絲膠蛋白對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激損傷和PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

張雷 李東哲 陳志宏

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

氧化應(yīng)激在很多疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，包括腫瘤、高血壓、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、慢性疲勞綜合征、神經(jīng)組織退化性疾病等〔1〕。并且，越來(lái)越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激在糖尿病腎臟損傷的發(fā)病中亦發(fā)揮著重要作用〔2,3〕。有研究報(bào)道，氧化應(yīng)激的過(guò)程涉及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括核因子E2相關(guān)因子2-Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1-抗氧化反應(yīng)序列元件(Keap1-Nrf2-ARE)信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路、Toll樣受體(TLRs)介導(dǎo)的信號(hào)通路等〔4〕。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，絲膠(彩色蠶繭水提物)具有保護(hù)糖尿病時(shí)腎臟損傷的作用〔5〕，但具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步地深入探討。本研究旨在探討絲膠蛋白對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激損傷和PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：購(gòu)買自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司的SD大鼠48只，健康清潔級(jí)，大鼠合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。②絲膠：1%的Na2CO3浸泡30 min(蠶繭:Na2CO3為1∶30)，95～100℃沸煮3 h提取2次，合并2次提取液并減壓濃縮，濃縮液裝入8 000～14 000 nm透析袋透析過(guò)夜，透析液冷凍干燥成粉末即為絲膠。③實(shí)驗(yàn)試劑：鏈脲佐菌素，美國(guó)Sigma公司；大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、總一氧化氮合酶(tNOS)、過(guò)氧化氫(H2O2)檢測(cè)試劑盒，南京建成生物科技有限公司；Trizol，北京茂建聯(lián)科技有限公司；DNA marker，天根生化科技(北京)有限公司；PCR引物，寶生物工程(大連)有限公司。

1.22型糖尿病大鼠模型的建立及絲膠干預(yù) 采用隨機(jī)的方法將48只大鼠均分為四組各12只，正常對(duì)照組(對(duì)照組)、2型糖尿病模型組(模型組)、絲膠低劑量組、絲膠高劑量組。采用高脂高糖飼料飼養(yǎng)+鏈脲佐菌素(35 mg/kg，2次)腹腔注射的方法建模，空腹血糖≥11.1 mmol/L為建模成功的標(biāo)準(zhǔn)。待建模成功后，絲膠低劑量組大鼠連續(xù)35 d按照1.8 g/(kg·d)的劑量灌胃絲膠；絲膠高劑量組大鼠連續(xù)35 d按照2.4 g/(kg·d)的劑量灌胃絲膠；模型組大鼠連續(xù)35 d以等量生理鹽水灌胃。

1.3取材 各組大鼠用藥結(jié)束后禁食12 h，使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，開胸于心臟取血后斷頭處死，取腎臟于冰盤上切成小塊后入液氮中速凍，然后移入-80℃低溫冰箱保存。

1.4檢測(cè)大鼠血液指標(biāo) 所取大鼠血液于4℃、3 000 r/min離心15 min，使用全自動(dòng)生化分析儀分別檢測(cè)血糖，血尿素氮和肌酐水平。

1.5檢測(cè)大鼠腎臟氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo) 取出低溫保存的腎臟，按照試劑盒說(shuō)明將腎臟組織勻漿、離心后取上清，檢測(cè)腎臟組織中SOD、CAT、tNOS和H2O2的水平。

1.6檢測(cè)大鼠腎臟PI3K和Akt mRNA的表達(dá) 提取腎臟組織的總RNA，測(cè)定RNA的濃度和純度并進(jìn)行鑒定，然后將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存于-20℃環(huán)境備用。以cDNA為模板，使用Real Time Q-PCR法擴(kuò)增PI3K、Akt和GAPDH的片段，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3次，以GAPDH為內(nèi)參采用2-△△Ct法計(jì)算所得數(shù)據(jù)，作為目的mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

引物序列(5′-3′)：PI3K：正義鏈-CCAGAAGAAGGGACAGTGGTATG，反義鏈-TCGTAGCCAATCAGGGAGGT，產(chǎn)物大小183 bp；Akt：反義鏈-ATGGACTTCCGGTCAGGTTCA，反義鏈-GCCCTTGCCCAGTAGCTTCA，產(chǎn)物大小126 bp；GAPDH：正義鏈-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG，反義鏈-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA，產(chǎn)物大小143 bp。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析，LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組血糖、血尿素氮、肌酐水平比較 模型組血糖、血尿素氮、肌酐水平較對(duì)照組明顯提高(P<0.01)。絲膠低、高劑量組血糖、血尿素氮、肌酐水平明顯低于模型組(P<0.01)；且絲膠高劑量組血尿素氮水平明顯低于絲膠低劑量組(P<0.01)。見表1。

表1 各組血糖、血尿素氮、肌酐水平比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；與絲膠低劑量組比較：3)P<0.01

2.2各組腎臟SOD、CAT、tNOS、H2O2水平比較 模型組腎臟SOD、CAT水平較對(duì)照組明顯降低，tNOS、H2O2水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)。絲膠低、高劑量組腎臟SOD、CAT水平明顯高于模型組，tNOS、H2O2水平明顯低于模型組(P<0.01)；并且，絲膠高劑量組腎臟CAT水平明顯高于低劑量組，H2O2水平明顯低于低劑量組(P<0.01)。見表2。

2.3各組腎臟PI3K和Akt mRNA表達(dá)比較 模型組腎臟PI3K、Akt mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯降低(P<0.01)。絲膠低、高劑量組腎臟PI3K、Akt mRNA表達(dá)明顯高于模型組(P<0.01，P<0.05)；且絲膠高劑量組腎臟PI3K mRNA表達(dá)明顯高于低劑量組(P<0.01)。見表2。

表2 各組腎臟SOD、CAT、tNOS、H2O2及PI3K、Akt mRNA水平比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05；與絲膠低劑量組比較：4)P<0.01

3 討 論

目前，糖尿病腎臟損傷的致病機(jī)制并不十分清楚，研究者們認(rèn)為系多因素參與、在一定的遺傳背景和危險(xiǎn)因素的共同作用下致病，包括腎臟血流動(dòng)力學(xué)異常、高血糖造成的代謝異常、高血壓、血管活性物質(zhì)代謝異常、炎癥、氧化應(yīng)激損傷等〔2，3，6，7〕。氧化應(yīng)激時(shí)活性氧(ROS)和活性氮(RNS)產(chǎn)生過(guò)多，體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。ROS包括超氧陰離子(·O2-)、羥自由基(·OH)和H2O2等；RNS包括一氧化氮(NO)、二氧化氮(NO2)和過(guò)氧化亞硝酸鹽(ONOO-)等。由于NO的半衰期極短，一氧化氮合酶(NOS)是NO生成的主要限速酶，而NOS的性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，因此目前常通過(guò)檢測(cè)NOS代表NO的水平〔8〕。同時(shí)，機(jī)體存在兩類抗氧化系統(tǒng)，酶抗氧化系統(tǒng)和非酶抗氧化系統(tǒng)，其中的酶抗氧化系統(tǒng)主要包括SOD、CAT、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等。ROS除了可直接損害組織細(xì)胞，還能激活多種氧化應(yīng)激通路和抗氧化應(yīng)激通路，從而間接加重或減輕組織細(xì)胞的損傷，其中即包括PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

本研究結(jié)果說(shuō)明在成功建立糖尿病大鼠模型的同時(shí)，模型大鼠亦出現(xiàn)了腎臟損害；氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常參與了糖尿病時(shí)腎臟損傷的病理過(guò)程。眾所周知，高血糖會(huì)增加ROS的產(chǎn)生，導(dǎo)致氧化應(yīng)激〔9，10〕。而增加的ROS可通過(guò)使腎足細(xì)胞凋亡增加破壞腎濾過(guò)膜的完整性或通過(guò)激活多種炎癥相關(guān)通路導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度積聚，從而造成腎臟損害〔11〕。PI3K/Akt信號(hào)通路存在于高等真核生物所有細(xì)胞中并高度保守，該途徑涉及的關(guān)鍵因子包括PI3K和Akt，PI3K被磷酸化后激活A(yù)kt，從而介導(dǎo)細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、增殖、遷移和血管生成等多種生物學(xué)作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)通路與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，PI3K/Akt信號(hào)通路被激活可減少氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，并對(duì)H2O2誘導(dǎo)的腎近端小管細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用〔12，13〕。

本研究考慮絲膠可能通過(guò)以下機(jī)制發(fā)揮保護(hù)糖尿病時(shí)腎臟損傷的作用：①絲膠可減少氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生及提高抗氧化酶的活性，恢復(fù)氧化作用與抗氧化作用之間的平衡，從而減輕氧化應(yīng)激造成的損傷；②絲膠可能通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而減少氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡等，保護(hù)腎功能。并且，絲膠對(duì)糖尿病時(shí)腎臟損害的保護(hù)作用具有一定的劑量依賴性，但絲膠發(fā)揮保護(hù)作用的最佳劑量尚待深入研究確定。

絲膠是從彩色蠶繭中提取的水溶性蛋白，最早《本草綱目》記載蠶繭煮水可治“消渴”，我國(guó)民間當(dāng)代亦有蠶繭泡水輔助降糖的驗(yàn)方。本研究亦證實(shí)，絲膠具有保護(hù)糖尿病時(shí)腎臟損傷的作用。