均勻設(shè)計法優(yōu)化丁香精油提取工藝及其抑菌活性研究

張學(xué)彬，谷東建，劉增博，張學(xué)禮，高丹，張華博

（1.北京交通大學(xué)海濱學(xué)院化學(xué)工程系，河北滄州061199；2.黃驊市易簡科技有限公司，河北滄州061100）

丁香為桃金娘科植物，花序碩大、開花茂盛、花色淡雅、芳香習(xí)性強健，栽培簡易，因而在園林中廣泛栽培應(yīng)用，為藥食兩用植物。干燥的丁香花蕾具有極高藥用價值，形狀呈短棒狀，長1.2 cm～2 cm，色棕紫；下部為圓柱狀略偏的萼管，上部近圓球形。香氣濃烈味辛、性溫，油性足。藥理具有溫中降逆、溫腎助陽、抑菌驅(qū)蟲、芳香健胃、抗病毒等作用[1-3]。在生活中丁香精油不僅是食品、香煙等調(diào)配料，還是高級化妝品的主要原料，又是牙科藥物中不可缺少的防腐鎮(zhèn)痛劑。其中的丁香酚、β-石竹烯以及乙?；∠惴訛槎∠憔椭饕煞諿4]，因此丁香精油的分離與提純工藝得到人們肯定與研究。

目前，丁香精油的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、有機溶劑萃取法、超臨界CO2流體萃取法[5-9]。其中有機溶劑萃取法，是根據(jù)有機溶劑與丁香精油相似相溶原理，利用其對丁香精油的高選擇性完成對丁香精油的萃取，并且最大程度的保持了丁香精油的成分和香氣。由于在丁香精油提取分離中影響因素較多，所以導(dǎo)致試驗次數(shù)巨大且丁香精油收率較低[10-12]，目前還存在最優(yōu)工藝方法選取難度大等問題。

新鮮果蔬采后被病原生物侵染嚴重問題[12-16]。目前控制果蔬采后病害的最有效手段是化學(xué)殺菌劑與冷藏結(jié)合處理，但由于化學(xué)殺菌劑殘留危害人類健康及植物病原菌對化學(xué)殺菌劑產(chǎn)生抗藥性等諸多問題的存在，尋找篩選有效的果蔬保鮮方法有極大前景。研究表明植物提取物中含有抑制病原微生物的成分[16-20]，其中從食用中藥和香辛料中提取天然防腐保鮮劑，被認為是食品添加劑研究領(lǐng)域中非常有前景的發(fā)展方向，是開發(fā)新型高效果蔬生物防腐保鮮劑的重要途徑[21-27]。

本文采用均勻設(shè)計法優(yōu)化有機溶劑萃取丁香精油工藝。以丁香精油的收率為目標(biāo)，考察萃取溫度、原料顆粒度、溶劑種類、料液比對丁香精油收率的影響，選取最優(yōu)工藝條件，回歸分離萃取模型，并驗證，為丁香精油的分離與提純工藝選擇提供基礎(chǔ)。同時進行丁香精油對果蔬采后病原菌的抑制效果研究[28]，為開發(fā)果蔬采后天然防腐保鮮劑提供基礎(chǔ)，對其在食品防腐保鮮中的應(yīng)用具有重要的社會意義和學(xué)術(shù)價值。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

GC126A：上海儀電分析儀器有限公司；DC-0510恒溫循環(huán)水浴：艾普儀器有限公司；JJ-2 組織搗碎機：上海汗諾儀器有限公司；BSM220.4 電子分析天平：上海卓精電子科技有限公司；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（III）系列循環(huán)水式真空泵：浙江力辰儀器科技有限公司；GMSX-280 滅菌鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；303-00A 生化培養(yǎng)箱：上海坤天實驗儀器有限公司；850SW-CJ-1D 超凈工作臺：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 材料與試劑

丁香花蕾：蘇州市天靈中藥飲片有限公司；無水乙醇（分析純）、無水乙醚（分析純）、丙酮（分析純）、石油醚（分析純 90 ℃～120 ℃）、正己烷（分析純）、冰醋酸（分析純）：天津市致遠化工試劑有限公司；丁香酚、乙酰基丁香酚：Sigma 公司；瓊脂粉（生化試劑）、葡萄糖（分析純）：天津市化學(xué)試劑廠。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

將丁香花蕾篩檢、除雜、洗凈后，置于烘干箱中45 ℃烘干24 h，選取適量樣品加入搗碎機粉碎，用電動篩分機篩分，選取50 目～150 目備用。

取10 g 的丁香花蕾粉置于索氏提取器中，選用不同萃取試劑并且控制料液比，設(shè)置一定溫度、壓力和充分萃取時間，進行3 次虹吸萃取丁香精油。

將含有丁香精油的有機溶劑轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，分離有機溶劑，得到產(chǎn)物丁香精油。丁香精油收率：

式中：m 為丁香精油質(zhì)量，g；n 為丁香花蕾質(zhì)量，g。

1.3.2 氣相色譜分析與檢測

氣相色譜條件，進樣溫度：250 ℃；升溫程序：50 ℃開始以6 ℃/min 的速度升溫至110 ℃，穩(wěn)定5 min；而后以5 ℃/min 的速度升溫至160 ℃，穩(wěn)定5 min；再以4 ℃/min 的速度升溫至 200 ℃，穩(wěn)定 5 min；最后以5 ℃/min 的速度升溫至 250 ℃。

1.3.3 病原菌提取與鑒定

采用柯赫氏法則選取分離青霉菌和漿胞。選取腐爛冬棗，用酒精進行表面消毒，切取腐爛組織1 cm2移入培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)72 h，將新生菌落的少量菌絲移入新培養(yǎng)基培養(yǎng)，重復(fù)操作3 次～5 次，獲得純化菌種[15]。

1.3.4 藥品溶液制備

1.3.4.1 精油制備

將原油用丙酮溶解并用蒸餾水稀釋成0.25、0.5、1、1.5、2.0、2.5 μL/mL 的溶液。

1.3.4.2 菌種孢子懸浮液制備

用1%無菌葡萄糖溶液溶解菌種新生孢子，充分攪拌，過濾，將濾液充分搖勻，在顯微鏡下調(diào)節(jié)其濃度至每個視野中包含50 個孢子。

1.3.5 抑菌試驗方法

取25 μL 各濃度精油液體于凹玻片中，清水為空白對照，加入100 μL 孢子懸浮液，將凹玻片置于25 ℃PDA 培養(yǎng)基的培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12 h，統(tǒng)計孢子萌發(fā)情況，計算萌發(fā)率和抑制率[28]。

萌發(fā)率/%=（萌發(fā)孢子數(shù)/孢子數(shù)）×100

抑制率/%=（對照組萌發(fā)率-處理組萌發(fā)率）/對照組萌發(fā)率×100

1.4 設(shè)計試驗

1.4.1 單因素試驗

研究萃取溫度、原料顆粒度、溶劑種類、料液比等因素對丁香精油收率的影響，篩選影響丁香精油收率的較優(yōu)值，著重篩選最優(yōu)萃取溶劑。

1.4.2 U6（64）均勻設(shè)計法

采用均勻設(shè)計法，篩選出影響丁香精油收率的因素（萃取溫度、原料顆粒度、溶劑種類、料液比）的優(yōu)值。以優(yōu)化有機溶劑萃取丁香精油工藝。均勻設(shè)計法試驗設(shè)計見表1。

表1 有機溶劑萃取丁香精油工藝均勻設(shè)計試驗U6（64）水平表Table 1 Organic solvent extraction and extraction of lilac essential oil process uniform design test U6（64）level

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 溶劑種類對丁香精油收率的影響

表2 和圖1 為采用萃取溫度為80 ℃、丁香花蕾顆粒度110 目、料液比為1 ∶15（g/mL）條件下溶劑種類對丁香精油收率的影響。

表2 溶劑種類對丁香精油收率的影響Table 2 Effects of solvents on the yield of clove essential oil

圖1 溶劑種類對丁香精油收率的影響Fig.1 Effect of solvent type on yield of clove essential oil

溶劑種類不同，精油收率存在明顯差異，精油質(zhì)量也有較大不同[19]。其中只有在正己烷的條件下，萃取的丁香精油品質(zhì)最好，丁香精油呈現(xiàn)澄清的金黃色，流動性好，具有丁香芬芳氣息。冰醋酸驗證在弱酸環(huán)境中在一定程度上破壞了精油品質(zhì)，無水乙醇、無水乙醚、丙酮均存在不同程度的雜質(zhì)，這是由于丁香中的一些蠟、油脂、膠質(zhì)、樹脂等成分在回流中溶解在有機溶劑中，石油醚提取的精油品質(zhì)稍遜與正己烷，精油呈現(xiàn)淡綠色。從溶劑極性看（乙酸＞乙醇＞乙醚＞丙酮＞石油醚＞正己烷）而丁香酚、β-石竹烯和乙?；∠惴泳鶎儆谌鯓O性或非極性物質(zhì)，因此正己烷可以作為最優(yōu)萃取溶劑。

2.1.2 萃取溫度對丁香精油收率的影響

圖2 為采用正己烷作為有機溶劑、料液比 1∶15（g/mL）、丁香花蕾顆粒度110 目條件下萃取溫度對丁香精油收率的影響。

圖2 萃取溫度對丁香精油收率的影響Fig.2 Influence of extraction temperature on yield of clove essential oil

圖2 中表明在一定條件下精油收率隨溫度的提高不斷增加，但到達一定溫度下精油收率出現(xiàn)下降。主要是隨溫度的提高，溶劑回流速率不斷增加，回流時間降低，大大縮短了精油氧化過程。當(dāng)溫度過高時不僅破壞精油結(jié)構(gòu)，同時加快了精油氧化速率，不僅造成精油收率下降，同時嚴重影響精油品質(zhì)。

2.1.3 原料顆粒度對丁香精油收率的影響

圖3 為采用萃取溫度為80 ℃、正己烷為有機溶劑、料液比為1 ∶15（g/mL）條件下原料顆粒度對丁香精油收率的影響。

圖3 顆粒度對丁香精油收率的影響Fig.3 Effect of particle size on yield of clove essential oil

由圖3 可知，丁香花蕾在110 目時精油收率最大，為23.59%。隨著顆粒度的增加，提高了原料與有機溶劑的接觸面積，增加了傳質(zhì)速率，提高精油收率。當(dāng)顆粒度繼續(xù)增加時，表面張力增大，精油收率略有下降。

2.1.4 料液比對丁香精油收率的影響

圖4 為采用萃取溫度為80 ℃、丁香花蕾顆粒度110 目、正己烷為有機溶劑條件下料液比對丁香精油收率的影響。

圖4 料液比對丁香精油收率的影響Fig.4 Effect of material liquid ratio on yield of clove essential oil

由圖4 可知，隨著溶劑體積的增加，提高了精油中酚類物質(zhì)的溶解，即提高了精油中有效成分的含量。但隨著溶劑體積的不斷增加，溶劑回流時間不斷提到，造成丁香精油的部分氧化，因此破壞了精油品質(zhì)，降低了精油收率。

2.2 均勻設(shè)計法試驗結(jié)果分析

利用均勻設(shè)計法進行有機溶劑萃取丁香精油試驗，丁香精油的收率結(jié)果如表3 所示。采用Excel 軟件對試驗結(jié)果進行分析，得到回歸結(jié)果。

表3 有機溶劑萃取萃取丁香精油工藝U6（64）均勻設(shè)計試驗的丁香精油收率Table 3 Extraction and extraction of lilac essential oil by organic solvent extraction，the yield of lilac essential oil in the uniform design test of U6（64）

2.2.1 U6（64）試驗回歸

線性回歸結(jié)果如表4～表7 所示。

線性相關(guān)系數(shù)R=0.955 42，測定系數(shù)R2=0.912 828，F(xiàn)=6.981 013＞顯著水平臨界值F，線性可信；由表6 可以得知，線性回歸方程為：Y=0.284 3-0.004 5 X1+0.001 7X2+2.420 6X4。

表4 回歸統(tǒng)計Table 4 Regression statistics

表5 方差分析Table 5 Variance analysis

表6 參數(shù)表Table 6 Parameter table

表7 殘差分析表Table 7 Residual analysis table

根據(jù)線性回歸方程可得，各影響因素系數(shù)為正時，精油收率Y 增加，反之，精油收率Y 減小。因此當(dāng)因素X2（顆粒度）、因素X4（料液比）越大，因素X1（溫度）越小，精油收率越高。由此可以看出有機溶劑萃取丁香精油較優(yōu)工藝：有機溶劑選用正己烷、萃取溫度：80 ℃、顆粒度 110 目、料液比 1 ∶15（g/mL）。較優(yōu)工藝條件下丁香精油的理論收率為23.59%。

2.2.2 驗證試驗

有機溶劑選用正己烷、萃取溫度80 ℃、顆粒度110 目、料液比 1 ∶15（g/mL）的優(yōu)工藝條件下丁香精油的收率為22.98%。所得精油品質(zhì)好，呈棕黃色，清澈透明，含有濃郁丁香芬芳。主要活性成分含量：丁香酚13.27%、β-石竹烯1.26%和乙?；∠惴?.15%。

2.3 抑菌試驗

將分離青霉病原菌菌種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng) 7 d，菌落呈白色粉末狀，菌落鋪展，直徑70 mm，分生孢子頂端有瓶狀物，分生孢子呈近圓形，大小約為（3～3.5）μm×（2.5～4.5）μm。鑒定為Penicillum spp，青霉菌屬。

將分離漿胞病原菌在PDA 培養(yǎng)7 d，菌落呈淺灰色和棕褐色，菌落直徑70 mm 有同心紋，分生孢子以孔生方式生長，呈褐色倒棒狀，大小約為（22～41）μm×（5～15）μm。鑒定為半知菌亞門絲孢綱絲孢目交鏈孢屬。

2.3.1 丁香精油對致病菌孢子萌發(fā)抑制效果

丁香精油濃度為 0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μL/mL，對冬棗致病菌孢子萌發(fā)的抑制效果結(jié)果見表8。

表8 丁香精油對致病菌孢子萌發(fā)的抑制效果Table 8 Inhibitory effect of clove essential oil on pathogen germination

2.3.2 丁香精油抑制濃度

丁香精油最小抑菌濃度測定結(jié)果見表9。

表9 丁香精油最小抑菌濃度測定Table 9 Determination of minimum bacteriostatic and bactericidal concentration of clove essential oil

2.3.3 丁香精油抑菌效應(yīng)活性成分確定

有機溶劑萃取出的丁香精油其成分為：丁香酚13.27%、β-石竹烯1.26%和乙?；∠惴?.15%。測定各個活性成分對青霉菌的抑制測定，結(jié)果見表10。

丁香酚和乙?；∠惴訉η嗝咕哂休^強的抑制作用，350 mg/L 的丁香酚和300 mg/L 乙?；∠惴涌赏耆种魄嗝咕纳L；乙酰丁香酚的抑菌活性大于丁香酚；β-石竹烯對青霉菌沒有抑制效應(yīng)。

表10 丁香精油主要成分對青霉菌的抑制效應(yīng)Table 10 Inhibitory effect of main component oil on Penicillium

3 結(jié)論

1）單因素分析有機溶劑萃取丁香精油試驗顯示：最優(yōu)的有機溶劑為正己烷、萃取溫度、80 ℃、顆粒度110 目、料液比：1 ∶15（g/mL）。

2）有機溶劑萃取丁香精油U6（64）分析試驗中顯示：有機溶劑選用正己烷、萃取溫度：80 ℃、顆粒度110 目、料液比：1 ∶15（g/mL）為較優(yōu)工藝條件。最優(yōu)工藝條件下丁香精油的收率為22.98%，丁香精油主要成分及含量：丁香酚13.27%、β-石竹烯1.26%和乙酰基丁香酚1.15%。

3）丁香油對青霉菌、漿胞的最小抑菌濃度為：2.0 μL/mL 和 2.5 μL/mL。

4）丁香精油活性成分中，乙酰丁香酚的抑菌活性大于丁香酚，350 mg/L 的丁香酚和300 mg/L 乙?；∠惴涌赏耆种魄嗝咕纳L，β-石竹烯對青霉沒有抑制效應(yīng)。