龍山地區(qū)干豆豉真菌多樣性研究

倪慧，王玉榮，尚雪嬌，張振東，周書楠，郭壯

（湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北襄陽(yáng)441053）

豆豉，古稱“嗜”或“幽菽”，是以黃豆或黑豆為主料，添加食鹽、辣椒和白酒等發(fā)酵而成的一種傳統(tǒng)特色調(diào)味制品[1]。豆豉中含有的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽和酶提取物等具有降血壓[2]、溶血栓[3]以及預(yù)防和治療過(guò)敏性皮炎等功效[4]。我國(guó)各地一直以來(lái)都有制作和食用豆豉的習(xí)慣，不同地區(qū)制作豆豉的工藝不同，成品種類繁多，根據(jù)含水量多少或體態(tài)可將其分為干豆豉、豆豉和水豆豉，其中干豆豉是指將發(fā)酵完成的豆豉進(jìn)行干燥使水分降低至35%以下的產(chǎn)品[5]。

除富含乳酸桿菌、乳酸球菌、葡萄球菌和芽孢桿菌等細(xì)菌外[6-7]，豆豉中富含的酵母和霉菌等真菌對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)的形成亦有著積極的作用[8]，因而對(duì)豆豉中真菌微生物多樣性進(jìn)行解析是極為必要的。柳陳堅(jiān)等采用焦磷酸高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)云南普洱市豆豉中的真菌均為假絲酵母屬（Candida）[9]；Zhang W 等采用 Illumina MiSeq 分析發(fā)現(xiàn)甘肅地區(qū)豆豉中的真菌有畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）、紅冬孢酵母屬（Rhodosporidium）和亞羅酵母屬（Yarrowia）[10]；Lin Y 等采用同樣的方法研究江西豆豉發(fā)酵過(guò)程中的真菌變化，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)真菌屬為曲霉（Aspergillus）和立克次霉屬（Lichtheimia）[11]；任璐等從永川和三臺(tái)毛霉型豆豉中分離出產(chǎn)β－葡萄糖苷酶、纖維素酶和蛋白酶能力不同的 2 株總狀毛霉（Mucorracemosus racemosus）[12]。上述研究的開展，均表明豆豉中存在著豐富的真菌類群。

龍山縣位于湖南省湘西土家苗族自治州北部，區(qū)位獨(dú)特，具有較為獨(dú)特的飲食習(xí)俗[13]。本研究以采集自湘西州龍山縣傳統(tǒng)發(fā)酵干豆豉為研究對(duì)象，采用第二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其中真菌群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行分析，以期為當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)發(fā)酵食品中菌種資源發(fā)掘及應(yīng)用提供一定理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

干豆豉：于2018 年12 月采集自湖南省湘西土家苗族自治州龍山縣中街農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)市場(chǎng)、民安鎮(zhèn)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和步行街農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，編號(hào)依次為L(zhǎng)S1～LS5；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA 基因組提取試劑盒：德國(guó) QIAGEN 公司；FastPfu Fly DNA Polymerase、dNTPs Mix、5×Trans StartTM、FastPfu Buffer、5×PCR Buffer：北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA 1000 試劑盒：美國(guó)Agilent 公司；6×Lodding Buffer：天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；111860 瓊脂糖：香港基因有限公司。

ND-2000C 微量紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Nano Drop公司；5810R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf 公司；VeritiTM96 孔梯度PCR 擴(kuò)增儀：美國(guó)AB 公司；PowerPacTMBasic 穩(wěn)壓儀、DCodeTMSystem、UVPCDS-8000 凝膠成像分析系統(tǒng)：美國(guó)BIO-RAD 公司；DYY-12 電泳儀：北京六一儀器廠；MiSeq PE300 高通量測(cè)序平臺(tái)：美國(guó)Illumina 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 干豆豉樣品采集及前處理

樣品采集后分裝在50 mL 無(wú)菌離心管中置于-80 ℃條件下備用。

1.2.2 樣品微生物基因組DNA 提取

干豆豉樣品微生物基因組DNA 的提取方法參照DNA 基因組提取試劑盒說(shuō)明書中的操作步驟進(jìn)行，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳（120 V，30 min）和微量紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的DNA 的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)，合格的DNA 存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 真菌18S rDNA 擴(kuò)增與測(cè)序

正向和反向引物分別為SSU0817F（5’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’）和 SSU1196R（5’-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’）且在正向引物中加入核苷酸標(biāo)簽（Barcode）。擴(kuò)增體系及程序參照胥偉等[14]和陳慶金等[15]的方法進(jìn)行操作：20 μL 的擴(kuò)增體系中有DNA 模板 10 ng，5×PCR Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mix 2 μL，5 μmol/L SSU0817F 和 SSU1196R 各 0.8 μL，5 U/μL DNA 聚合酶 0.4 μL 以及無(wú)菌無(wú)酶超純水12 μL，將體系混勻后進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增第一步：95 ℃預(yù)變性 3 min；第二步：95 ℃變性 30 s，55 ℃復(fù)性 30 s，72 ℃延伸 45 s；第三步：72 ℃維持 10 min 以使 DNA 鏈完全延伸，其中，第二個(gè)步驟需循環(huán)30 次。擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定合格且純化后寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

將兩條成對(duì)序列（reads）進(jìn)行拼接，然后參照文獻(xiàn)[16]中的方法對(duì)拼接后的序列進(jìn)行質(zhì)控和篩選。以Barcode 為參照將各reads 劃分到不同樣品中，切除Barcode 和引物，過(guò)濾短序列。利用QIIME[17]分析平臺(tái)對(duì)樣品中微生物多樣性進(jìn)行分析，用UCLUST 軟件[18]將相似度不小于97%的序列劃分至同一個(gè)操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）中，然后從每個(gè)OTU 中挑選代表性序列使用SILVA 數(shù)據(jù)庫(kù)[19]進(jìn)行物種注釋。樣品真菌豐度和多樣性以超1 指數(shù)、發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和香農(nóng)指數(shù)等指表進(jìn)行評(píng)估。在本研究中將樣品中平均相對(duì)含量大于1.0%的真菌門或?qū)俣x為優(yōu)勢(shì)真菌們或?qū)?，將平均含量小?%的真菌門或?qū)贇w類于“其他的”。

利用Origin2017 和Excel 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并繪制折線圖分析測(cè)序深度。韋恩圖（Veen）使用Veeny2.1.0 在線繪制（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）用于顯示個(gè)樣品間特有和共有的OTU 數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)

本研究首先以香農(nóng)指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)為參照對(duì)測(cè)序條件及深度進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 香農(nóng)指數(shù)曲線和稀疏曲線Fig.1 The map of Shannon index curve and rarefaction curve

由圖1 可知，隨著測(cè)序量的增加，香農(nóng)指數(shù)逐漸增大，說(shuō)明測(cè)序量越大，樣品中真菌豐富度越高。與之不同的是，當(dāng)測(cè)序量大到7 500 條左右時(shí)稀釋曲線已逐漸趨于平穩(wěn)，表明測(cè)序量足夠，樣品中的真菌已基本全部被覆蓋。本研究從5 個(gè)傳統(tǒng)發(fā)酵干豆豉樣品中共檢測(cè)出82 541 條（100%相似度）有效序列，測(cè)序深度合理，可用于進(jìn)一步分析。

作為反映生態(tài)學(xué)中生物多樣性的重要指標(biāo)之一，超1 指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)等Alpha 多樣性指數(shù)常用于顯示某一特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)生物的均勻度和豐富度。各樣品中檢測(cè)出的序列數(shù)、OTU 數(shù)、超1 指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)值如表1 所示。

表1 樣品真菌測(cè)序概況Table 1 Statistics analysis of sample fungal sequencing results

由表 2 可知，LS1、LS2、LS3、LS4 和 LS5 測(cè)得有效序列數(shù)分別為 43 848、55 757、44 191、53 906 和 44 293條，OTU 數(shù)分別為 1 080、1 512、1 525、1 636 和 1 361個(gè)。香農(nóng)指數(shù)的值是 LS4＞LS3＞LS5＞LS2＞LS1，說(shuō)明在所有樣品中LS4 中真菌多樣性最高，LS1 最低。超1 指數(shù)的值是 LS3＞LS5＞LS2＞LS1＞LS4，說(shuō)明 LS3 中真菌豐富度最高，LS4 最低。香農(nóng)指數(shù)和超1 指數(shù)的平均值分別為5.51±0.76 和4 128±332，表明龍山干豆豉中含有較為豐富的真菌菌群，且不同樣品間的數(shù)目和均勻度都存在一定差異。

2.2 樣品真菌OTU分析

納入本研究的樣品中檢測(cè)出的82 541 條高質(zhì)量序列在97%的相似水平下可歸并至5 501 個(gè)OTU 中，各樣品中獨(dú)有或樣品間共有的OTU 數(shù)如圖2 所示。

圖2 干豆豉中共有和獨(dú)有OTU 分析Fig.2 Common and unique OTU analysis in dried douchi

由圖2 可知，Veen 圖重疊部分較多，各樣品間存在復(fù)雜的數(shù)目不等的OTU 數(shù)，LS1～LS5 中獨(dú)有的OTU數(shù)分別為 705、754、776、960 和 1 051 個(gè)，而 5 個(gè)樣品中共有的OTU 數(shù)僅為113 個(gè)，但其所包含的序列數(shù)占總序列數(shù)的64.68%。這表明樣品間真菌種類和數(shù)量存在較大差異但共有的真菌數(shù)量較多。這與譚強(qiáng)來(lái)等[20]研究的江西豆豉中的真菌OTU8 個(gè)，真菌種類較單一的結(jié)論存在一定差異。這可能是由于其采集的樣品來(lái)源于食品公司，是經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)而來(lái)，生產(chǎn)環(huán)境要比農(nóng)戶自制嚴(yán)格，從而降低了外界真菌進(jìn)入產(chǎn)品中的可能性。

本研究進(jìn)一步對(duì)核心優(yōu)勢(shì)OTU 在各樣品中的分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 核心優(yōu)勢(shì)OTU 在各樣品中的相對(duì)含量Fig.3 The relative content of core dominant OTU in each sample

由圖3 可知，在各樣品中均存在且相對(duì)含量大于1.0%的OTU 即核心優(yōu)勢(shì)OTU 有9 個(gè)，這些OTU 在不同樣品中的分布不同。在所有樣品中LS1 中OTU3388的相對(duì)含量最高，OTU3018 的相對(duì)含量最低；OTU1774在LS2 和LS3 中的相對(duì)含量也要明顯高于其他樣品，值得注意的是LS5 中核心優(yōu)勢(shì)OTU 的累積相對(duì)含量要明顯低于這些OTU 在其他樣品中的比例。這與圖2分析結(jié)果一致，即LS5 中獨(dú)有OTU 數(shù)要高于其他樣品。進(jìn)一步對(duì)核心OUT 間的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 核心OUT 相關(guān)性分析Fig.4 The correlation analysis of core OUTs

由圖4 左側(cè)和上方的聚類分析可知，樣品中的9 個(gè)核心 OTU 可分為 3 個(gè)聚類，OTU3658 和 OTU5393 為一類，OTU978、OTU84、OTU1774 和 OTU3018 為一類，OTU3388、OTU93 和OTU1664 為一類。從熱圖中可以看出，OTU84 與 OTU3018 呈顯著正相關(guān)（p<0.05），與OTU978 呈極顯著正相關(guān)（p<0.001），與 OTU1774 相關(guān)性非常顯著 （p<0.001）；OTU3018 與 OTU978 和OTU1774 的相關(guān)性均非常顯著（p<0.01）；OTU1664 與OTU33888 呈顯著正相關(guān)（p<0.05），OTU93 與 OTU3388相關(guān)性非常顯著（p<0.01）；OTU978 與 OTU1774 相關(guān)性非常顯著（p<0.01）；OTU5193 與 OTU3658 呈顯著正相關(guān)（p<0.05）。整體而言，各核心OTU 間相關(guān)性明顯，且主要呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。

2.3 物種注釋

使用SILVA 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)從每個(gè)OTU 中挑選的代表性序列進(jìn)行物種注釋并對(duì)其微生物學(xué)分類地位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)龍山干豆豉樣品中真菌門、綱、目、科和屬的數(shù)量分別為 7、13、22、26 和 31 個(gè)，各樣品中優(yōu)勢(shì)真菌門信息如圖5 所示。

圖5 不同樣品中各優(yōu)勢(shì)真菌門相對(duì)含量Fig.5 Relative content of dominant fungal phyla in different samples

LS1、LS2、LS3、LS4 和 LS5 中真菌門的數(shù)量分別為3、6、4、4 和 3 個(gè)，所鑒定出的真菌門有 Ascomycota、Basidiomycota、Mucoromycota、Zoopagomycota （捕蟲霉門）、Chytridiomycota（壺菌門）和 Nucletmycea（無(wú)對(duì)應(yīng)中文名），其中Chytridiomycota 和Nucletmycea 均只在LS2 中被檢測(cè)出且相對(duì)含量較低，僅為0.003 %和0.002 %。由圖 5 可知，Ascomycota、Basidiomycota 和Mucoromycota 的龍山干豆豉中的核心優(yōu)勢(shì)真菌門，三者累積平均相對(duì)含量高達(dá)96.32%。各優(yōu)勢(shì)真菌門在各樣品中的含量存在差異，Mucoromycota 在LS3 中的相對(duì)含量為5.68 %，而在LS5 中的相對(duì)含量?jī)H為0.01%。進(jìn)一步對(duì)各樣品中真菌屬進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 干豆豉中優(yōu)勢(shì)真菌屬相對(duì)含量Fig.6 Relative content of dominant fungi genera in dried douchi

由圖6 可知，龍山干豆豉中的優(yōu)勢(shì)真菌屬及其平均相對(duì)含量分別為 Aspergillus（26.17 %）、Candida（12.77 %）、Trichosporon（10.40 %）、Pichia（8.56 %）、Kluyveromyces（6.56%）、Yamadazyma（5.50%）、Cryptococcus（隱球酵母屬，4.76%）、Galactomyces（耐堿酵母屬，3.68%）、Cladosporium（枝孢屬，2.26%）、Wallemia（節(jié)擔(dān)菌屬，2.24%）和 Rhizopus（米根霉屬，1.20%）。其中，在LS1 中未檢測(cè)到Cryptococcus 和Wallemia，LS3中未檢測(cè)到Cryptococcus，LS4 中未檢測(cè)到Cryptococcus 和 Cladosporium。Aspergillus、Candida、Trichosporon、Pichia、Kluyveromyces、Yamadazyma、Galactomyces 和Rhizopus 作為核心優(yōu)勢(shì)真菌存在于所有樣品中，且并未發(fā)現(xiàn)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的真菌屬。結(jié)合圖4 可知各核心真菌間相互作用，共同形成龍山干豆豉獨(dú)特品質(zhì)。此外，所有樣品中有14.34%的序列不能鑒定到屬水平，表明該地干豆豉中仍有大量的真菌資源未被發(fā)掘。

3 結(jié)論

本研究中，從龍山干豆豉中檢測(cè)出有效真菌序列82541條，劃分的OTU 數(shù)為5501個(gè)。各樣品中核心優(yōu)勢(shì)真菌門極其平均相對(duì)含量分別為Ascomycota（73.01%）、Basidiomycota（20.42 %）和 Mucoromycota（2.89 %），在發(fā)現(xiàn)的54 個(gè)真菌屬中有8 個(gè)為核心優(yōu)勢(shì)真菌屬：Aspergillus、Candida、Trichosporon、Pichia、Kluyveromyces、Yamadazyma、Galactomyces 和 Rhizopus。由此可見，龍山干豆豉中真菌多樣性較高，后續(xù)研究中采用純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)其中蘊(yùn)含的菌株進(jìn)行挖掘保護(hù)，同時(shí)積極開展相關(guān)菌株的應(yīng)用研究極為必要。