蛹擬青霉發(fā)酵金針菇菇柄過(guò)程中主要活性物質(zhì)及抗氧化活性的動(dòng)態(tài)變化

朱蘊(yùn)蘭，陳宏偉，陳安徽，邵穎，李文，秦杰

（徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇省食品生物加工工程技術(shù)研究中心，江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州221111）

金針菇（Flammulina velutipes（Fr.）Sing）是人們熟知的一種食用菌，富含糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷酸、維生素和硒鋅鐵等微量元素，具有增強(qiáng)記憶力、促進(jìn)發(fā)育、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗過(guò)敏等多種功能[1-9]。隨著人們對(duì)金針菇的需求，其產(chǎn)量逐年遞增，2016 年國(guó)內(nèi)產(chǎn)量達(dá)到266.93 萬(wàn)噸，預(yù)計(jì)到2020 年將達(dá)到400萬(wàn)噸左右[10]。但金針菇在商品化出售之前，要做切根處理，產(chǎn)生的廢菇柄每年可達(dá)30 萬(wàn)噸～35 萬(wàn)噸。這些廢棄菇柄一般直接扔掉或被用作飼料，不但產(chǎn)生了環(huán)境污染問(wèn)題同時(shí)還造成了資源浪費(fèi)。已有研究表明金針菇菌腳蛋白質(zhì)含量為17.02 g/100 g DW，氨基酸種類齊全，含有人體必需的18 種氨基酸，其氨基酸含量為59.81%，必需氨基酸含量占總氨基酸含量的40.27%[11]，金針菇廢菇柄多糖提取率可達(dá)11.09%[12]，核苷酸提取率可達(dá)1.47%[13]。但目前對(duì)其深加工和商品化處理方面還未得到充分重視，目前對(duì)金針菇廢菇柄的研究主要集中在活性物質(zhì)蛋白質(zhì)、膳食纖維、多糖、氨基酸和核苷酸等的提取方面[11，13-17]，而利用廢菇柄進(jìn)行深加工的研究尚少[18]，如何充分利用金針菇廢菇柄資源和提高其科技含量增加其附加值，開(kāi)發(fā)金針菇廢菇柄產(chǎn)品具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義。

蛹擬青霉 （Paecilomyces militaris） 是蛹蟲(chóng) 草[Cordyceps militarise（L.）Link]的無(wú)性型，其菌絲體和發(fā)酵產(chǎn)物含有與蛹蟲(chóng)草相似的蟲(chóng)草多糖、蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸等成分，具有增強(qiáng)免疫力、抗衰老、抗疲勞、降血脂、防止血栓形成，抗病毒、抗菌、護(hù)肝等作用[19-20]。蛹擬青霉具有較強(qiáng)的生物轉(zhuǎn)化能力，利用其生理活動(dòng)將發(fā)酵基質(zhì)中的有效成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生新的成分，從而產(chǎn)生新的性質(zhì)和功能，即雙向固體發(fā)酵[21-22]。閆梅霞等[23]研究了蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵人參產(chǎn)物的有效成分含量，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵人參須的多糖、蛋白質(zhì)、總皂苷含量均高于發(fā)酵前。賀曉玉[24]研究了蛹蟲(chóng)草菌固體發(fā)酵五味子藥渣工藝的優(yōu)化及其產(chǎn)物對(duì)斷奶仔豬，試驗(yàn)表明，發(fā)酵條件優(yōu)化后的發(fā)酵產(chǎn)物中蟲(chóng)草素含量高達(dá)5.12 mg/g；多糖含量為2.87%，相比發(fā)酵前五味子藥渣中多糖含量提高24.96%。彭志妮等[25]利用蛹蟲(chóng)草對(duì)大豆進(jìn)行了固體發(fā)酵，研究了發(fā)酵菌質(zhì)的抗氧化性變化，結(jié)果表明，發(fā)酵菌質(zhì)在22 d 抗氧化性能達(dá)到最大，ABTS+自由基清除率比發(fā)酵初期提高近3 倍，亞鐵還原能力（Ferric Reducing Ability of Plasma，F(xiàn)RAP）值提高近 2 倍。本研究以金針菇廢菇柄為發(fā)酵基質(zhì)，利用蛹擬青霉為發(fā)酵菌種，對(duì)金針菇菇柄進(jìn)行轉(zhuǎn)化，研究發(fā)酵菌質(zhì)多糖、蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸、蛋白質(zhì)、氨基酸等活性物質(zhì)及總還原力和發(fā)酵菌質(zhì)對(duì)自由基的清除能力隨發(fā)酵時(shí)間的變化情況，為進(jìn)一步高值化綜合利用蛹蟲(chóng)草和金針菇廢菇柄，研發(fā)相關(guān)高附加值產(chǎn)品，減少環(huán)境污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

蛹擬青霉菌種：江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室保藏；金針菇廢菇柄：徐州康盛食用菌有限公司提供。

1.1.2 試劑

DL-丙氨酸、L-鼠李糖、醋酸銨、苯酚、蛋白胨、甘露醇、高碘酸鈉、甲基紅、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、硫酸銅、濃硫酸、硼酸、葡萄糖、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、鹽酸、乙醇（95%）、茚三酮、氯仿、正丁醇、蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸、乙酸、三氯乙酸（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；維生素B1、乙酰丙酮、蛋白胨、酵母浸出汁、瓊脂粉（均為生物試劑）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

NaIO4溶液：0.32 g NaIO4溶于 0.12 mol/L 的 HCl溶液中，定容至100 mL。

Nash 試劑：75 g 醋酸銨蒸餾水溶解，加1 mL 冰乙酸，1 mL 乙酰丙酮，定容至500 mL。

75 μmol/L 的 DPPH 溶液：稱取 3 mg DPPH 用100 mL 乙醇溶解即可。

1.2 儀器與設(shè)備

CW-2000 型超聲波微波協(xié)同萃取儀：新拓微波溶洋測(cè)試技術(shù)有限公司；TU-1810 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；HYGⅡ型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海欣蕊自動(dòng)化有限公司；HH.BII.600型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；101-0E 型電熱恒溫干燥箱：北京市永光明醫(yī)療儀器；HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋、80-2 型臺(tái)式電動(dòng)離心機(jī)：常州國(guó)華電器有限公司；SW-CJ-2FD 型雙人單面垂直凈化工作臺(tái)：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FW80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；FA2104N 型電子分析天平：上海精密儀器有限公司；SH220 石墨消解儀：海能儀器；LJG-18A 型冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵：上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司；Heating Bath：SENCO Technology Co.，Ltd。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基

1）斜面培養(yǎng)基——薩氏培養(yǎng)基（Sabouraud dextrose agar with yeast extract，SDAY）：4%葡萄糖，1 %蛋白胨，1%酵母浸膏，2%瓊脂。

2）液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5 %，KH2PO40.2 %，硫酸鎂0.1 %，維生素B110 mg/L，蒸餾水 1 000 mL，pH6.8。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基：金針菇廢菇柄段95 g，蛋白胨0.5 g，水 5%，pH 6.8；

1.3.2 菌種活化與種子液制備

將蛹擬青霉菌種接種到SDAY 斜面培養(yǎng)基上，置于22 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d～5 d，待菌絲長(zhǎng)滿試管即可。

種子液制備：在500 mL 三角瓶中裝200 mL 液體種子培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌后接入經(jīng)活化后的蛹擬青霉斜面菌塊 3 塊～5 塊，每塊大小為 3 mm2～5 mm2，22 ℃，120 r/min 恒溫?fù)u瓶培養(yǎng) 3 d～6 d 即可。

1.3.3 固態(tài)發(fā)酵

料液比 1 ∶1.5（g/mL）；料層厚度 2 cm；接種量15 %；發(fā)酵溫度22 ℃；新鮮金針菇廢菇柄切成0.5 cm段，并按試驗(yàn)設(shè)計(jì)添加其它成分，滅菌后接入發(fā)酵菌種，置于恒溫箱中培養(yǎng)，定時(shí)取樣，冷凍干燥后粉碎，過(guò)40 目篩子后備用。

空白對(duì)照處理：取切成0.5 cm 段的新鮮金針菇廢菇柄，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的蛋白胨，料液比1∶1.5（g/mL），料層厚度2 cm，pH 6.8，滅菌后不接種，置于22 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按樣品處理方法進(jìn)行處理并測(cè)定。

1.3.4 多糖的測(cè)定

1.3.4.1 多糖的提取

采用超聲－微波協(xié)同輔助提取方法，按文獻(xiàn)[26]進(jìn)行。精密稱取0.5 g 樣品粉末，加50 mL 水，混勻，用超聲波微波協(xié)同萃取儀提取20 min，然后4 000 r/min 離心10 min，取上清液，沉淀加水按上述方法重復(fù)提取3 次，合并上清液，將上清液濃縮至1/3。向濃縮過(guò)的上清液中加入等體積的氯仿-正丁醇4 ∶1（體積比）混合液，震動(dòng)搖晃20 min～30 min，靜置后去掉沉淀，重復(fù)3次，留取上層水相。向留取水相中加入3 倍95%乙醇，放入 4 ℃冰箱靜置 12 h，4 000 r/min 離心 10 min，得到沉淀，然后再將沉淀加入100 mL 的蒸餾水復(fù)溶，取1 mL 復(fù)溶的多糖溶液于50 mL 容量瓶中定容，備用。

1.3.4.2 多糖的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定。

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

取不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液各2 mL，分別加入6 %的苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入5.0 mL 濃硫酸，搖勻，靜置5 min。置沸水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在490 nm 下測(cè)定其吸光度。

用葡萄糖濃度作為橫坐標(biāo)，A490nm作為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，并建立回歸方程。

2）樣品多糖含量的測(cè)定

精密吸取樣品處理液1 mL，置于試管中，加蒸餾水至2 mL。按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟進(jìn)行處理，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在490 nm 下測(cè)定其吸光度，以空白校正零點(diǎn)。

1.3.4.3 多糖含量計(jì)算

1.3.5 蟲(chóng)草素含量測(cè)定

采用高壓液相色譜法，按文獻(xiàn)[27]方法測(cè)定。色譜柱：Waters C18（4.6 mm× 150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：15%甲醇+水；流速 1 mL/min；柱溫：20 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，10 μL 進(jìn)樣。

標(biāo)曲制作：精密稱取蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，用純水定容于5 mL 容量瓶中，配制成0.2 mg/mL 的蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作為母液進(jìn)行所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)品配置。釆用逐級(jí)稀釋法，依次吸取一定量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液按要求稀釋到EP 管中，使蟲(chóng)草素濃度分別為150、100、50、25、0 μg/mL。分別吸取上述溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄12.439 min 時(shí)色譜波峰呈現(xiàn)的峰面積。并求蟲(chóng)草素濃度和峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。

樣品測(cè)定：精確稱取1 g 凍干發(fā)酵菌質(zhì)粉溶于100 mL 50%的乙醇，選用微波-超聲波協(xié)同萃取儀提取蟲(chóng)草素。微波時(shí)間為60 s，功率為200 W，提取后離心，用 0.2 μm 水相微孔濾膜壓濾，取過(guò)濾液 10 μL 進(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性、外標(biāo)法定樣，根據(jù)回歸方程計(jì)算提取液的蟲(chóng)草素含量（μg/mL），并按公式計(jì)算得出樣品中的蟲(chóng)草素含量。

1.3.6 蟲(chóng)草酸含量測(cè)定

采用比色法測(cè)定。按文獻(xiàn)[28]進(jìn)行。

樣品蟲(chóng)草酸提?。壕芊Q取0.5 g 樣品粉末，加50 mL 70%乙醇，混勻，用微波-超聲波協(xié)同萃取儀常溫下微波萃取80 s，然后離心取上清液，重復(fù)提取2 次，合并提取液，混勻，提取液用蒸餾水定溶至100 mL，待測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取濃度為0.05 mg/mL 的甘露醇標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別用蒸餾水補(bǔ)充至1 mL，然后分別加入1 mL NaIO4溶液，混勻后，靜止10 min，再加入2 mL 1.0 g/L L-鼠李糖溶液，充分混勻后加入Nash 試劑4 mL，50 ℃水浴保溫15 min，取出后快速冷卻至室溫，用10 mm 光程的比色皿，在412 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度，以蟲(chóng)草酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。

樣品測(cè)定：精密量取待測(cè)樣品溶液0.03 mL，加入10 mL 刻度試管中，補(bǔ)水至1 mL，空白對(duì)照管加蒸餾水1 mL，然后按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法進(jìn)行，測(cè)定其吸光度。蟲(chóng)草酸含量按公式計(jì)算。

1.3.7 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用凱氏定氮法測(cè)定，按文獻(xiàn)[27]方法進(jìn)行。

蛋白質(zhì)含量（g）=[總氮含量（g）-非蛋白氮含量（g）]×6.25

總氮含量計(jì)算：

式中：x 為樣品中氮含量，g/100 g；V1為樣品滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V2為空白滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V3為測(cè)定樣品時(shí)消化液的體積，mL；c 為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L；14.008 為每摩爾氮原子質(zhì)量，g/mol；m 為樣品的質(zhì)量，g。

非蛋白氮含量測(cè)定：采用三氯乙酸法測(cè)定非蛋白氮。按文獻(xiàn)[27]方法進(jìn)行。

1.3.8 氨基酸含量測(cè)定

采用茚三酮比色法，按文獻(xiàn)[27]方法進(jìn)行測(cè)定。

氨基酸含量的計(jì)算：

1.3.9 總還原力測(cè)定

按文獻(xiàn)[29]方法進(jìn)行。

發(fā)酵菌質(zhì)預(yù)處理：取發(fā)酵菌質(zhì)粉末5 g 加入三角瓶中，加水50 mL，超聲波提取30 min，4 000 r/min 離心10 min，取上清液，定容至50 mL，備用。

還原力測(cè)定方法：采用鐵氰化鉀法測(cè)總還原力。向試管中依次加入2.5 mL pH 6.6 的磷酸鹽緩沖液，待測(cè)樣品0.5 mL，1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合后50 ℃水浴30 min，迅速冷卻后加入10%三氯乙酸2.5 mL，混勻后3 000 r/min 離心10 min，取上清液2.5 mL 加入蒸餾水2.5 mL 和FeCl30.1%溶液0.5 mL，靜止10 min，在波長(zhǎng)為700 nm 下測(cè)定溶液吸光值，用吸光值表示還原力，吸光值越大還原力越強(qiáng)。

式中：A樣品是樣品反應(yīng)液的吸光值；A空白是以去離子水代替樣品的溶液的吸光值。

1.3.10 DPPH 自由基清除能力測(cè)定

DPPH 自由基清除能力測(cè)定按文獻(xiàn)[30]方法進(jìn)行。精確稱取1 g 凍干菌質(zhì)粉溶于100 mL 50 %的乙醇，用微波-超聲波協(xié)同萃取儀微波提取60 s，功率為200 W，4 000 r/min 離心5 min 后取上清液，定容至100 mL，然后取1 mL 定容到10 mL 容量瓶中，待測(cè)。

取待測(cè)樣品0.3 mL 于10 mL 試管中，加入0.2 mL的乙醇溶液，2.5 mL 的DPPH 溶液混合，置于暗處30 min，在517 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)下列公式計(jì)算各樣品溶液對(duì)DPPH 自由基的清除率：

式中：A 為加樣品溶液與DPPH 溶液的吸光度；A0為不加樣品溶液的DPPH 溶液的吸光度；B 為不加DPPH 溶液的樣品溶液。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)試驗(yàn)所得的平均值，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。用Design-Expert 8.0.6.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌質(zhì)多糖含量的動(dòng)態(tài)變化

根據(jù)測(cè)定葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y =0.067x-0.043，R2=0.992，y 為 490 nm 下吸光度值，x 為葡萄糖濃度（mg/mL）。

經(jīng)測(cè)定和計(jì)算得發(fā)酵菌質(zhì)中多糖含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化情況如圖1 所示。

圖1 不同時(shí)間發(fā)酵菌質(zhì)中多糖含量Fig.1 The contents of polysaccharide in fermentation mycoplasm at different times

從圖1 可以看出，蛹擬青霉與金針菇廢菇柄進(jìn)行固體發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵菌質(zhì)多糖含量出現(xiàn)先降低然后升高最后平穩(wěn)降低的趨勢(shì)，這與其發(fā)酵過(guò)程中多糖的先期被降解利用有關(guān)，在發(fā)酵初期多糖被分解成小分子物質(zhì)，以便合成蛹擬青霉菌體生長(zhǎng)所需的物質(zhì)，中期由于蛹擬青霉自身的合成作用使多糖含量增加，后期由于菌體生長(zhǎng)緩慢或到達(dá)衰亡期，使多糖不能繼續(xù)合成，而使多糖含量有所減少。當(dāng)發(fā)酵28 d 時(shí)，發(fā)酵菌質(zhì)中多糖含量達(dá)到最高為717.68 mg/g，此時(shí)發(fā)酵菌質(zhì)多糖含量是對(duì)照組多糖含量的1.92 倍。試驗(yàn)組與對(duì)照組比較可知，對(duì)照組多糖基本沒(méi)有發(fā)生變化，且含量較低，經(jīng)方差分析，試驗(yàn)組和對(duì)照組多糖的含量變化具有顯著差異（p＜0.01）。

2.2 發(fā)酵菌質(zhì)蟲(chóng)草素含量的動(dòng)態(tài)變化

根據(jù)測(cè)定蟲(chóng)草素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y =41.42x+92.33，R2=0.997，y 為 260 nm 下 12.439 min 峰面積，x 為蟲(chóng)草素濃度（μg/mL）。

經(jīng)測(cè)定和計(jì)算得發(fā)酵菌質(zhì)中蟲(chóng)草素含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化情況如圖2 所示。

圖2 不同時(shí)間發(fā)酵菌質(zhì)中蟲(chóng)草素含量Fig.2 The contents of cordycepin in fermentation mycoplasm at different times

從圖2 可以看出發(fā)酵菌質(zhì)中試驗(yàn)組的蟲(chóng)草素含量隨發(fā)酵時(shí)間增加不斷增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為28 d 時(shí)，蟲(chóng)草素含量達(dá)到最大為90.9 μg/g，之后開(kāi)始下降，而對(duì)照組無(wú)蟲(chóng)草素產(chǎn)生。方差分析表明試與對(duì)照組存在顯著差異（p＜0.01）。試驗(yàn)表明蟲(chóng)草素含量的變化與發(fā)酵菌質(zhì)中蛹擬青霉菌體的生長(zhǎng)量相關(guān)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體數(shù)量不斷增加，當(dāng)?shù)竭_(dá)最大生長(zhǎng)點(diǎn)后，開(kāi)始下降，符合蛹擬青霉菌體的生長(zhǎng)規(guī)律，其產(chǎn)生的蟲(chóng)草素也是與蛹擬青霉菌體量分不開(kāi)的，蟲(chóng)草素的產(chǎn)生必定伴隨著蛹蟲(chóng)草菌體代謝量的增多，后期含量減少可能是由于蟲(chóng)草素不穩(wěn)定，產(chǎn)生分解所致。

2.3 發(fā)酵菌質(zhì)蟲(chóng)草酸含量的動(dòng)態(tài)變化

經(jīng)測(cè)定蟲(chóng)草酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=0.009 8x+0.015 3，R2=0.995 3，y 為 412 nm 下吸光度值，x 為蟲(chóng)草酸濃度（μg/mL）。

經(jīng)測(cè)定和計(jì)算得發(fā)酵菌質(zhì)中蟲(chóng)草酸含量如圖3 所示。

圖3 不同時(shí)間發(fā)酵菌質(zhì)中蟲(chóng)草酸含量Fig.3 The contents of cordycepic acid in fermentation mycoplasm at different times

從圖3 可知，試驗(yàn)組發(fā)酵菌質(zhì)中蟲(chóng)草酸含量隨發(fā)酵時(shí)間增加而增加，然后開(kāi)始下降，當(dāng)發(fā)酵28 d 時(shí)，蟲(chóng)草酸含量達(dá)到最大為25.6 mg/g，是對(duì)照組蟲(chóng)草酸含量的2.34 倍，對(duì)照組蟲(chóng)草酸含量基本保持不變，經(jīng)方差分析兩者具有顯著差異（p＜0.01）。蟲(chóng)草酸含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化情況與蛹擬青霉菌體生長(zhǎng)規(guī)律相似，表明了蟲(chóng)草酸的產(chǎn)生與蛹擬青霉菌體的代謝有關(guān)，后期含量減少可能是由于菌體代謝物質(zhì)不足，而將其分解作為代謝物質(zhì)進(jìn)行利用所致。

2.4 發(fā)酵菌質(zhì)蛋白質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化

經(jīng)測(cè)定和計(jì)算得發(fā)酵菌質(zhì)中蛋白質(zhì)含量隨時(shí)間變化情況如圖4。

圖4 不同時(shí)間發(fā)酵菌質(zhì)中蛋白質(zhì)含量Fig.4 The contents of protein in fermentation mycoplasm at different times

從圖4 可知，試驗(yàn)組發(fā)酵菌質(zhì)的蛋白質(zhì)含量變化較大，蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)先降低再升高，然后下降，最后平穩(wěn)的走勢(shì)，組間具有顯著差異（p＜0.01），而對(duì)照組蛋白質(zhì)含量變化不明顯（p＞0.01）。試驗(yàn)組與對(duì)照組間具有明顯著差異（p＜0.01）。當(dāng)發(fā)酵21 d 時(shí)試驗(yàn)組蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高396.6 mg/g，是對(duì)照組的2.39 倍。試驗(yàn)組出現(xiàn)蛋白質(zhì)含量的先期下降，然后升高，接著出現(xiàn)下降至平穩(wěn)的趨勢(shì)，表明培養(yǎng)初期蛋白質(zhì)被分解，以便蛹擬青霉菌體的生長(zhǎng)，出現(xiàn)蛋白質(zhì)含量下降的走勢(shì)，但隨著時(shí)間的增加，蛹擬青霉菌體開(kāi)始生長(zhǎng)，蛋白合成能力增加，使發(fā)酵菌質(zhì)蛋白含量增加，當(dāng)達(dá)到菌體穩(wěn)定期時(shí)，蛋白達(dá)到最高，然后菌體進(jìn)入衰亡期，使自身蛋白分解，表現(xiàn)出蛋白含量逐漸降低的趨勢(shì)。

2.5 發(fā)酵菌質(zhì)氨基酸含量的動(dòng)態(tài)變化

經(jīng)試驗(yàn)測(cè)得氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5，其回歸方程為：y=0.060 4x+0.060 5，R2=0.991 3。y 為吸光度值，x為氨基酸濃度（μg/mL）。

發(fā)酵菌質(zhì)中氨基酸含量如圖5 所示。

從圖5 可知，試驗(yàn)組氨基酸含量在發(fā)酵24 d 時(shí)達(dá)到最高為230.88 mg/g，是對(duì)照組的4.52 倍。試驗(yàn)組氨基酸含量出現(xiàn)隨發(fā)酵時(shí)間增加而增加，然后達(dá)到最高點(diǎn)后開(kāi)始降低，而對(duì)照組的氨基酸含量基本保持不變。試驗(yàn)組氨基酸含量從培養(yǎng)初期就逐漸開(kāi)始增加，表明蛹擬青霉菌體代謝分解了金針菇菇柄的組成蛋白質(zhì)產(chǎn)生了氨基酸用于自身的合成代謝，當(dāng)金針菇菇柄成分被分解完后達(dá)到平衡，后期由于蛹擬青霉的合成代謝活動(dòng)使氨基酸含量不斷減少。

圖5 不同時(shí)間發(fā)酵菌質(zhì)中氨基酸含量Fig.5 The contents of amino acid in fermentation mycoplasm at different times

2.6 發(fā)酵菌質(zhì)總還原力的動(dòng)態(tài)變化

在不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵菌質(zhì)還原力變化情況如圖6。

圖6 不同時(shí)間發(fā)酵菌質(zhì)還原力Fig.6 The reducing ability of fermentation mycoplasm in different time

從圖6 分析可知，不同時(shí)間的發(fā)酵菌質(zhì)還原力有顯著變化（p＜0.01），在開(kāi)始階段比較低，然后逐漸升高，在21 d 到28 d 期間達(dá)到最高，然后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)還原力出現(xiàn)了緩慢降低。而對(duì)照組的還原力沒(méi)有發(fā)生顯著變化（p＞0.05）。試驗(yàn)組還原力大小出現(xiàn)的變化情況，與多糖和蟲(chóng)草素含量的變化情況基本一致，可以認(rèn)定還原力主要是由多糖和蟲(chóng)草素產(chǎn)生的。

2.7 發(fā)酵菌質(zhì)對(duì)DPPH自由基清除能力的變化

發(fā)酵菌質(zhì)在不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)DPPH 自由基清除能力的變化情況如圖7。

圖7 發(fā)酵菌質(zhì)對(duì)DPPH 自由基的清除能力Fig.7 The capacity to scavenging DPPH free radical

從圖7 可以看出，金針菇菇柄發(fā)酵菌質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除能力表現(xiàn)為發(fā)酵初期有所降低，中期逐步增強(qiáng)，后期略有降低的趨勢(shì)（p＜0.01），而對(duì)照組基本保持平穩(wěn)（p＞0.05）。對(duì)DPPH 自由基的清除能力在發(fā)酵28 d 最高達(dá)到72.37%，比未發(fā)酵菌質(zhì)清除DPPH自由基的能力提高了59.5%，方差分析表明兩者有極顯著差異（p＜0.01）。對(duì)DPPH 自由基有清除能力的物質(zhì)主要是多糖和蟲(chóng)草素，從發(fā)酵菌質(zhì)多糖和蟲(chóng)草素的含量來(lái)看，在28 d 也是達(dá)到了最高，清除自由基能力與蟲(chóng)草素和多糖含量有關(guān)。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)蛹擬青霉對(duì)金針菇廢菇柄進(jìn)行固體發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵菌質(zhì)的活性物質(zhì)在不同培養(yǎng)時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化研究表明，發(fā)酵菌質(zhì)中活性物質(zhì)出現(xiàn)了峰谷變化，在發(fā)酵中期隨著時(shí)間的增加物質(zhì)含量逐漸增加，與未發(fā)酵的金針菇菌質(zhì)相比，主要成分和抗氧化能力均有大幅度增加，兩者具有顯著差異。各種活性物質(zhì)達(dá)到最大的發(fā)酵時(shí)間略有不同，多糖、蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸的含量均在28 d 達(dá)到最高，蛋白質(zhì)和氨基酸含量最高的發(fā)酵時(shí)間分別是21 d 和24 d。發(fā)酵菌質(zhì)的抗氧化能力在21 d～28 d 之間達(dá)到最高，對(duì)DPPH 的清除能力在28 d 達(dá)到最高，發(fā)酵菌質(zhì)的活性物質(zhì)變化與蛹擬青霉的菌體生長(zhǎng)量有相關(guān)性。發(fā)酵菌質(zhì)的抗氧化能力變化與活性物質(zhì)含量變化有關(guān)。本研究為進(jìn)一步探討蛹擬青霉對(duì)金針菇廢菇柄的發(fā)酵規(guī)律和進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)高值化蛹擬青霉及金針菇菇柄產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。