人工RNA結(jié)合骨架的可溶性表達(dá)及其與寡核苷酸鏈的相互作用分析

徐如飛，徐奕倩，陳倩倩，蔣培蓉，陳美雯，蒲首丞，孫梅好

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004）

PUF結(jié)合因子（Pumilio/fem-3 binding factor）是一種存在于真核細(xì)胞、結(jié)合單鏈RNA分子的RNA結(jié)合蛋白，具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)的重要功能。PUF由RNA結(jié)合骨架（RNA-binding scaffold，RBS）和輔助結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其RNA結(jié)合骨架大部分含有由α-螺旋構(gòu)成的8個RNA結(jié)合域（RNA binding domain，RBD），天然PUF堿基特異性的解析為人工設(shè)計(jì)特異性結(jié)合任意8個核苷酸RNA分子的RBS（engineered RBS，ERBS）奠定了基礎(chǔ)[5]。

PUF蛋白家族是RBP中的一個大家族，存在于所有真核生物中，其基因的拷貝數(shù)在不同物種中差異很大。PUF蛋白主要通過特異性結(jié)合目標(biāo)mRNA的順式作用因子，影響mRNA的穩(wěn)定性、定位和翻譯過程，參與胚胎形成、細(xì)胞發(fā)育和分化等過程，實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[6-8]。

據(jù)報道，在原核細(xì)胞中，PUF蛋白結(jié)合于靶基因的RBS和起始密碼子之間，調(diào)控翻譯；在真核細(xì)胞中，PUF蛋白結(jié)合于靶mRNA的5′非翻譯區(qū)，顯著抑制了靶基因的表達(dá)[9]。調(diào)控機(jī)制可能是由于PUF蛋白結(jié)合RNA之后，與其他的蛋白相互作用，進(jìn)而抑制翻譯或引起mRNA降解[10]。

利用Escherichia coli等原核表達(dá)體系表達(dá)重組蛋白，由于表達(dá)水平高及二硫鍵發(fā)生錯配，導(dǎo)致80%會以不溶性的包涵體形式存在[11-12]，在分離純化蛋白之前，需要經(jīng)過變性和復(fù)性，變性的蛋白質(zhì)因?yàn)闃?gòu)象被破壞，不具備生物學(xué)活性。因此，需要通過復(fù)性使蛋白質(zhì)恢復(fù)其天然構(gòu)象狀態(tài)，具有正確的生物學(xué)功能。變性和復(fù)性的過程比較復(fù)雜，而且難度大，因此，可溶性表達(dá)重組蛋白具有很重要的生物學(xué)意義[13-14]。

據(jù)報道，提高重組蛋白的可溶性表達(dá)可以采用以下幾種方式：第一，選擇合適的宿主，BL21（DE3）是通常選擇的宿主細(xì)胞[15]；第二，構(gòu)建蛋白，比如將目的蛋白與一些可溶性蛋白表達(dá)，可以提高目的蛋白的溶解性，但是分離純化之后需要切除輔助蛋白[16-19]；第三，降低培養(yǎng)溫度，大腸桿菌的最適生長溫度為37℃左右，因此，37℃誘導(dǎo)蛋白很容易導(dǎo)致不溶性的包涵體形成，研究顯示，低溫誘導(dǎo)更有利于正確蛋白的折疊，導(dǎo)致其可溶性增加[20-24]；第四，改善誘導(dǎo)條件，在菌體生長的對數(shù)生長期誘導(dǎo)，更有利于可溶性蛋白的形成，降低誘導(dǎo)劑的使用量有利于蛋白的緩慢表達(dá)，從而更有利于可溶性蛋白的形成[25]。

本研究利用ERBS蛋白可以結(jié)合單鏈RNA的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)5'-FAM標(biāo)記寡核苷酸，通過檢測5′-FAM標(biāo)記寡核苷酸熒光強(qiáng)度的變化來分析ERBS蛋白與寡核苷酸的相互作用。

1 材料和方法

1.1 材料

Escherichia coliDH5α、BL21（DE3）、Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、pET-24a-CYFP載體均由浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室保存；含ERBS基因的載體pUC57-ERBS、寡核苷酸鏈由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；限制性核酸內(nèi)切酶Not I、Sal I、PCR相關(guān)試劑、T4 DNA Ligase等購自寶生工程（大連）有限公司；IPTG、氨芐青霉素、卡納霉素、酵母提取物、胰蛋白胨均購自O(shè)xoid LTD公司（Hampshire，England）；DTT、溶菌酶、Pepstatin A購自Amresco公司；PMSF為BBI產(chǎn)品；Ni-NTA His-Bind SuperflowResin購自Novagen公司；超濾管購自Millipore公司。其他常規(guī)生化試劑均購自國內(nèi)公司，為分析純。

1.2 構(gòu)建載體所需引物

根據(jù)已知的基因序列，用Primer premier 6.0設(shè)計(jì)引物，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，所用引物如表1所示。通過引物ERBS-F與ERBS-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有Not I、Sal I酶切位點(diǎn)的ERBS，從而將其構(gòu)建到pET-24a-CYFP載體中。

3.1.2 清創(chuàng) 采用自溶性清創(chuàng)法進(jìn)行清創(chuàng)［6-7］。嚴(yán)格執(zhí)行無菌技術(shù)，以0.9%氯化鈉棉球徹底清洗傷口，將壞死組織及膿性分泌物清除干凈。水凝膠均勻涂抹于壞死區(qū)，無粘性泡沫敷料保濕覆蓋，低敏寬膠帶封貼［8］。第2天就診時發(fā)現(xiàn)滲液中等量，黑色壞死組織變軟并且部分脫落，按照保守性銳器清創(chuàng)指南使用無菌剪刀，用血管鉗分離和提起壞死組織并剪除［5］。

表1 構(gòu)建載體所用引物

1.3 合成寡核苷酸鏈

設(shè)計(jì)ERBS特異性識別并結(jié)合的寡核苷酸，5′加FAM熒光基團(tuán)（表2）。

表2 合成的寡核苷酸鏈

1.4 方法

1.4.1 pET-24a-ERBS表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)可以結(jié)合5′-ACAGCGGC-3′的ERBS基因序列，合成于pUC57-SmalI；以pUC57-ERBS為模板，利用引物ERBS-F和ERBS-R擴(kuò)增之后，其PCR純化產(chǎn)物與pET-24a-CYFP質(zhì)粒通過雙酶切（Not I、Sal I）及割膠回收后，二者的割膠回收產(chǎn)物經(jīng)16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α，酶切驗(yàn)證正確之后轉(zhuǎn)化BL21（DE3），獲得pET-24a-ERBS表達(dá)菌株。

1.4.2 BL21（DE3）中ERBS蛋白的表達(dá)挑取pET-24a-ERBS表達(dá)菌株單菌落至含4 mL LB培養(yǎng)基（含Kana抗性）的試管中，37℃220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)過夜。將試管菌液轉(zhuǎn)移至500 mL LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，16℃誘導(dǎo)過夜后，離心收集菌體，使用磷酸鈉溶液（pH＝8.0），加入pepstatinA、PMSF、溶菌酶，4℃裂解1 h，超聲波破碎后離心，分離上清及沉淀，將樣品處理后進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.4.3 Rosetta（DE3）中ERBS蛋白的表達(dá)提取pET-24a-ERBS（BL21）質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Rosetta（DE3）。挑取單菌落至含4 mL LB培養(yǎng)基（含Kana抗性）的試管中，37℃220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)過夜。將試管菌液轉(zhuǎn)移至500 mL LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，16℃誘導(dǎo)過夜后，離心收集菌體，使用磷酸鈉溶液（pH＝8.0），加入pepstatinA、PMSF、溶菌酶，4℃裂解1 h，超聲波破碎后離心，分離上清及沉淀，將樣品處理后進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

將破碎上清通過鎳柱純化，采用0、5、50、100 mmol/L咪唑梯度洗脫目的蛋白，蛋白電泳顯示，100 mmol/L咪唑可以將目的蛋白完全洗脫下來，將100 mmol/L咪唑洗脫溶液進(jìn)行透析獲得的蛋白樣品，利用3 ku超濾管低速離心濃縮蛋白。蛋白濃度根據(jù)Bradford法[20]測定。

1.4.4 光譜分析利用安捷倫Cary 4000紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)的Kinetic程序，在激發(fā)波長為494 nm、發(fā)射波長為521 nm的條件下，測定不同濃度的ERBS蛋白與5′-FAM標(biāo)記寡核苷酸相互作用的吸光值，計(jì)算解離常數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ERBS的基因序列（5'-3'）及其對應(yīng)的氨基酸序列

以人的PUM1的RBD（G828-Y1168，PDB：1M8Y）為骨架，根據(jù)已經(jīng)解析的RBD對應(yīng)RNA的4種堿基的識別密碼，設(shè)計(jì)ERBS的氨基酸序列，送至生物工程公司優(yōu)化、合成大腸桿菌表達(dá)ERBS蛋白所需的核苷酸序列（圖1），黃色區(qū)域?yàn)镋RBS的8個RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，3′-5′依次結(jié)合RNA堿 基ACAGCGGC。

2.2 ERBS片段的獲得

ERBS片段使用ERBS-F、ERBS-R引物通過PCR擴(kuò)增得到，其擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，產(chǎn)物長度為1 000 bp左右，符合預(yù)期。割膠回收后酶切（Not I＋Sal I），然后連接到pET-24a-CEYFP載體上，通過菌液PCR篩選出陽性克隆，構(gòu)建重組質(zhì)粒載體pET-24a-CEYFP-ERBS。

2.3 蛋白純化結(jié)果

2.3.1 BL21（DE3）中ERBS蛋白的表達(dá)結(jié)果為了分析ERBS與其對應(yīng)核苷酸的特異性互作，將ERBS通過BL21（DE3）表達(dá)菌株進(jìn)行表達(dá)，并收集其破碎上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示（圖3），蛋白誘導(dǎo)成功但大多數(shù)蛋白都形成了包涵體存在于沉淀中，包涵體的純化需要經(jīng)過復(fù)雜的變性復(fù)性過程，給后續(xù)的試驗(yàn)造成了很大的麻煩。

2.3.2 Rosetta（DE3）中ERBS蛋白的表達(dá)結(jié)果為了獲得可溶性的ERBS，提取pET-24a-ERBS（BL21）質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Rosetta（DE3）進(jìn)行表達(dá)純化，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示（圖4），蛋白誘導(dǎo)成功，且為可溶性蛋白，并且通過鎳柱純化之后得到了純度較高的ERBS（≥95%）。

2.4 ERBS蛋白與寡核苷酸鏈的相互作用

為了分析ERBS與其對應(yīng)核苷酸的特異性互作，利用鎳柱純化的ERBS和5′-FAM標(biāo)記寡核苷酸（0.4μmol/L）結(jié)合ERBS后熒光強(qiáng)度發(fā)生改變這一特點(diǎn)，分析了ERBS與其目標(biāo)寡核苷酸（底物）之間的解離常數(shù)（Kd）。利用0.4μmol/L的5′-FAM標(biāo)記寡核苷酸鏈，分別加入不同濃度的ERBS（圖5），激發(fā)波長為494 nm，發(fā)射波長為521 nm，根據(jù)寡核苷酸鏈熒光強(qiáng)度的變化擬合獲得解離常數(shù)Kd。數(shù)據(jù)擬合分析發(fā)現(xiàn)，Kd為（9.76±0.62）nmol/L，與已發(fā)表數(shù)據(jù)（Kd≈0.5～30 nmol/L）一致。

3 結(jié)論與討論

設(shè)計(jì)可以結(jié)合任意RNA序列的PUF蛋白具有許多潛在的生物和醫(yī)學(xué)應(yīng)用[26]。RNA復(fù)合體在調(diào)節(jié)基因表達(dá)方面具有很重要的作用，對多細(xì)胞真核生物的細(xì)胞分化和復(fù)雜的發(fā)育模式也是至關(guān)重要的[27-29]。但是蛋白質(zhì)以何種方式結(jié)合RNA很難預(yù)測[30]，這限制了為生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用設(shè)計(jì)RNA結(jié)合蛋白[31]。RBP的潛能與siRNA和miRNA相似，然而，miRNA主要是降低靶RNA在細(xì)胞質(zhì)中的豐富度或表達(dá)，這依賴于RNA干擾途徑[32]。因此，設(shè)計(jì)RNA結(jié)合蛋白很吸引人，因?yàn)樗鼈兛梢耘c任意感興趣的結(jié)構(gòu)域融合，選擇性地結(jié)合于特定的RNA靶位點(diǎn)，進(jìn)而監(jiān)測或控制其代謝的任何方面。

人工設(shè)計(jì)PUF（Engineered PUF，EPUF）可以與任何靶RNA的幾個堿基特異性地結(jié)合，招募其他蛋白因子形成功能性融合蛋白，從而調(diào)控mRNA剪切，影響蛋白質(zhì)翻譯和特定mRNA的穩(wěn)定性。這些結(jié)果暗示，EPUF可以作為潛在的生物化學(xué)研究和生物醫(yī)療工具進(jìn)行開發(fā)。

本試驗(yàn)為了分析ERBS與其對應(yīng)核苷酸的特異性互作，通過Escherichia coli Rosetta（DE3）表達(dá)ERBS，并利用鎳柱純化獲得ERBS，利用5′-FAM標(biāo)記寡核苷酸（0.4μmol/L）結(jié)合ERBS后熒光強(qiáng)度發(fā)生改變這一特點(diǎn)，分別加入不同濃度的ERBS（激發(fā)波長為494 nm，發(fā)射波長為521 nm），根據(jù)5′-FAM標(biāo)記寡核苷酸熒光強(qiáng)度的變化擬合獲得解離常數(shù)。

Rosetta（DE3）補(bǔ)充6種稀有密碼子（AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA），提高外源基因，尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平[33]。試驗(yàn)也證明，使用Rosetta（DE3）之后，確實(shí)提高了蛋白的可溶性表達(dá)水平，有關(guān)如何提高外源基因可溶性表達(dá)的策略，仍需要進(jìn)一步探索。