于此，本文選用微凍保藏觀察鲬魚(yú)貯運(yùn)期間的品質(zhì)變化，并配以茶多酚、殼聚糖和普魯蘭多糖這3 種天然食品保鮮劑來(lái)進(jìn)行品質(zhì)調(diào)控，旨在為鲬魚(yú)貯藏保鮮及延長(zhǎng)貨架期提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鲬魚(yú)[體長(zhǎng)約（380±10）mm，平均體重（100±10）g]：市購(gòu)；茶多酚（多酚含量≥98%）、殼聚糖（脫乙酰度≥90%）、普魯蘭多糖（純度≥98%）（食品級(jí)）：河南巧手食品添加劑有限公司；硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid value，TBA）（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氯乙酸、丙二醛（分析純）：南京化學(xué)試劑有限公司；甘油、硼酸、鹽酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722s 型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；WSC-S 型測(cè)色色差計(jì)：上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；S20 型pH 計(jì)：梅特勒·托利多集團(tuán)；BD-102型臥式冷凍柜：青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理流程

將新鮮鲬魚(yú)經(jīng)過(guò)去頭、去尾、去內(nèi)臟的“三去”處理后，用流水洗凈后晾干，浸漬于不同配比的保鮮液中，鲬魚(yú)與保鮮液的質(zhì)量體積比為2 ∶1，5 min 后撈出瀝干，用無(wú)菌保鮮袋分裝，放入冰箱于（-5±1）℃微凍，每隔 5 d 取樣測(cè)定 TVB-N 值、TBA 值、pH 值和色差值。未浸保鮮液的樣品設(shè)為空白對(duì)照。

用無(wú)菌蒸餾水分別將茶多酚、普魯蘭多糖和殼聚糖（殼聚糖配制時(shí)需另加1%的冰醋酸）配制成不同濃度的溶液備用。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素試驗(yàn)，考察茶多酚、殼聚糖和普魯蘭多糖對(duì)鲬魚(yú)微凍貯藏條件下的品質(zhì)影響。茶多酚溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)定為0.2%、0.4%、0.6%、殼聚糖溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)定為1.0%、1.5%、2.0%、普魯蘭多糖溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)定為0.25 %、0.5 %、0.75 %，每個(gè)水平設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.3.4 復(fù)合保鮮劑配比優(yōu)選

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以茶多酚、殼聚糖和普魯蘭多糖溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為因素，每個(gè)因素設(shè)3 個(gè)水平，以儲(chǔ)存16 d 后鲬魚(yú)的TVB-N 值為參考指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)選復(fù)合保鮮劑配比。因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.5 TVB-N 值

隨著供暖季臨近，中國(guó)石化天然氣保供工作全面提速。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1至9月，中國(guó)石化累計(jì)供應(yīng)天然氣290.1億立方米，同比增長(zhǎng)18.1%。其中，LNG累計(jì)進(jìn)口88.6億立方米，同比增加59.7%。中國(guó)石化正在加快鄂爾多斯-安平-滄州管道一期工程建設(shè)，預(yù)計(jì)11月中旬投產(chǎn)并實(shí)現(xiàn)向河北供氣。

參照GB 5009.228-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[13]，采用第二法進(jìn)行測(cè)定，平行測(cè)定3 次。

1.3.6 TBA 值

參考Sui 等[14]并做修改，稱(chēng)取5 g 攪碎魚(yú)肉于錐形瓶?jī)?nèi)，加入25 mL7.5%的三氯乙酸混合液，振搖30 min，過(guò)濾2 次，取5 mL 濾液至25 mL 比色管中，再加入5 mL TBA 水溶液（0.02 mol/L），混勻后加塞，在（90±1）℃水浴 40 min，取出，冷卻至 25℃，1 600 r/min 離心 5 min，取上清液加5 mL 氯仿，搖勻并靜置，吸取上清液在532 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。TBA 值用丙二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。

式中：C 為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得丙二醛的微克數(shù)，μg；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.3.7 pH 值

參照謝晶等[15]建立的方法進(jìn)行pH 值測(cè)定，稱(chēng)取10.0 g 魚(yú)肉，絞碎后加90 mL 煮沸冷卻過(guò)的蒸餾水，振蕩30 min 后過(guò)濾，用精密pH 計(jì)來(lái)測(cè)定其pH 值。

1.3.8 色差值

采用WSC-S 色差分析儀來(lái)測(cè)定魚(yú)肉的顏色變化。L*（lightness）為明度指數(shù)、a*（redness/greenness）表示紅綠偏差、b*（yellowness/blueness）表示黃藍(lán)偏差值，3 個(gè)指標(biāo)值先用白板校準(zhǔn)。L*=0 表示黑色，L*=100 表示白色；a*和b*為彩度指數(shù)，+a*表示紅色，-a*表示綠色，+b*表示黃色，-b*表示藍(lán)色。總顏色差異E*，用[（L*）2+（a*）2+（b*）2]1/2表示，E*越大，說(shuō)明色差越大。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 次以上重復(fù)試驗(yàn)，用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ和Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并以±SD 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚對(duì)鲬魚(yú)冷凍保藏效果的影響

茶多酚對(duì)鲬魚(yú)冷凍保藏效果的影響見(jiàn)圖1。圖1（a）表示不同濃度的TP 對(duì)鲬魚(yú)貯藏過(guò)程中TVB-N 值的影響。TVB-N 值是水產(chǎn)品在細(xì)菌和酶的作用下分解產(chǎn)生氨及低級(jí)胺類(lèi)化合物，常測(cè)其總氮量作為魚(yú)類(lèi)的鮮度指標(biāo)。GB 2733-2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》[16]規(guī)定海水魚(yú) TVB-N 值（mg/100 g）≤30在可接受范圍內(nèi)。圖1（b）表示不同濃度的TP 對(duì)鲬魚(yú)貯藏過(guò)程中TBA 值的影響。TBA 值是指肉類(lèi)、魚(yú)類(lèi)等動(dòng)物性油脂中不飽和脂肪酸氧化分解后所產(chǎn)生的衍生物如丙二醛（malondialdehyde，MDA）等與 TBA 試劑反應(yīng)的結(jié)果[17]。TBA 值越大，脂肪的氧化程度越高，因此TBA 值是測(cè)定水產(chǎn)品脂肪氧化酸敗程度的良好判斷指標(biāo)。圖1（c）表示不同濃度的TP 對(duì)鲬魚(yú)貯藏過(guò)程中pH 值的影響。圖1（d）表示不同濃度的TP 對(duì)鲬魚(yú)貯藏過(guò)程中色差的影響。顏色的變化主要源于魚(yú)肉蛋白質(zhì)氧化后血紅蛋白的減少導(dǎo)致的整體色差的下降。

圖1 不同濃度的茶多酚對(duì)鲬魚(yú)冷藏效果的影響Fig.1 Effect of different concentrations of tea polyphenols on the effect of Platycephalus induicus

如圖1（a）所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，TVB-N 值不斷上升。其中，采用0.2%的TP 處理的鲬魚(yú)TVB-N值最低，第 16 天時(shí)其 TVB-N 值為（21.55±0.27）mg/100 g，而空白對(duì)照組的 TVB-N 值為（30.98±0.82）mg/100 g，與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異（P<0.05）。如圖1（b）所示，鲬魚(yú)在整個(gè)冷藏過(guò)程中的TBA 值呈不斷上升趨勢(shì)，這表明魚(yú)肉氧化酸敗程度越來(lái)越嚴(yán)重。添加TP 的試驗(yàn)組均能延緩鲬魚(yú)的TBA 值，說(shuō)明TP 能有效抑制鲬魚(yú)脂肪氧化酸敗。其中，0.2%的TP 處理的鲬魚(yú)TVB 值最低，第 16 天時(shí)其 TBA 值為 0.275 mg/kg 顯著低于空白對(duì)照組的TBA 值為0.434 mg/kg（P<0.05）。如圖1（c）所示，鲬魚(yú)在整個(gè)貯藏過(guò)程中呈現(xiàn)先降低后升高的V 型趨勢(shì)，這與蘇輝等[18]的研究結(jié)果類(lèi)似。鲬魚(yú)樣品的pH 值在最初6 d 內(nèi)呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，第6 天時(shí)，空白對(duì)照組pH 值明顯增加。隨著鲬魚(yú)貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)被分解成堿性的胺及氨類(lèi)物質(zhì)，pH 值逐漸升高。pH 值越大，表明樣品的腐敗程度越高。采用TP 處理后的樣品，其pH 值均較空白對(duì)照組低，其中0.2%處理的pH 值最低。如圖1（d）所示，空白對(duì)照組的色差在小范圍內(nèi)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，0.2%的TP 對(duì)于降低色差變化的效果最佳。

2.2 殼聚糖對(duì)鲬魚(yú)冷凍保藏效果的影響

殼聚糖對(duì)鲬魚(yú)冷凍保藏效果的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度的CH 對(duì)鲬魚(yú)冷藏效果的影響Fig.2 Effects of different concentrations of chitosan on the effect of Platycephalus induicus

圖2（a）表示不同濃度的CH 對(duì)鲬魚(yú)貯藏過(guò)程中TVB-N 值的影響。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，用CH 處理鲬魚(yú)的TVB-N 值低于對(duì)照組。其中采用1.0%的CH處理鲬魚(yú)的TVB-N 值最低，到貯藏末期（16 d）其TVB-N 值為（18.80±1.14）mg/100 g 顯著低于對(duì)照組的TVB-N 值（30.25±0.82）mg/100 g（P<0.05）。李婷婷等[19]的研究表明，殼聚糖用于處理大黃魚(yú)能夠明顯降低TVB-N 值，從而降低腐敗的速率，CH 處理鲬魚(yú)具有相似的現(xiàn)象。圖2（b）表示不同濃度的CH 對(duì)鲬魚(yú)貯藏過(guò)程中TBA 值的影響。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，所有組的TBA值總體呈上升趨勢(shì)，其中，1.0%CH 試驗(yàn)組的TBA 值均低于其它3 組。在第16 天時(shí)，1.0%CH 試驗(yàn)組TBA值為0.24 mg/kg 顯著低于空白對(duì)照組的0.434 mg/kg。因?yàn)闅ぞ厶蔷哂辛己玫某赡ば?，能夠有效阻隔氧氣，從而抑制脂質(zhì)氧化。圖2（c）表示不同濃度的CH 對(duì)鲬魚(yú)貯藏過(guò)程中pH 值的影響。如圖2（c）所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，pH 值呈先下降后上升的趨勢(shì)。其中，1.0%的試驗(yàn)組和空白對(duì)照組相比具有顯著性差異。這說(shuō)明一定濃度的CH 能夠有效抑制魚(yú)體腐敗微生物的繁殖，保持魚(yú)肉品質(zhì)。圖2（d）表示，不同濃度的CH 對(duì)鲬魚(yú)貯藏過(guò)程中色差的影響。如圖（d）所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各試驗(yàn)組的色差值總體呈下降趨勢(shì)。其中，1.0%CH 對(duì)鲬魚(yú)貯藏過(guò)程中影響效果最好，且與空白對(duì)照組有顯著差異。

2.3 普魯蘭多糖對(duì)鲬魚(yú)冷凍保藏效果的影響

普魯蘭多糖對(duì)鲬魚(yú)冷凍保藏效果的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度的普魯蘭多糖對(duì)鲬魚(yú)冷藏效果的影響Fig.3 Effects of different concentrations of pullulan polysaccharides on the effect of Platycephalus induicus

圖3（a）表示不同濃度的PP 對(duì)鲬魚(yú)貯藏過(guò)程中T VB-N 值的影響。如圖（a）所示，空白試驗(yàn)組的TVB-N值增加非常迅速，在第16 天時(shí)其TVB-N 值達(dá)（31.79±0.82）mg/100 g；而經(jīng) PP 處理的鲬魚(yú)其 TVB-N 值增加較緩，尤其是經(jīng)0.25%PP 處理的鲬魚(yú)在貯藏16 d 后其 TVB-N 值僅為（20.19±1.91）mg/100 g，由此可見(jiàn) PP能有效抑制鲬魚(yú)體內(nèi)TVB-N 的產(chǎn)生，其主要緣于PP良好的阻氧性抑制了鲬魚(yú)體內(nèi)酶和細(xì)菌的生物活性[20]。圖3（b）表示不同濃度的PP 對(duì)鲬魚(yú)貯藏過(guò)程中TBA值的影響。如圖3（b）所示，經(jīng)過(guò)PP 處理后的鲬魚(yú)TBA值高于空白對(duì)照組，但在試驗(yàn)第16 天時(shí)，PP 處理過(guò)的樣品則表現(xiàn)出TBA 值明顯低于空白對(duì)照組的TBA值，說(shuō)明達(dá)到PP 對(duì)于水產(chǎn)品的貯藏效果需要一定時(shí)間。其中，0.25%PP 處理的效果最佳，說(shuō)明濃度過(guò)高的PP 形成的膜可能對(duì)于O2的選擇通過(guò)性不如低濃度的PP 效果好。圖3（c）表示不同濃度的PP 對(duì)鲬魚(yú)貯藏過(guò)程中pH 值的影響。如圖3（c）所示，鲬魚(yú)的pH 值隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈先下降后上升趨勢(shì)，經(jīng)PP 處理后，鲬魚(yú)的pH 值變化較緩慢，其中0.25%PP 試驗(yàn)組較明顯。圖3（d）表示不同濃度的PP 對(duì)鲬魚(yú)貯藏過(guò)程中色差值的影響。如圖3（d）所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，鲬魚(yú)的色差值呈緩慢下降趨勢(shì)。其中，0.25%和0.75%的PP 處理過(guò)的鲬魚(yú)色差值變化范圍較小，綜合以上3 個(gè)測(cè)定指標(biāo)選擇0.25%PP 試驗(yàn)組為最佳。

2.4 復(fù)配結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以鲬魚(yú)儲(chǔ)藏16 d 后的TVB-N 值為指標(biāo)進(jìn)行復(fù)合保鮮劑最佳配比優(yōu)化。試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 鲬魚(yú)復(fù)合保鮮劑最佳比例正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of Platycephalus indicus fresh-keeping orthogonal experiment

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the analysis orthogonal array design

由表2、表3 分析可知，殼聚糖和茶多酚對(duì)微凍鲬魚(yú)TVB-N 值的影響效果顯著，普魯蘭多糖的影響不顯著。各因素對(duì)微凍鲬魚(yú)TVB-N 值的影響主次順序?yàn)锳＞B＞C，即殼聚糖用量＞茶多酚用量＞普魯蘭多糖用量。復(fù)配組合A1B2C1為減緩TVB-N 值增加的最優(yōu)配比。即復(fù)合保鮮劑的最佳配比為0.8%CH、0.2%TP 和0.15%PP。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用正交后的最佳復(fù)配進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，即采用0.8%CH、0.2%TP 和 0.15%PP 進(jìn)行復(fù)配在第 16 天測(cè)定 TVB-N 值、TBA 值、pH 值和總色差，其結(jié)果分別為10.526 mg/100 g、0.162 mg/kg、7.01、40.25，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2733-2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》的衛(wèi)生指標(biāo)。

3 結(jié)論

采用正交試驗(yàn)組合復(fù)配3 種保鮮劑，對(duì)3 種保鮮劑復(fù)合使用的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定了鲬魚(yú)貯藏保鮮劑的工藝參數(shù)為CH 添加量為0.8%、TP 添加量為0.2%、PP 添加量為0.15%，在此配方條件下對(duì)鲬魚(yú)微凍保藏16 d，產(chǎn)品各項(xiàng)指標(biāo)均明顯優(yōu)于空白對(duì)照組，說(shuō)明這3 種保鮮劑處理鲬魚(yú)后再進(jìn)行微凍保鮮能抑制細(xì)菌繁殖，延緩腐敗變質(zhì)，改善鲬魚(yú)保藏品質(zhì)。