北極狐、貉、犬IFN-基因克隆及表達(dá)

李紫仟，廉士珍，胡博，張蕾，朱言柱，李滋睿，李偉，白雪，張海玲※

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112；2.吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司，吉林 長(zhǎng)春 130112)

干擾素是在1957年英國(guó)科學(xué)家Isaacsz研究流感病毒干擾現(xiàn)象時(shí)首次發(fā)現(xiàn)的[1]，它是由動(dòng)物細(xì)胞分泌的一種糖蛋白[2]。干擾素可以分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型[3]，其均對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答有著增強(qiáng)作用，對(duì)病毒也有著廣譜抗性作用[4]。干擾素屬于Ⅰ型干擾素，在臨床治療病毒性疾病以及自身免疫疾病等多種疾病中起到重要作用[5]。1993年美國(guó)食品和藥品管理局（FDA）組織批準(zhǔn)干擾素- 在多發(fā)性硬化癥治療中的應(yīng)用[6]。人IFN-也用于治療慢性丙型肝炎[7]、乙型肝炎[8]。雖然干擾素- 具有廣譜的抗病毒作用，但是其本身并不是一種抗病毒物質(zhì)，而是通過(guò)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白而發(fā)揮抗病的作用[9]。

隨著基因克隆技術(shù)的不斷突破，自1980年科學(xué)家成功克隆人成纖維細(xì)胞IFN（IFN-）后，豬、雞、鹿等的IFN-基因也得到克隆，并對(duì)其活性進(jìn)行了相關(guān)研究[10-12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，重組雞IFN-能減輕傳染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的法氏囊病變。而犬IFN-能夠抑制犬細(xì)小病毒的復(fù)制[13]。犬、狐貍和貉屬于同科不同屬動(dòng)物，不同動(dòng)物同種干擾素活性有一定的差異。截至目前，與犬同科的毛皮動(dòng)物狐貍和貉的干擾素-基因序列及抗病毒活性研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬對(duì)北極狐（Alopex lagopus）、貉（Nyctereutes procyonoides）、犬（Canine）IFN-基因進(jìn)行克隆、分析及表達(dá)，為開(kāi)發(fā)犬、狐貍和貉通用型重組IFN-并將其應(yīng)用于臨床治療提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 Escherichia coli JM109 感受態(tài)細(xì)胞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 pMD18-T 載體試劑、Ex Taq 聚合酶試劑、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶及植物血凝素（PHA）試劑、DNA Marker 試劑、蛋白Marker 試劑〔寶生物工程（大連）有限公司〕；RPMI1640 試劑（美國(guó)Gibco 公司）；淋巴細(xì)胞分離液（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院）；TRIzol細(xì)胞裂解液（美國(guó)Invitrogen公司）；膠回收試劑盒（杭州博日科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù) GenBank 上發(fā)表的犬IFN-cDNA 全序列（登錄號(hào)為AF126247）設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，擴(kuò)增片段561 bp，引物序列如下：IFN-F 為5'-atgaccagta gatgcatc-3'；IFN-R 為 5'-tcagttctggagataatc-3'。

1.2.2 北極狐、貉、犬外周血淋巴細(xì)胞制備及干擾素誘生 選取健康的試驗(yàn)動(dòng)物北極狐、貉、犬，在無(wú)菌條件下分別采取其外周抗凝血液5 mL，加入同等體積的RPMI 1640 培養(yǎng)液稀釋。按照1∶1 體積比，將稀釋的外周血緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液上層，水平離心機(jī)2 000 r/min 離心40 min。用滅菌長(zhǎng)針頭將中間白色細(xì)胞層吸出，置于無(wú)菌離心管中，加RPMI 1640 培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，1 500 r/min 離心 10 min，洗滌 2 次后，用含25g/mL PHA和10%小牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照計(jì)數(shù)結(jié)果將細(xì)胞懸液稀釋至1 107個(gè)/mL，分別加入24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將板置于CO2 培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.3 外周血淋巴細(xì)胞總RNA 的提取 收集誘導(dǎo)24 h后的淋巴細(xì)胞置于15 mL 離心管中，2 000 r/min 離心10 min，將沉淀物用1 mL TRIzol Reagent 重懸。加入1/5 TRIzol 體積氯仿，混勻后靜置3 min，12 000 r/min離心10 min，吸取上清，加入1/2 TRIzol 體積的異丙醇，混勻后放置 20℃沉淀1h，12000r/min離心15min，將沉淀物用75%乙醇重懸，并對(duì)其進(jìn)行洗滌1 次，12000 r/min離心10 min，倒置控干后用9.5L 0.1%DEPC處理的滅菌水溶解沉淀物，即獲得淋巴細(xì)胞總RNA。

1.2.5 表達(dá)載體構(gòu)建 以測(cè)序正確的TA 克隆質(zhì)粒為模板設(shè)計(jì)擴(kuò)增IFN-成熟肽基因的引物，上游引物和下游引物分別引入酶切位點(diǎn)，將酶切后的PCR產(chǎn)物與pET28a 載體連接，轉(zhuǎn)化到BL21 感受態(tài)菌，涂板，隨機(jī)挑取多個(gè)單個(gè)克隆菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.6 陽(yáng)性克隆菌株的誘導(dǎo)和鑒定 取測(cè)序鑒定陽(yáng)性的重組菌液，按照1∶100 的比例接種于新鮮的LB（含100g/mL 氨芐青霉素）培養(yǎng)基中，放置于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6～0.9，吸取1 mL 菌液作為對(duì)照，剩余菌液中加入IPTG，使IPTG 終濃度達(dá)1 mmol/L 繼續(xù)培養(yǎng)3 h 以上。12 000 r/m 離心5 min收集菌體，加入原菌液1/10 體積PBS 重懸菌，12 000 r/min離心10 min，洗滌3 次后用200L PBS重懸后與等量2 SDS 上樣緩沖液混勻，沸水煮沸5 min，以誘導(dǎo)前菌體和誘導(dǎo)空載體為對(duì)照，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 北極狐、貉、犬IFN-基因克隆

以PHA 誘導(dǎo)培養(yǎng)北極狐、貉、犬外周血淋巴細(xì)胞總RNA作為模板，經(jīng)RT-PCR 分別獲得北極狐、貉、犬IFN-基因。分別取RT-PCR 產(chǎn)物于1.5%（M/V）瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果顯示，獲得的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小均為561 bp，與理論預(yù)測(cè)的值大小一致，結(jié)果見(jiàn)圖1。重組質(zhì)粒酶切鑒定及PCR 鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2、3。

圖1 北極狐、貉、犬IFN- RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 IFN- RT-PCR amplification product of arctic fox,raccoon dog,canine

圖3 北極狐、貉、犬 -干擾素質(zhì)粒PCR 鑒定Fig.3 PCR identification of arctic fox,raccoon dog and dog IFN- plasmids

2.2 IFN-基因序列分析

應(yīng)用ExPASy-ProtParam tool 軟件預(yù)測(cè)了北極狐、貉和犬的IFN-含有5 個(gè)位點(diǎn)一致的半胱氨酸殘基位點(diǎn)，而水貂、雪貂和貓有4 個(gè)位點(diǎn)與其相同，這也可能造成IFN-構(gòu)象的改變。預(yù)測(cè)狐和犬含有5 個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，分別為46NGTT49、94NISI97、101NETT104、131NFTW134、136NRTL139，而貉只有 4 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)且組成，與狐和犬的完全一致，而94DISI97位不是潛在的糖基化位點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。糖基化位點(diǎn)的不同是否會(huì)引起貉與犬和狐的IFN-生物學(xué)功能差異有待進(jìn)一步研究。

表1 貉、北極狐和犬IFN-基因核苷酸變異位點(diǎn)Table 1 Nucleotide mutation sites of raccoon dog,arctic fox and dog IFN- genes.

表1 貉、北極狐和犬IFN-基因核苷酸變異位點(diǎn)Table 1 Nucleotide mutation sites of raccoon dog,arctic fox and dog IFN- genes.

注：*為核苷酸同意義突變位點(diǎn)。Note:*Is nucleotide synonymous mutation site.

種類 Species 37 位* 90 位* 280 位* 282 位 340 位* 345 位 380 位 471 位* 500 位貉IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.png Raccoon dog IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.pngC A G C G A T A G北極狐IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.pngArctic fox IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.pngT G A T T G A G A犬IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.pngDog IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.pngT G A T T G A G A水貂IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.pngMink IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.png g A A T T G T G A雪貂IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.pngDomestic ferret IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.png g A A T T G T G A貓IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.pngCat IFN-images/BZ_5_1287_473_1322_542.png g A A C C G T G A

圖4 貉IFN-同意義突變位點(diǎn)Fig.4 Raccoon dog IFN- synonymous mutation site

圖5 北極狐、貉、犬與水貂等動(dòng)物IFN-干擾素氨基酸序列比較分析Fig.5 Comparative analysis of amino acid sequences of IFN- in arctic fox,raccoon dog,dog and mink etc animals

2.3 IFN-在大腸桿菌中的表達(dá)

將重組質(zhì)粒 pET28-mRaIFN-陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.Coli BL21 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng) 1 mmol/L IPTG 37 ℃誘導(dǎo)，變性膠SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白大小約為19kD，與預(yù)期大小一致，以包涵體形式表達(dá)，未誘導(dǎo)對(duì)照和空載體對(duì)照均未出現(xiàn)目的條帶，以組氨酸單抗作為一抗Western blotting 進(jìn)一步鑒定。從圖6 可以看出，目的蛋白與單抗出現(xiàn)明顯的沉淀線。

圖6 北極狐、貉和犬IFN-SDS-PAGE 電泳檢測(cè)Fig.6 Detection of SDS-PAGE electrophoresis in arctic fox,raccoon dog and dog IFN-

圖7 His-單抗Western blot 檢測(cè)貉和犬IFN-重組蛋白的表達(dá)Fig.7 Identification of recombinant protein by Western blotting with His-tag monoclonal antibody

3 討論

本研究采用RT-PCR 技術(shù)從PHA 誘導(dǎo)的北極狐、貉、犬外周血淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增了IFN-基因，從序列分析比較結(jié)果得出，北極狐IFN-與犬IFN-基因同源性最高，達(dá)100%，而貉與犬和北極狐的IFN-差異明顯，有9 個(gè)核苷酸的變異，其中有5 個(gè)同意義突變位點(diǎn)；預(yù)測(cè)的N-糖基化位點(diǎn)也有明顯差異，這一結(jié)果也說(shuō)明，北極狐和犬的IFN-基因進(jìn)化關(guān)系更近一些，而貉較遠(yuǎn)。IFN-作為機(jī)體免疫中具有重要作用的細(xì)胞因子之一，也是機(jī)體免疫功能評(píng)判的重要指標(biāo)之一，本研究構(gòu)建了IFN-表達(dá)載體并成功表達(dá)了成熟肽蛋白，為開(kāi)發(fā)IFN-獸用治療制劑提供了理論基礎(chǔ)。基因工程干擾素與其他型干擾素相比較，有著很多優(yōu)點(diǎn)，例如污染小甚至沒(méi)有污染、安全性高、成本低等[14]，從而使干擾素商品化，廣泛應(yīng)用于臨床治療與免疫，為新獸藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。