基質(zhì)金屬蛋白酶在肺纖維化的研究進展

吳桂清 王亞紅 劉剛

特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種病因不明的、嚴重的進行性間質(zhì)性肺疾病(Interstitial lung disease, ILD)，是特發(fā)性間質(zhì)性肺炎中最常見、最致命的一種[1]。目前其發(fā)病率和死亡率居高不下，仍難以治療，除肺移植外，目前IPF的治療效果欠佳，大多數(shù)患者肺功能和生活質(zhì)量逐漸下降，IPF的中位生存期為3～5年[1-2]。IPF的特點是肺泡上皮細胞和成纖維細胞異?；罨⒎置谶^多的細胞外基質(zhì)(包括基質(zhì)金屬蛋白酶)，成纖維細胞增殖、向肌成纖維細胞分化，以及肺泡結(jié)構(gòu)的喪失[3-4]。在肺纖維化發(fā)病進程中，多種基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)調(diào)控失常，有證據(jù)表明它們不僅在組織的異常重塑中起著核心作用，還可能促進纖維細胞的跨內(nèi)皮和組織遷移，并參與細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的重構(gòu)[2]。雖然MMPs在IPF發(fā)病過程中所起的重要作用已被廣泛研究，但目前IPF的具體發(fā)病機制仍未清楚。

MMPs是一種能降解細胞外基質(zhì)和大量非基質(zhì)蛋白的蛋白酶，是鋅離子依賴的內(nèi)肽酶，于1961年首次在非洲爪蟾的變態(tài)尾皮中被發(fā)現(xiàn)，其最后一個成員(MMP-28)于40年后被發(fā)現(xiàn),目前老鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有23種，人類有24種。MMPs根據(jù)底物的特異性可分為以下七種：(1)間質(zhì)膠原酶(MMP-1、-8、-13和-18)；(2)明膠酶(MMP-2和-9)；(3) 間質(zhì)溶解素 (MMP-3、-10和-11)；(4)膜型MMPs (MMP-14、-15、-16、-17、-24、-25)與質(zhì)膜相連；(5) 基質(zhì)溶解素(MMP-7和-26)；(6)金屬彈性蛋白酶(MMP-12)；(7) 其他基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-19、-20、-23和-28)[5]。MMPs是一組降解ECM的主要酶[6]，在正常條件下活性很低，主要負責(zé)ECM的降解，還能脫落細胞膜蛋白，并加工和切割多種生物活性介質(zhì)，如生長因子、細胞因子和趨化因子，調(diào)節(jié)細胞增殖、粘附、融合、分化和凋亡等多種功能，但是在肺纖維化發(fā)病和炎癥組織的修復(fù)或重塑過程中它們的活性增加[2]。以下將對目前已發(fā)現(xiàn)的部分種類MMPs在IPF發(fā)病中的機制進行探討。

通過在小鼠模型的研究揭示MMPs參與肺纖維化發(fā)病的可能機制

一、MMP-3

MMP-3 (間質(zhì)溶解素-1)在體外主要由上皮細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、肺泡巨噬細胞、單核細胞表達，可降解Ⅳ型膠原。與對照組相比，MMP-3在IPF患者的肺組織中主要在支氣管和肺泡上皮細胞、間質(zhì)成纖維細胞、肺泡巨噬細胞和其他白細胞中表達更多,在IPF診斷后3年內(nèi)死亡的患者中肺泡灌洗液中MMP-3 的表達會明顯升高[5]。

有研究發(fā)現(xiàn)MMP-3在IPF患者的肺組織和博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化中均有上調(diào)作用，而MMP-3基因敲除的小鼠對博萊霉素所致的肺纖維化起保護作用[2]。YAMASHITA CM等的研究發(fā)現(xiàn)MMP-3可通過激活Ⅱ型肺泡上皮細胞中的Wnt-β-catenin信號通路，增加肺上皮細胞中的E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的裂解，并誘導(dǎo)肺上皮細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial to Mesenchymal Transition，EMT)，促進肺纖維化的進展[7]。

二、MMP-7

MMP-7(基質(zhì)溶解素)由肺上皮細胞、單核吞噬細胞和纖維細胞表達[8]。MMP-7是IPF患者中表達最高的基因之一，血漿MMP-7水平被證實為診斷IPF的生物標(biāo)志物[9]，隨時間的變化仍升高，可預(yù)測高?；颊遊10]。

MMP-7敲除小鼠對博萊霉素所致肺纖維化起的保護作用，推測MMP-7有促肺纖維化作用[5]。其機制是可能通過切割E-cadherin激活上皮細胞[5]。另外，MMP-7可切割和激活骨橋蛋白，也可被骨橋蛋白誘導(dǎo)和激活，而骨橋蛋白可增加肺間質(zhì)成纖維細胞中I型膠原和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1的表達，降低MMP-1的表達，表明MMP-7和骨橋蛋白之間的雙向調(diào)節(jié)在IPF的促纖維化中起重要的作用[2]。

三、MMP-8

MMP-8(中性粒細胞膠原酶)來源于多形核白細胞(Polymorphonuclear leukocyte, PMN)、淋巴細胞、肺上皮細胞、成纖維細胞、纖維細胞、活化的巨噬細胞等[5]。在IPF患者的血和肺組織勻漿、肺泡灌洗液MMP-8水平均升高[2]。CRAIG VJ等研究發(fā)現(xiàn)IPF肺中表達MMP-8的主要細胞是巨噬細胞和氣道上皮細胞，中性粒細胞中MMP-8水平?jīng)]有改變，但發(fā)現(xiàn)報道血漿和肺泡灌洗液 MMP-8水平與IPF患者的肺功能下降和/或死亡率不相關(guān)[11]。

MMP-8基因敲除小鼠對博萊霉素致肺纖維化起保護作用，與巨噬細胞炎癥蛋白-1a和抗纖維化因子γ干擾素誘導(dǎo)蛋白-10(IFN-γ-inducible protein-10，IP-10)水平有關(guān)[5]。而在纖維細胞表達MMP-8的研究中，用MMP-8抑制劑可減少纖維細胞在體外遷移，提示MMP-8促進纖維細胞遷移[8]。

四、MMP-9

MMP-9(明膠酶B)由中性粒細胞、上皮細胞和內(nèi)皮細胞表達[2]。MMP-9在IPF患者的肺組織和肺泡灌洗液中表達增加，免疫組化顯示其主要分布在IPF肺的化生氣道上皮細胞、肺泡及間質(zhì)巨噬細胞中[5]。

博萊霉素處理的轉(zhuǎn)基因小鼠在巨噬細胞中表達人MMP-9明顯增多，而胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3(Insulin-like growth factor binding protein-3，IGFBP 3)明顯低于野生型小鼠，提示巨噬細胞分泌的MMP-9可通過減少巨噬細胞分泌的IGFBP-3 發(fā)揮抗纖維化作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可通過激活ERK 1/2信號通路誘導(dǎo)Thy-1陰性的肺成纖維細胞表達MMP-9，Thy-1陰性肺成纖維細胞系表現(xiàn)出較強的遷移能力和膠原基質(zhì)收縮能力，這些結(jié)果均提示MMP-9的表達與肺成纖維細胞中Thy-1受體陰性相關(guān)[2]。最近在大鼠肺纖維化的實驗?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)在肺纖維化早期由巨噬細胞釋放的MMP-9增加，它可以增強成纖維細胞的遷移能力，當(dāng)恢復(fù)過度時，成纖維細胞向損傷區(qū)域募集更多的成纖維細胞并分泌膠原，從而導(dǎo)致肺纖維化發(fā)生[12]。

五、MMP-12

MMP-12(巨噬細胞金屬彈性蛋白酶)主要由巨噬細胞表達，也可由肺基質(zhì)細胞表達[5]。在經(jīng)典的細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)巨噬細胞活化過程中MMP-12的表達增加[5]。

MMP-12在博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化肺組織中上調(diào)[2]。然而，對炎癥反應(yīng)和纖維反應(yīng)的推測作用卻給出了相互矛盾的結(jié)果。一些研究表明MMP-12基因敲除對博萊霉素引起的炎癥或纖維化沒有明顯影響[13-14]，但在抗Fas抗體誘導(dǎo)的肺纖維化模型中發(fā)現(xiàn) MMP-12通過上調(diào)egfr1(主要通過TGF-β1參與肺纖維化)和cyr61(參與成纖維細胞對ECM的粘附)促纖維化基因的活性來促進纖維化[2]，提示MMP-12在TGF-β1信號通路的激活中起著重要的作用。在IPF患者肺泡灌洗液中由MMP-12切割的Ⅳ型膠原片段水平增加，提示MMP-12還可能通過切割ECM蛋白來參與IPF的發(fā)病[5]。

六、MMP-13

MMP-13 (膠原酶3)主要由成纖維細胞表達[5]。MMP-13是一種能切割纖維蛋白原的酶，在IPF患者的血漿中無增加，但在全肺及肺泡灌洗液中有增加[5]，主要分布在肺泡和細支氣管上皮細胞、肺泡巨噬細胞中[15]。

MMP-13在肺纖維化實驗?zāi)Ｐ椭械淖饔萌〉玫慕Y(jié)果相互矛盾。MMP-13基因敲除小鼠對博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化更明顯，而對輻射性肺纖維化有保護作用[2]。此外，高氧致肺損傷后纖維反應(yīng)無明顯差異，但MMP-13基因敲除小鼠的炎癥反應(yīng)增加[2]。最近研究表明MMP-13基因敲除小鼠可導(dǎo)致博萊霉素致肺纖維化的延遲，提示MMP-13具有抗纖維化作用，其活性在纖維化過程中對肺修復(fù)和組織完整性恢復(fù)中起著至關(guān)重要的作用[15]。

七、MMP-19

MMP-19由單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞表達，在成纖維細胞中的表達依賴于ERK 1/2和p38信號通路[5]。

MMP-19在IPF患者肺組織纖維化區(qū)附近的增生性上皮細胞中高表達[2]。有研究表明，在體內(nèi)和體外的上皮細胞MMP-19的水平與前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2(Prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)的變化呈正相關(guān)，而PTGS2是一種抗纖維介質(zhì)，這表明MMP-19可部分通過在肺泡上皮細胞中誘導(dǎo)該酶在纖維化發(fā)展中起保護作用[2]。與野生型小鼠相比，MMP-19基因敲除小鼠對博來霉素的肺纖維化反應(yīng)更劇烈，可觀察到大量的成纖維細胞及肌纖維纖維細胞灶，而成纖維細胞可合成更多的細胞外基質(zhì)及具有明顯的增殖和遷移活性,這表明MMP-19起到抗纖維化作用[16]。

八、MMP-28

MMP-28在肺中由上皮細胞和巨噬細胞表達[17]，目前有關(guān)MMP-28的研究較少。MMP-28主要在IPF患者的肺中檢測到并定位于上皮細胞，其與異常傷口愈合有關(guān)，IPF比非IPF患者血清中MMP-28的濃度顯著升高，盡管IPF和非IPF有相似的影像學(xué)形態(tài)，但不同的致病機制導(dǎo)致不同分子的表達，提示MMP-28可區(qū)分IPF與纖維化非IPF患者，MMP-28可能為提高IPF診斷確定性的提供一個有效的生物標(biāo)志物[18]。

MMP-28是巨噬細胞極化的重要調(diào)控因子。研究表明MMP-28基因敲除小鼠M2表型極化減少，對博萊霉素所致纖維化的起保護作用[5]。MMP-28可促進巨噬細胞向M2表型細胞極化, 提供大量的纖維化因子促進成纖維細胞增殖和膠原合成[5]。MMP-28在肺腺癌細胞A549能通過激活TGF-β，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial to Mesenchymal Transition，EMT)，獲得Ⅰ型膠原侵襲表型[5]。最近研究發(fā)現(xiàn)IPF患者的肺上皮細胞MMP-28表達上調(diào)，MMP-28以催化依賴性的方式促進上皮細胞的存活、增殖、遷移和EMT[19]。

MMPs對肺纖維化有潛在的貢獻，但尚未在肺纖維化的動物模型中進行研究

體外研究表明，其它基質(zhì)金屬蛋白酶(即MMP-1、-2、-10、-11、膜型MMPs)也有可能促進纖維化的發(fā)生，但還沒有在肺纖維化模型中使用基因靶向小鼠進行評估，我們根據(jù)已知MMPs在其他疾病或體外系統(tǒng)中的活性來推測它們的潛在活性[5]。

一、MMP-1

MMP-1 (膠原酶-1)MMP-1由成纖維細胞、巨噬細胞、支氣管上皮細胞和內(nèi)皮細胞表達，體外可降解Ⅰ-Ⅲ型膠原[5]。MMP-1在IPF患者的肺組織中表達增加，MMP-1主要分布于纖維間質(zhì)上的增生異常上皮細胞[5]。

MMP-1基因敲除的小鼠已經(jīng)產(chǎn)生，但尚未在肺纖維化模型中進行研究[5]。體外研究表明，MMP-1在IPF患者中起保護作用[5]。在肺泡上皮細胞中過表達人MMP-1增加了低氧誘導(dǎo)因子1a(Hypoxia-induciblefactor-1α，HIF-1α)的表達，減少活性氧的產(chǎn)生,并促進肺泡上皮細胞增殖，遷移和抑制凋亡[20]。在IPF肺中明顯上調(diào)的骨橋蛋白可減少肺成纖維細胞MMP-1的表達，并促進成纖維細胞和上皮細胞的增殖和遷移[2]。

二、MMP-2

MMP-2(明膠酶A)由氣道上皮細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、肺成纖維細胞和纖維母細胞表達，體外可切割變性膠原和基底膜[8]。MMP-2在IPF肺組織中表達增加，主要分布在反應(yīng)性氣道上皮細胞和纖維母細胞[5]。

MMP-2基因敲除小鼠在未受攻擊狀態(tài)下是異常的，從出生后第3天到成年，生長速度減慢了15%，迄今為止，MMP-2基因敲除小鼠還沒有在肺纖維化模型中進行研究[5]。MMP-2定位于IPF肺上皮基底膜的破裂附近，與基底膜的降解有關(guān)[5]。最近有研究報道MMP-2和MMP-9可通過EGFR/AKT/GSK 3β/β-catenin途徑介導(dǎo)香煙煙霧提取物誘導(dǎo)EMT[21]。

三、MMP-10

MMP-10(間質(zhì)溶解素2)由內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和巨噬細胞表達[5]。MMP-10在IPF肺中表達增加，主要由肺泡巨噬細胞和上皮細胞表達[22]。

有報道MMP-10基因敲除小鼠感染銅綠假單胞菌的模型，還沒有在肺纖維化模型中進行研究[5]。用氧化鈰(柴油尾氣組分)顆粒處理的大鼠肺纖維化區(qū)MMP-10的表達增加[5]。MMP-10在體外促進巨噬細胞遷移[5]。皮膚創(chuàng)傷愈合模型中MMP-10誘導(dǎo)巨噬細胞向M2表型極化與膠原酶活性增加有關(guān)[5]，提示MMP-10可能通過巨噬細胞介導(dǎo)的膠原酶降解表現(xiàn)出抗纖維化作用。雖然機制還未明確，免疫染色顯示IPF肺組織中MMP-10的大量表達及血清MMP-10與疾病嚴重程度和預(yù)后有顯著的相關(guān)性，提示MMP-10在IPF的發(fā)病機制中起重要作用[22]。

四、MMP-11

MMP-11(間質(zhì)溶解素3)由成纖維細胞表達，在IPF中MMP-11的表達尚未被評估[5]。MMP-11基因敲除小鼠已建立，但尚未在肺纖維化模型中進行評估[5]。MMP-11激活了Notch信號，Notch通過TGF-β/Smad 3途徑誘導(dǎo)成纖維細胞分化[23]，由此推測 MMP-11有可能參與IPF的發(fā)病。

五、MMP-14

MMP-14主要參與人和小鼠肺成纖維細胞相關(guān)的Ⅰ型膠原的切割，這是否是肺成纖維細胞在IPF患者中產(chǎn)生的最重要的Ⅰ型膠原酶尚不清楚[5]。MMP-14是IPF肺組織中表達最多的膜型MMPs (Membrane-type matrix metalloproteinases，MT-MMP)，由肺泡上皮細胞中表達[24]。

MMP-14(MT1-MMP)基因敲除小鼠出現(xiàn)嚴重的骨骼異常并在1個月大的時候損害了肺泡發(fā)育，肺泡表面積減少了約40%，死亡率增加，這排除了他們在肺纖維化模型中的分析[5],而其他類型MT-MMP基因敲除小鼠未見報道。MT1-MMP可通過增加間充質(zhì)干細胞在小鼠肺中的募集減輕博萊霉素所致的肺纖維化，促進肺修復(fù)[5]。MMP-14能增強細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化活性,MMP-14作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白Nogo-b的下游新靶點，促進Ⅱ型氣道上皮細胞A549中游離TGF-β1的釋放，從而誘導(dǎo)細胞發(fā)生EMT，進而促進肺纖維化[25]。

基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑

MMPs的主要功能為降解ECM[26]，MMPs的活性受基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(Tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMPs)的轉(zhuǎn)錄、前肽激活和抑制水平的嚴格控制，TIMP家族的四個成員(TIMP1-4)是MMPs最重要的內(nèi)源性抑制劑，MMPs/TIMPs比例失衡在肺纖維化的發(fā)病過程中起重要作用[24]。

TIMP-1基因敲除的小鼠不影響博萊霉素引起的肺纖維化的發(fā)展程度；TIMP-2基因敲除的小鼠對博萊霉素的肺纖維化反應(yīng)與野生型小鼠相似；TIMP-3基因敲除的小鼠對博萊霉素的肺纖維化反應(yīng)比野生型小鼠更明顯[24]。TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中TIMP-1/-2/-3表達上調(diào)，MMP-9活性降低，MMPs與TIMPs失衡導(dǎo)致肺纖維化[27]。TIMP-4基因敲除小鼠的心功能受損，目前還沒有關(guān)于其在肺纖維化模型中的相關(guān)數(shù)據(jù)[24]?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明TIMP-3對肺纖維化的發(fā)生有明顯的抗纖維化作用。

靶點治療

目前臨床實踐指南推薦用于治療IPF的藥物是FDA批準(zhǔn)的吡啡尼同和尼達尼布[1]，雖然這兩種藥物能減緩IPF患者肺功能的下降的狀況，但這兩種藥物成本高，患者每年的費用達到9400萬美元到9600萬美元之間。除了接受肺移植手術(shù)，任何其他治療都不能治愈IPF ，并且在患者選擇長期藥物治療的安全性和有效性仍存在爭議[28]。在肺纖維化發(fā)病機制中一些MMPs (如MMP-7等)促進纖維化，而另一些MMPs(如MMP-19等)對纖維化起保護作用[2]。大多數(shù)促纖維化MMPs的關(guān)鍵激活因子尚不清楚，這些激活劑也可能被證明是重要的治療靶點[5]。目前使用廣譜的小分子MMP抑制劑的Ⅲ期臨床試驗均以失敗告終，其原因可能是MMPs在催化結(jié)構(gòu)上有相似之處，抑制劑很可能抑制了大多數(shù)MMPs的活性，另外，由于MMPs的部分功能還涉及非催化結(jié)構(gòu)域，甚至其在細胞內(nèi)定位也會動態(tài)變化，因此開發(fā)MMPs相關(guān)的新蛋白質(zhì)結(jié)合藥物的需求迫在眉睫[2]。目前我們對MMPs在肺纖維化發(fā)病中的認識仍然有限，需要進一步研究以開發(fā)更有選擇性的MMPs抑制劑或其他降低MMPs水平的藥物。