胰腺癌中Circ_0001946的表達(dá)及其與患者預(yù)后的相關(guān)性

鄧穎，白義鳳，楊蘭，王林，周曉剛

0 引言

胰腺癌（pancreatic cancer,PC）是一種起源于胰腺腺管上皮細(xì)胞的惡性程度極高的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢(shì)，盡管胰腺癌在手術(shù)、放療、化療、免疫治療等領(lǐng)域取得了一些進(jìn)展[1]，但由于缺乏敏感度和特異性的早期診斷指標(biāo)、大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中晚期，患者一般情況差，難以耐受有效的治療手段[2]。因此，尋找胰腺癌早期診斷及療效評(píng)估生物標(biāo)志物，對(duì)于改善預(yù)后及提高患者生存具有十分重要的意義。

環(huán)狀RNA（circRNA）是一類(lèi)特殊的非編碼RNA分子，呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，表達(dá)穩(wěn)定，不易降解[3]。近年研究表明，circRNA分子富含miRNA結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞中起到miRNA海綿的作用，進(jìn)而解除miRNA對(duì)其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達(dá)水平。通過(guò)與疾病關(guān)聯(lián)miRNA相互作用，circRNA在疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與腫瘤的預(yù)后相關(guān)[5]。然而關(guān)于circRNAs在胰腺癌中的作用機(jī)制尚未完全闡明。課題組前期通過(guò)基因芯片在胰腺癌組織及癌旁組織中檢測(cè)差異表達(dá)的circRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Circ_0001946在胰腺癌組織中高表達(dá)。然而關(guān)于Circ_0001946在胰腺癌中的作用目前少見(jiàn)報(bào)道，本研究旨在探討Circ_0001946在胰腺癌患者中的表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者簽署了書(shū)面知情同意書(shū)。收集2014年1月—2018年12月于四川省人民醫(yī)院確診的胰腺癌患者癌組織及配對(duì)癌旁組織55例，同時(shí)收集患者的血清標(biāo)本。所有胰腺癌組織及配對(duì)的癌旁組織均經(jīng)病理學(xué)確診。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)放化療和（或）中藥抗腫瘤。所有切除的新鮮組織標(biāo)本均立即用液氮冷凍直至使用。同時(shí)收集30例健康體檢者的血清標(biāo)本作為對(duì)照。所有入選病例確診后即刻用含抗凝劑的紫色采血管采集10 ml靜脈血4℃冷藏30 min后，室溫下3 000 r/min離心15 min，留取上層血清，置于-80℃冰箱備用。

1.2 隨訪

所有患者出院后均進(jìn)行了隨訪。隨訪起點(diǎn)為手術(shù)或病理活檢日期，末次隨訪時(shí)間為2019年4月30日，至隨訪截止日，生存15例，死亡37例，失訪3例。

1.3 qRT-PCR法分析Circ_0001946的表達(dá)水平

TRIzol法提取組織及血清標(biāo)本中總RNA。將提取的總RNA，參照AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用2×SYBR Green PCR Master Mix，以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR反應(yīng)在定量PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式RQ=2-ΔΔCt進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Circ_0001946在血清及組織標(biāo)本中的差異表達(dá)采用t檢驗(yàn)分析。Circ_0001946與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系使用Chi-Square檢驗(yàn)；Kaplan-Meier法分析Circ_0001946的表達(dá)與生存時(shí)間及預(yù)后的關(guān)系，應(yīng)用單因素及多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響胰腺癌預(yù)后的因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Circ_0001946在胰腺癌組織及血清中的表達(dá)

qRT-PCR法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，Circ_0001946在胰腺癌患者組織及血清中的表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000），見(jiàn)圖1A～B。

2.2 血清Circ_0001946的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)血清Circ_0001946的平均表達(dá)水平，將其分為Circ_0001946高表達(dá)組（≥8.430）及低表達(dá)組（＜8.430）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Circ_0001946的表達(dá)與患者的性別（P=0.911）、年齡（P=0.567）、CEA的表達(dá)（P=0.509）無(wú)關(guān)；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.015）、CA199的表達(dá)（P=0.000）、疾病分期（P=0.027）及脈管癌栓（P=0.000）明顯相關(guān)，見(jiàn)表1。

2.3 胰腺癌患者生存分析

Kaplan-Meier法分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)Circ_0001946的患者中位無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間及總生存時(shí)間均較低表達(dá)者明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000），見(jiàn)圖2。

2.4 血清Circ_0001946與CA199的相關(guān)性研究

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)血清Circ_0001946與CA199的表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.765,P=0.000），見(jiàn)圖3。

2.5 血清Circ_0001946診斷胰腺癌的效能

ROC曲線分析血清Circ_0001946診斷胰腺癌的生物效能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROC曲線下面積為0.805（95%CI:0.754～0.927,P=0.000），見(jiàn)圖4。

2.6 單因素及多因素分析影響胰腺癌患者預(yù)后因素

單因素及多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析結(jié)果顯示，疾病分期（P=0.007）、Circ_0001946表達(dá)（P=0.004）及脈管癌栓（P=0.014）是胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，見(jiàn)表2。

3 討論

胰腺癌臨床表現(xiàn)隱匿，由于缺乏敏感度和特異性的早期診斷指標(biāo)，因此早期診斷困難，發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中晚期，預(yù)后極差[6]，是癌癥相關(guān)死亡的主要原因[7]。尋找胰腺癌早期診治的新靶標(biāo)，對(duì)于改善預(yù)后及提高患者生存時(shí)間具有重要的臨床意義。

圖1 qRT-PCR法檢測(cè)Circ_0001946在胰腺癌患者組織(A)及血清(B)中的表達(dá)Figure 1 Circ_0001946 expression in tissues(A) and serum(B) of pancreatic carcinoma patients detected by qRT-PCR

表1 胰腺癌患者血清Circ_0001946的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Correlation between Circ_0001946 expression and clinicopathological features of pancreatic cancer patients

圖2 Circ_0001946的表達(dá)與胰腺癌患者中位無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間及總生存時(shí)間的關(guān)系Figure 2 Relation of Circ_0001946 expression with median progression-free survival(PFS) and overall survival(OS) of pancreatic cancer patients

圖3 血清Circ_0001946的表達(dá)與CA199的相關(guān)性Figure 3 Correlation between Circ_0001946 expression and CA199 in serum of pancreatic cancer patients

圖4 ROC曲線分析血清Circ_0001946診斷胰腺癌的生物效能Figure 4 ROC curve analysis of biological potential of serum Circ_0001946 in diagnosis of pancreatic cancer

表2 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響胰腺癌患者OS的臨床病理因素Table 2 Univariate and multivariate analyses of clinicopathological features for OS of pancreatic carcinoma patients

環(huán)狀RNA（circRNA）是一種不同于線性RNA的新型RNA，由于其表達(dá)具有組織特異性，表達(dá)量較大，在組織或體液中穩(wěn)定存在，使circRNA成為較理想的疾病早期診斷和預(yù)后評(píng)估生物標(biāo)志物[8]。研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA ciRS-7通過(guò)調(diào)控mir-7介導(dǎo)的EGFR/STAT3信號(hào)通路，促進(jìn)胰腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[9]。環(huán)狀RNA circ_0030235高表達(dá)是胰腺導(dǎo)管腺癌的不良預(yù)后的預(yù)測(cè)因素，并通過(guò)海綿miR-1253和miR-1294促進(jìn)細(xì)胞的進(jìn)展[10]。circZMYM2與miR-335-5p競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，調(diào)控胰腺癌中的JMJD2C的表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展[11]。環(huán)狀RNA circRHOT1的上調(diào)可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲[12]。環(huán)狀RNA circ_0007534通過(guò)海綿吸附miR-625和miR-892b調(diào)控胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲，是胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后不良的影響因素[13]。環(huán)狀RNA PDE8A通過(guò)miR-338/MACC1/MET通路促進(jìn)胰腺癌的侵襲性生長(zhǎng)[14]。通過(guò)激活miR-874-3p和抑制PLK1表達(dá)，從而下調(diào)環(huán)狀RNA hsa_circ_0000977的表達(dá)，抑制胰腺導(dǎo)管腺癌的進(jìn)展[15]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Circ_0001946在胰腺癌患者組織和血清中高表達(dá)；高表達(dá)Circ_0001946的患者總生存時(shí)間及無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間均較低表達(dá)者明顯縮短；血清Circ_0001946作為診斷胰腺癌血清標(biāo)志物的曲線下面積為0.805（95%CI:0.754～0.927）。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析提示，Circ_0001946表達(dá)是胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。以上研究結(jié)果提示Circ_0001946在胰腺癌患者組織中高表達(dá)，與患者的預(yù)后相關(guān)，可能是潛在的胰腺癌患者預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。