響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取黑小麥花色苷的工藝研究

盧鵬飛，高志強(qiáng)，*，孫敏，趙劍敏，董石峰，白雪，尹璐，侯非凡，尹雪斌

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能農(nóng)業(yè)研究院，山西太谷030801）

黑小麥?zhǔn)侵缸蚜７N皮或糊粉層的顏色為黑色的小麥。由于天然色素對(duì)人體無毒無害、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，而且具有一定的生物抗氧化活性，因此，研究開發(fā)無毒無害的天然色素就成為了色素未來的發(fā)展趨勢(shì)。黑小麥中含有大量的天然色素，以花色苷類色素為主[1-2]，該色素源于種子，安全無毒，對(duì)食品、飲料有較強(qiáng)的著色性，可以與活性氮結(jié)合，阻斷新自由基形成，具有較強(qiáng)的抗氧化[3-4]、抗炎癥[5]、抗癌能力[6]和顯著的心血管保護(hù)能力[7-8]。因此，花色苷作為黑小麥重要的生物活性物質(zhì)，特別是其具有安全性高以及資源可再生等優(yōu)勢(shì)，在食品、醫(yī)療及保健品行業(yè)擁有廣闊的應(yīng)用前景[9]，已經(jīng)成為當(dāng)前功能性食品開發(fā)研究的熱點(diǎn)之一。

從植物材料中提取生物活性物質(zhì)的傳統(tǒng)方法有浸提法、水蒸氣蒸餾法和索氏提取法等。這些方法都存在時(shí)間長(zhǎng)、溶劑量大、溫度高等缺點(diǎn)，可能導(dǎo)致具有生物活性的化合物結(jié)構(gòu)被破壞或降解[10]。為了克服這一缺點(diǎn)，開發(fā)了從植物材料中提取生物活性化合物的新技術(shù)，這些化合物可以在不降解或失去營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的情況下使用。超聲波輔助萃取以較低的溫度，較短的處理時(shí)間，較低的有機(jī)溶劑消耗和較低的能源投入以及效率高、使用方便、設(shè)備易使用等優(yōu)點(diǎn)，受到了越來越多的關(guān)注，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取研究中[11-16]。超聲波產(chǎn)生的熱效應(yīng)、機(jī)械作用和空化效應(yīng)可以使原料細(xì)胞壁快速破碎，促進(jìn)提取劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與目標(biāo)提取成分充分混合，加速胞內(nèi)物質(zhì)溶出、擴(kuò)散和釋放，大多數(shù)研究證明，相比于傳統(tǒng)提取方法，超聲輔助提取能夠明顯提高目標(biāo)成分的提取量[17-18]。目前，對(duì)黑小麥花色苷組成分析[3，19-20]及提取工藝[21-22]已有初步研究，而使用超聲波輔助法對(duì)黑小麥花色苷進(jìn)行提取工藝優(yōu)化等方面仍待深入。本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取黑小麥籽粒花色苷，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化最佳提取工藝。以期提高黑小麥資源價(jià)值，為黑小麥開發(fā)成為功能性食品提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑小麥：山西洪洞縣；鹽酸、氯化鉀、氫氧化鉀、95 %無水乙醇、無水醋酸鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

pH 復(fù)合電極：上海儀電科學(xué)儀器有限公司；SB-5200 超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技有限公司；ME104E 電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；UV1600 紫外分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；DE-100g 高速磨粉機(jī)：浙江紅景天工貿(mào)有限公司；Neofuge15 高速離心機(jī)：上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.3.1 pH 示差法的原理

隨pH 值的改變花色苷的色調(diào)及色度會(huì)改變，但pH 值的改變卻不會(huì)對(duì)干擾雜質(zhì)的吸光度造成影響。pH 1.0 時(shí)檢測(cè)液中花色苷存在形式為花色苷元離子，此時(shí)檢測(cè)液的吸光度為花色苷與雜質(zhì)兩者的吸光度；pH 4.5 時(shí)檢測(cè)液中的花色苷轉(zhuǎn)化為無色的查爾酮，此時(shí)檢測(cè)液的吸光度僅為雜質(zhì)的吸光度[23]。

1.3.2 樣品預(yù)處理

挑選籽粒飽滿大小均一的麥粒，經(jīng)除雜后用粉碎機(jī)粉碎，過100 目篩，研磨成小麥粉，避光密封保存在4 ℃冰箱中備用。

1.3.3 花色苷提取工藝流程

揀選籽粒飽滿的小麥→粉碎→超聲波輔助提取→離心→花色苷提取液

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4.1 料液比對(duì)黑小麥籽?；ㄉ仗崛×康挠绊?/p>

準(zhǔn)確稱取黑小麥5 份各1 g，研磨成全麥粉，轉(zhuǎn)入5 個(gè)容量瓶中，分別加入酸性乙醇[0.1 %鹽酸∶乙醇=1 ∶100（體積比）]搖勻，乙醇濃度 60 %，提取溫度為60 ℃，提取時(shí)間為 60 min，料液比梯度設(shè)置為：1 ∶35、1 ∶40、1 ∶45、1 ∶50、1 ∶55（g/mL），超聲波提取后離心，測(cè)定吸光度，計(jì)算花色苷提取量?？疾觳煌弦罕葘?duì)花色苷提取量的影響。

1.3.4.2 乙醇濃度對(duì)黑小麥籽?；ㄉ仗崛×康挠绊?/p>

準(zhǔn)確稱取黑小麥5 份各1 g，研磨成全麥粉，轉(zhuǎn)入5 個(gè)容量瓶中，分別加入酸性乙醇提取液45 mL 搖勻，提取溫度為60 ℃、提取時(shí)間為60 min，設(shè)置乙醇濃度梯度為：40%、50%、60%、70%、80%的條件下，超聲波提取后離心，測(cè)定吸光度，計(jì)算花色苷提取量?？疾觳煌掖紳舛葘?duì)花色苷提取量的影響。

1.3.4.3 提取時(shí)間對(duì)黑小麥籽粒花色苷提取量的影響

準(zhǔn)確稱取黑小麥5 份各1 g，研磨成全麥粉，轉(zhuǎn)入5 個(gè)容量瓶中，分別加入酸性乙醇提取液45 mL 搖勻，乙醇濃度60%，提取溫度為60 ℃，設(shè)置時(shí)間梯度為：30、40、50、60、70 min 的條件下，超聲波提取后離心，測(cè)定吸光度，計(jì)算花色苷提取量?？疾觳煌崛r(shí)間對(duì)花色苷提取量的影響。

1.3.4.4 提取溫度對(duì)黑小麥籽粒花色苷提取量的影響

準(zhǔn)確稱取黑小麥5 份各1 g，研磨成全麥粉，轉(zhuǎn)入5 個(gè)容量瓶中，分別加入酸性乙醇提取液45 mL 搖勻，在乙醇濃度60%，提取時(shí)間為60 min，設(shè)置溫度梯度為：30、40、50、60、70 ℃的條件下，超聲波提取后離心，測(cè)定吸光度，計(jì)算花色苷提取量?？疾觳煌崛囟葘?duì)花色苷提取量的影響。

1.3.5 小麥花色苷提取量的測(cè)定

采用pH 示差法來測(cè)定黑小麥花色苷提取量。由試驗(yàn)可知黑小麥花色苷的最大吸收波長(zhǎng)為530 nm。吸取待測(cè)液2.0 mL，分別用pH 1.0 和pH 4.5 的緩沖溶液稀釋至10 mL。分別在530 nm 處和700 nm 處測(cè)定提取液的吸光度A，由Fuleki T 公式[24]計(jì)算如下：

式中：ΔA 表示黑小麥花色苷總吸光值；A530nm表示黑小麥花色苷在530 nm 處的吸光值；A700nm表示黑小麥花色苷在700 nm 處的吸光值；c 表示黑小麥花色苷提取量，mg/g；V 表示提取液總體積，mL；DF 表示稀釋倍數(shù)；M 表示Cyd-3-Glu（矢車菊素-3-葡萄糖苷）的相對(duì)分子質(zhì)量，449.2 g/mol；ε 表示 Cyd-3-Glu 的消光系數(shù)[29 600 L/（mol·cm）]；m 表示樣品質(zhì)量，g；L 表示光程，數(shù)值為1 cm。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Benhnken 模型的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用四因素三水平的響應(yīng)曲面分析法，選取料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度為自變量，分別以A、B、C、D 來表示，并以 1、0、-1 分別代表各自的高中低水平，以花青素提取量為響應(yīng)值，依據(jù)回歸分析確定較優(yōu)的提取工藝條件。響應(yīng)面試驗(yàn)影響因素水平與編碼見表1。

表1 Box-Benhnken 響應(yīng)面因素及水平Table 1 Box-Benhnken response surface factors and levels

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 軟件作圖，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 軟件，分別對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，繪制單因素變化趨勢(shì)圖、建立線性回歸方程、判斷模型顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助提取試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

小麥籽?；ㄉ仗崛∫海ê?0 %酸性乙醇）在445 nm～600 nm 處的吸收光譜圖見圖1。

圖1 小麥籽?；ㄉ赵诓煌ㄩL(zhǎng)下的吸光度Fig.1 Absorbance of wheat grain anthocyanins at different wavelengths

由圖1 可見，用酸性乙醇提取的小麥籽粒花色苷溶液在可見光區(qū)最大吸收波長(zhǎng)為λ=530 nm。

2.1.2 料液比對(duì)小麥花色苷提取量的影響

料液比對(duì)籽粒花色苷提取量的影響見圖2。

圖2 料液比對(duì)籽?；ㄉ仗崛×康挠绊慒ig.2 Effect of material-liquid ratio on the content of anthocyanins in grain

由圖2 可知，隨著料液比的增大，花色苷含量先增加后減少，當(dāng)料液比達(dá)到1 ∶45（g/mL）時(shí)，提取量達(dá)到最大，達(dá)26.95 mg/100 g。繼續(xù)加大料液比既造成提取劑的浪費(fèi)，也降低了花色苷的提取量。因此，小麥籽?；ㄉ盏妮^佳料液比為 1 ∶45（g/mL）。

2.1.3 乙醇濃度對(duì)小麥花色苷提取量的影響

乙醇濃度對(duì)籽?；ㄉ仗崛×康挠绊懸妶D3。

圖3 乙醇濃度對(duì)籽?；ㄉ仗崛×康挠绊慒ig.3 Effect of ethanol concentration on the content of anthocyanins in grain

由圖3 可知，隨乙醇濃度不斷增大至60%時(shí)，花色苷含量持續(xù)增加，可能是由于植物體內(nèi)的花色苷是花青素通過疏水鍵和氫鍵與多糖相結(jié)合，乙醇能促使氫鍵斷裂，形成小分子的花青素，從而使溶液中的色素含量提高[25]。當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，花色苷提取量最高，達(dá)26.91 mg/100 g。當(dāng)乙醇濃度高于60%時(shí)，花色苷提取量呈下降趨勢(shì)，可能是由于花色苷具有較強(qiáng)的極性，若乙醇濃度過高會(huì)導(dǎo)致溶液極性弱，水溶性花色苷析出減少[26-27]。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)小麥花色苷提取量的影響

提取時(shí)間對(duì)籽粒花色苷提取量的影響見圖4。

由圖4 可知，提取時(shí)間低于60 min 時(shí)，花色苷提取量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。提取時(shí)間為60 min時(shí)，花色苷的提取量最大，達(dá)27.90 mg/100 g。說明小麥籽粒粉末與溶劑充分接觸，花色苷已充分溶出。提取時(shí)間繼續(xù)增加，花色苷提取量反而下降，這可能因?yàn)槌曁幚頃r(shí)間過長(zhǎng)，可能會(huì)破壞花色苷分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致花色苷降解[28]。

圖4 提取時(shí)間對(duì)籽?；ㄉ仗崛×康挠绊慒ig.4 Effect of extraction time on the content of anthocyanins in grain

2.1.5 提取溫度對(duì)小麥花色苷提取量的影響

提取溫度對(duì)籽粒花色苷提取量的影響見圖5。

圖5 提取溫度對(duì)籽?；ㄉ仗崛×康挠绊慒ig.5 Effect of extraction temperature on the content of anthocyanins in grain

由圖5 可知，在提取溫度低于50 ℃時(shí)，隨著提取溫度的升高，花色苷提取量逐漸增大并且在50 ℃時(shí)達(dá)到最高值，達(dá)27.64 mg/100 g。當(dāng)提取溫度高于50 ℃時(shí)，花色苷的提取量反而下降。這可能是因?yàn)闇囟壬邔?dǎo)致分子擴(kuò)散速率加快，有利于花色苷的溶出[29]，其得率在50 ℃左右達(dá)到最大值。但溫度繼續(xù)升高時(shí)，花色苷提取量降低，因?yàn)榛ㄉ諏?duì)熱較敏感，過高的溫度會(huì)破壞其穩(wěn)定性，容易造成分解，在90 ℃下加熱5 h，色素保存率僅50%左右，所以應(yīng)該控制花青素提取時(shí)的溫度[30]。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化花色苷的提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析

使用Design Expert 8.0.6 軟件，根據(jù)Box-behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以液料比A、乙醇濃度B、提取時(shí)間C、提取溫度D 為自變量，小麥籽?；ㄉ仗崛×縍 為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析優(yōu)化試驗(yàn)，對(duì)表2 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到方差分析表3，對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合，建立回歸方程R=27.58+1.63A+0.31B+0.83C-1.12D-0.28AB-0.17AC-1.18AD-0.97BC+0.43BD+1.18CD-2.16A2-2.23B2-1.08C2-0.93D2

表2 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of the Box-Behnken response surface experiment

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續(xù)表3 回歸模型方差分析Continue table 3 Variance analysis of regression model

由表3 可知，該模型極顯著（P＜0.000 1），回歸模型的決定系數(shù)R2=0.951 7，校正系數(shù)=0.903 4，表明該模型能解釋95.17%的變化，說明該模型擬合度良好，試驗(yàn)誤差小，用該模型對(duì)小麥籽?；ㄉ仗崛」に囘M(jìn)行優(yōu)化可以獲得良好的效果。將表3 中F 值大小作為各參數(shù)對(duì)小麥籽?；ㄉ蘸坑绊懙谋容^[31]，得出4 個(gè)因素對(duì)R 值（花色苷提取量）的影響大小依次為：液料比＞提取溫度＞提取時(shí)間＞乙醇濃度。其中A、C、D、AD、CD、A2、B2、C2、D2對(duì) R 值影響極顯著 （P＜0.01），BC 對(duì) R 值影響顯著（P＜0.05）。

2.2.2 各因素及其交互作用對(duì)花色苷含量的影響

料液比與乙醇濃度交互效應(yīng)圖和響應(yīng)曲面見圖6。

圖6 液料比與乙醇濃度交互效應(yīng)圖和響應(yīng)曲面Fig.6 Interactive effect and response surface between liquidmaterial ratio and ethanol concentration

液料比與提取時(shí)間交互效應(yīng)圖和響應(yīng)曲面見圖7。

圖7 液料比與提取時(shí)間交互效應(yīng)圖和響應(yīng)曲面Fig.7 Interactive effect and response surface between liquidmaterial ratio and extraction time

料液比與提取溫度交互效應(yīng)圖和響應(yīng)曲面見圖8。

圖8 液料比與提取溫度交互效應(yīng)圖和響應(yīng)曲面Fig.8 Interactive effect and response surface between liquidmaterial ratio and extraction temperature

乙醇濃度與提取時(shí)間交互效應(yīng)圖和響應(yīng)曲面見圖9。

圖9 乙醇濃度與提取時(shí)間交互效應(yīng)圖和響應(yīng)曲面Fig.9 Interactive effect and response surface between ethanol concentration and extraction time

乙醇濃度與提取溫度交互效應(yīng)圖和響應(yīng)曲面見圖10。

圖10 乙醇濃度與提取溫度交互效應(yīng)圖和響應(yīng)曲面Fig.10 Interactive effect and response surface between ethanol concentration and extraction temperature

提取時(shí)間與提取溫度交互效應(yīng)圖和響應(yīng)曲面見圖11。

圖11 提取時(shí)間與提取溫度交互效應(yīng)圖和響應(yīng)曲面Fig.11 Interactive effect and response surface between extraction time and extraction temperature

通過Design Expert 8.0.6 軟件得到各因素間的交互效應(yīng)圖和響應(yīng)曲面（圖6～圖11），進(jìn)一步分析其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。若等高線形狀為圓形，表示交互作用不顯著；若形狀為橢圓，表示交互作用顯著。響應(yīng)曲面越陡峭，表示響應(yīng)值對(duì)因素變化的適應(yīng)性越差[32]。

由表3 可知，液料比（A）、乙醇濃度（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）均為影響小麥籽粒花色苷含量（R）的主要因素，各因素間的交互作用如圖6～圖11 所示，每個(gè)響應(yīng)曲面均為開口向下的凸形曲面，每個(gè)響應(yīng)面都有極高值，出現(xiàn)在等高線的圓心處。其中液料比（A）和提取時(shí)間（C）的等高線圖與圓形最接近，說明他們之間的交互作用對(duì)花色苷含量提取的影響最小，而等高線越扁平則表示兩因素的交互作用越大，提取時(shí)間（C）和提取溫度（D）的交互作用對(duì)花色苷提取量的影響作用最大。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

通過軟件分析確定小麥籽?；ㄉ兆罴烟崛」に嚍榱弦罕?1 ∶48.31（g/mL），乙醇濃度 59.76%，提取時(shí)間57.98 min，提取溫度40.00 ℃，在該條件下小麥籽粒花色苷提取量的理論值為28.74 mg/100 g。為了便于試驗(yàn)操作將最優(yōu)條件簡(jiǎn)化為調(diào)整參數(shù)為料液比1 ∶48（g/mL），乙醇濃度60%，提取時(shí)間58 min，提取溫度40 ℃。此條件下進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，小麥籽?；ㄉ仗崛×繛?8.61 mg/100 g，與理論值相近，說明經(jīng)響應(yīng)面分析方法優(yōu)化獲得的工藝參數(shù)是可信的，具有較好的實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以花色苷提取量為考察目標(biāo)，利用響應(yīng)面分析法對(duì)黑小麥籽?；ㄉ盏某曁崛」に囘M(jìn)行優(yōu)化，最終獲得花色苷提取最佳工藝條件為料液比1 ∶48（g/mL），乙醇濃度 60%，提取時(shí)間 58 min，提取溫度40 ℃，在此試驗(yàn)條件下花色苷的提取量為28.61 mg/100 g。4 個(gè)因素對(duì)花色苷提取量的影響大小依次為：料液比＞超聲溫度＞超聲時(shí)間＞乙醇濃度。綜上，此工藝參數(shù)可為黑小麥花色苷的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。