水稻根系鹽脅迫響應miRNA 和tRF 的鑒定

孟淑君，張雪海，王琪月，張穩(wěn)，黃力，丁冬，湯繼華

（河南農業(yè)大學農學院/省部共建小麥玉米作物學國家重點實驗室，鄭州 450002）

0 引言

【研究意義】水稻（Oryza sativaL.）是中國最重要的糧食作物，隨著全球氣候變暖及生態(tài)環(huán)境惡化，水稻生長過程中遭受的干旱、高鹽等非生物脅迫日益增加。鹽脅迫作為主要的非生物脅迫之一，嚴重影響水稻的生長發(fā)育。植物鹽脅迫一般表現為滲透脅迫和離子毒害2 個階段，引起植株體內活性氧破壞、膜系統(tǒng)損傷、光合和呼吸作用受抑制、酶活性降低等；表現為植株矮小，葉片黃化，最終導致糧食產量、品質的下降[1]。在高鹽環(huán)境下，水稻會產生2 種生理反應：快速的滲透反應，能抑制新梢/根的生長；較慢的離子反應，加速成熟葉片的衰老或加快細胞程序性死亡[2]?！厩叭搜芯窟M展】MicroRNAs（miRNAs）是一類普遍存在于生物體內，5'端帶有磷酸基團，3'端帶有羥基，長度為20—24 nt 的內源性非編碼小分子RNA[3]，在轉錄后水平調控其靶基因的表達。miRNA 通過剪切靶基因轉錄本或抑制靶基因翻譯行使其生物學功能[4-5]。在植物中，miRNA 通過對靶基因的調控，參與植物的生長發(fā)育、器官形態(tài)建成、生物及非生物脅迫響應等多種生物學進程[6-7]。GAO 等[8]發(fā)現miR393 的表達水平在鹽堿脅迫下明顯上調，而過表達miR393 的轉基因水稻對鹽堿處理比野生型更敏感，表明miR393 是水稻鹽堿脅迫的負調控miRNA。YANG 等[9]研究表明，過表達miR171c 可降低水稻的鹽脅迫耐受能力，說明miR171c 是水稻耐鹽脅迫的負調控因子。此外，miRNA156 是調控水稻干旱和鹽脅迫的重要因子[10]，水稻miR393可以和miR390 在不同脅迫條件下協(xié)同調控水稻側根生長[11]。tRF 是一種最近被發(fā)現的、在動植物中廣泛存在的小分子量非編碼RNA，其結構、分布及其生物學功能正日益受到研究者關注。tRF 序列全長20—40 nt，由前體tRNA 或成熟tRNA 經核苷酸酶加工和修飾而成[12]。tRF 最先在人類細胞中被鑒定獲得[13]。根據來源不同，tRF 可被分為3'端tRF[14]、不包含5'端和3'端結構的tRF[15]、含有CCA 結構的tRF[16]、5'端tRF[17]、tRNA 半分子tiR（tRNA-derived stress-induced RNAs）[18]等5 種類型。功能研究表明，tRF 具有類似于miRNA 的調控功能，是一種潛在的轉錄后基因表達調控因子。tRF 在調控mRNA 翻譯、細胞增殖、應激條件下細胞應答和人類疾病方面均具有重要作用[19]。除了在四膜蟲中[20]，tRF 的表達與它們各自的前體tRNA 的豐度無關[21,17]。迄今為止，tRF在植物中的功能研究相對較少。CHEN 等[22]在水稻胚愈傷組織中鑒定到大量tRF，其中表達量最高的tRF來自于Ala-AGC tRNA 的5'端，且未分化愈傷中的tRF含量顯著高于已分化愈傷。【本研究切入點】根系是水稻直接接收鹽脅迫信號的部位。除功能基因外，調控性核酸分子在植物逆境響應過程中也發(fā)揮著不可替代的作用。miRNA 是植物脅迫響應的上游調控因子，通過調節(jié)靶基因的表達響應脅迫信號。而作為新近發(fā)現的小分子量調控RNA，tRF 在植物脅迫響應方面的鑒定及功能研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究以水稻粳稻品種日本晴為試驗材料，對鹽脅迫處理的水稻根系材料進行了小分子量RNA 測序，并利用qRT-PCR 方法對測序結果進行了驗證。鑒定和篩選到水稻鹽脅迫響應miRNA、tRF 及其靶基因；分析鹽脅迫處理/非鹽處理水稻根系miRNA、tRF 差異表達情況，并建立了水稻非編碼小分子量RNA 參與的鹽脅迫響應基因表達調控網絡。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

挑選飽滿且均勻一致的水稻粳稻品種日本晴種子60 粒，剝去種子的穎殼，在超凈工作臺內經75%酒精浸泡清洗5 min，用0.1%升汞處理20 min，滅菌去離子水清洗4—5 次，并用濾紙吸取多余的水分。將滅菌處理過的種子分別鋪于1/2MS 和含150 mmol·L-1NaCl的1/2MS 培養(yǎng)基上，每個直徑90 mm 的培養(yǎng)皿中鋪放30 粒種子。用滅菌的鑷子夾取種子，將水稻種子按照從左到右的順序均勻排列。封口膜封口后的培養(yǎng)皿放置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)，待種子露白后于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（每日光照28℃ 14 h/黑暗25℃ 10 h）。處理21 d 后，取鹽脅迫處理/非鹽處理水稻植株根部樣品液氮中速凍后置于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｃ糠莶牧先? 個生物學重復，分別用于提取根系組織總RNA進行小分子量RNA 測序，每個生物學重復由3 個植株的根系樣品等量混合組成。

1.2 水稻根系RNA 提取

使用冷凍的TriZol（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）根據RNeasy minikit（Qiagen, Hilden, Germany）說明書提取水稻根系總RNA，利用NanoDrop2000 分光光度計檢測RNA 濃度，并利用Agilent2100 檢測RNA 樣品的質量及完整性。

1.3 Small RNA 建庫測序

使用15%PAGE 膠分離不同片段大小的RNA，取14—40 nt 條帶回收小分子量RNA；使用RNA 連接酶將回收的小分子量RNA 加上3'和5'接頭，每次連接后進行切膠回收。將最終回收到的小分子量RNA 反轉錄成cDNA，PCR 擴增16 個循環(huán)；用PAGE 膠對PCR 產物切膠回收，完成文庫構建，質檢后用于高通量測序。利用illumina Nextseq500 儀器，75SE 測序模式對樣品進行小分子量RNA 測序。

1.4 Small RNA 數據分析方法

首先對測序得到的原始數據進行過濾，去除有5'接頭污染的、長度小于18 nt、polyA 和低質量（Q＜=5）的reads，得到clean reads 用于數據分析。

1.4.1 miRNA 數據分析 利用bowtie 軟件[23]將數據與miRBase 數據庫（水稻）（http://www.miRBase.org/, Version 21；包括172 個成熟的miRNA）進行比對。當測序片段與數據庫中已知的miRNA 序列錯配數小于2 時認為該測序片段為已知的miRNA。為了判斷樣品之間miRNA 的表達量差異，用featurecounts 軟件[24]統(tǒng)計樣本reads 數。用DESeq2 進行差異基因分析[23]。將每個樣品的所有miRNA 進行歸一化處理，處理后如果miRNA 在2 個材料內的表達量都小于1RPM，則不予考慮[25]。兩材料之間表達量差異大于2 倍（log2FC＞1 或＜-1），則認為是差異表達的小分子量RNA。

1.4.2 tRF 數據分析 從Ensembl 數據庫（http://grch37. ensembl.org/index.html）下載水稻參考基因組數據的注釋信息，從中篩選出tRNA 的注釋信息，將tRNA 序列從反密碼子處分開，區(qū)分為tRNA 的5'和3'端，構建tRF 序列比對文件。根據構建的5'和3'的注釋信息，使用featurecounts軟件統(tǒng)計與tRNA5’及3’序列匹配的reads 數目，并計算每種長度的tRF 所占的比例。

1.5 miRNA 和tRF 及其靶基因表達量分析

分別以日本晴鹽處理/非鹽處理根系總RNA 為模板，利用Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis 試劑盒（TaKaRa）加A 法進行反轉錄合成cDNA 第一鏈。利用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa）熒光定量試劑盒在 CFX96 Real-Time PCR Detection System 實時定量PCR 儀上對轉錄組數據表達差異的3個miRNA 基因（miR156、miR167 和miR396）進行定量分析。miRNA 的定量引物使用其成熟序列（U 用T 取代）作為qRT-PCR 的正鏈引物（F）（表1），試劑盒中的mRQ3'作為負鏈引物（R）。內參為U6，qRT-PCR 引物列于表1 中，每個反應設有3 個生物學重復和3 次技術重復。采用2–ΔΔCt方法[26]計算基因的相對表達量，并利用T 測驗分析基因的表達差異。

選取測序結果中差異表達的來源于 tRNA EPlORYSAT000373840 和EPlORYSAT000373812 的2個tRF，截取特異序列作為正鏈引物（F）（表1）， 進行qRT-PCR 分析，方法同miRNA 定量。

靶基因定量分析利用TaKaRa PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（TaKaRa）對總RNA 進行反轉錄。利用Primer3（http://primer3.ut.ee/）在靶基因外顯子區(qū)設計特異定量引物（表1），qRT-PCR 方法同上，內參基因為Osβ-Actin。

表1 水稻鹽脅迫相關基因qRT-PCR 引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences of salt stress related genes in rice

1.6 保守性miRNA 及tRF 靶基因分析

利用psRNATarget 網站（https://plantgrn.noble. org/psRNATarget/analysis）預測保守Small RNA 靶基因及其功能，在Gramene 網站（http://www.gramene. org/）使用BLAST 功能分析tRF 靶基因并進行功能注釋。

2 結果

2.1 水稻鹽脅迫響應表型

在1/2MS 培養(yǎng)基中對水稻進行鹽脅迫處理21 d， 150 mmol·L-1NaCl 處理與非鹽處理相比，水稻日本晴幼苗明顯受到鹽脅迫的抑制（圖1）。

圖1 NaCl 處理21 d 的水稻苗期表型Fig. 1 Phenotypes of rice seedlings at 21 days under NaCl

2.2 RNA-seq 測序數據保守miRNA 的鑒定

2.2.1 水稻小分子量RNA 測序 對日本晴鹽處理和非鹽處理21 d 根系的小分子量RNA 文庫進行高通量測序，以鑒定影響水稻鹽脅迫響應的miRNA 和tRF。為消除不同個體間的差異，每個樣品設置3 個生物學重復用于RNA 提取及后續(xù)測序分析。鹽處理和非鹽處理21 d 的水稻根系每個樣品設置3 個生物學重復，共6 個樣品，共得到150 501 099 條測序數據。平均每個樣品有25 083 517 個讀數，范圍從15 848 571到54 767 011。測序所得的小分子量RNA 幾乎涵蓋所有RNA 類型，包括tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、siRNA、miRNA、外顯子和內含子降解片段等。片段大小在18—75 bp，根據小分子量RNA 的長度獲得分類柱狀圖（圖2）。在鹽處理水稻根系中24 nt 的小分子量RNA 的量最多，占其測序數據的18.40%，非鹽處理水稻根系中24 nt 的小分子量RNA 的量占其測序數據的16.27%。鹽處理水稻根系中34—38 nt 的小分子量RNA 的量明顯多于非鹽處理水稻根系。

2.2.2 水稻鹽脅迫響應miRNA 的鑒定 將測序數據與水稻miRNA 數據庫miRBase（http://www.mirbase. org）中的成熟序列及前體序列進行比對，鑒定出保守的miRNA。以至少有一個樣品RPM＞1 為篩選條件， 共比對到451 個miRNA。為了尋找表達量較高的miRNA，以至少有一個樣品RPM＞50 為篩選條件，共比對到149 個miRNA（電子附表1）。

2.2.3 保守miRNA 差異表達分析 為了尋找水稻鹽脅迫響應相關的差異miRNA，對檢測到的149 個保守miRNA 進行均一化后的差異分析，以至少一組數據RPM＞500 為篩選條件，共得到54 個miRNA，分屬于25 個miRNA 家族。對在鹽脅迫處理和非鹽處理條件下水稻日本晴根系的miRNA 的表達量進行分析，以log2FC＞1 或＜-1 為篩選條件，共得到8 個表達量顯著上調的miRNA和23個表達量顯著下調的miRNA（表2），屬于12 個miRNA 家族。

圖2 小分子量RNA 的長度分類柱狀圖Fig. 2 Histogram of the length of small molecular RNA

圖3 檢測到的每個miRNA 家族成員數Fig. 3 The number of detected family members per miRNA family

水稻鹽脅迫相關的miRNA 的差異還反映在每個家族成員的數目上（圖3）。測序結果檢測到數目最多的miRNA 家族是osa-miR156，由10 個成員組成；隨后是osa-miR167、osa-miR397、osa-miR396和osa-miR159，分別有7、2、2 和3 個成員。其他的miRNA 家族，如osa-miR1882、osa-miR1432、osa-miR168、 osa-miR1432、osa-miR1876、osa-miR164 和osa-miR5077等，只檢測到一個鹽脅迫響應成員。說明不同miRNA家族成員對鹽脅迫信號響應情況存在差異。

表 2 水稻鹽脅迫響應差異表達miRNATable 2 Differentially expressed miRNAs in response to salt stress in rice

2.2.4 差異miRNA 靶基因預測 大多數植物內保守 的miRNA 與其靶基因具有高度的匹配，一個miRNA可以靶定多個靶基因。利用miRNA 預測軟件psRNA Target program（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）對在水稻鹽脅迫響應的31 個差異表達的miRNA（12個miRNA 家族）的靶基因進行了預測，共得到162個靶基因（電子附表2）。

2.2.5 差異miRNA 及其靶基因的qRT-PCR 表達分析 選擇在本研究中被檢測到的家族成員較多，且在其他物種中已有其與鹽脅迫相關報道的3 個差異表達的miRNA，包括miR156、miR167 和miR396，利用qRT-PCR 對其成熟序列進行檢測驗證，結果表明，高通量測序與qRT-PCR 雖然存在相對倍數的差異，但所有檢測miRNA 的相對表達差異與測序數據相一致（表2 和圖4）。這種表達量差異倍數差異也許是由于2 種技術的操作原理與精度不同導致的。利用qRT-PCR 對選擇的miRNA 對應的靶基因進行表達量分析。在鹽脅迫條件下，miR156 的靶基因OsSPL11（Os06g45310）和OsSPL13（Os07g32170）的相對表達量都較對照有顯著降低；miR167 的靶基因Os06g03830相對表達量顯著上調，而OsARF6（Os02g0164900）的相對表達量較對照極顯著下調；miR396 的靶基因OsGRF2（Os06g10310）的相對表達量和對照相比極顯著上調（圖4）。

圖4 水稻鹽脅迫相關miRNA 及其靶基因的qRT-PCR 表達分析Fig. 4 qRT-PCR expression analysis of salt stress miRNAs and target genes in rice

2.2.6 水稻鹽脅迫響應tRF 的鑒定及靶基因預測通過與tRNA 數據庫進行比較，以至少有一個樣品RPM＞1 為篩選條件[25]，與tRNA 5'端序列共比對到145 個tRF。與非鹽處理的日本晴相比，在鹽脅迫條件下的日本晴有77 個差異表達的tRF，其中有75 個上調表達的tRF，2 個下調表達的tRF（電子附表3），以至少一組數據RPM＞50 數據為篩選條件，共比對到6 個tRF，其中有3 個tRF 的表達量是上升的，其余3 個tRF 無差異（表3）。以至少有一個樣品RPM ＞1 為篩選條件，3'端共比對到78 個tRF，與非鹽處理的日本晴根系相比，在鹽脅迫條件下的日本晴根系有58 個上調表達的tRF，其余的tRF 無表達差異（電子附表3），以至少一組數據RPM＞50 數據為篩選條件，共比對到4 個tRF，其中3 個tRF 的表達量上調（表3）。與非鹽處理的日本晴根系相比，在鹽脅迫條件下的日本晴根系在 3'和 5'端比對到tRF 共有的來源tRNA 有2 個，分別為tRNA-Glu的EPlORYSAT000373797以及 tRNA-Asp 的EPlORYSAT000373840。由此可見，大多數tRF 受鹽脅迫誘導表達，推測這些差異tRF 可能是水稻鹽脅迫響應通路中的重要調節(jié)因子。

表3 水稻鹽脅迫相關tRF 的來源tRNATable 3 Source tRNA of tRFs related to salt stress in rice

利用Gramene 網站（http://gramene.org/）的BLAST功能對鹽脅迫誘導的6 個tRF 進行靶基因預測，共得 到29 個靶基因（表4）。

2.2.7 鹽脅迫誘導差異表達 tRF 及其靶基因的qRT-PCR 表達分析 對水稻鹽脅迫誘導差異表達的2 個tRF（EPlORYSAT000373812和EPlORYSAT000373840）進行qRT-PCR 驗證，結果表明，檢測tRF 的相對表達差異與測序數據相一致（圖5），與非鹽處理相 比，鹽處理水稻根系中2 個tRF 的相對表達量均顯著升高。利用qRT-PCR 對EPlORYSAT000373812 和EPlORYSAT000373840 靶基因 Os01g0810100、Os04g0531300 的表達量進行分析發(fā)現（圖5），與非鹽處理相比，鹽處理水稻根系中靶基因的相對表達量均顯著降低。

表4 水稻鹽脅迫差異表達tRF 預測靶基因Table 4 Predictive target genes for differential expression of tRFs in rice salt stress

圖5 水稻鹽脅迫相關tRF 及其靶基因的qRT-PCR 表達分析Fig. 5 qRT-PCR expression analysis of salt stress tRFs and target genes in rice

3 討論

3.1 使用RNA-seq 方法，可高通量獲得水稻鹽脅迫響應small RNA

已有研究表明，植物遭受非生物脅迫會誘導相應 miRNA 的表達變化，通過對其靶基因的轉錄后表達調控影響植株形態(tài)、生理和代謝以對逆境做出響應。RNA-Seq 技術已經成為目前研究脅迫相關的miRNA功能及調控路徑的主要方法[27-29]。

水稻是鹽敏感作物，高鹽環(huán)境能夠影響水稻正常的代謝活動，引起細胞壁的破壞、膜系統(tǒng)破壞、細胞質溶解，產生滲透脅迫甚至離子毒害，并影響基因組的穩(wěn)定性，最終引起細胞凋亡或植株死亡，嚴重影響水稻的產量和品質。miRNA 在水稻鹽脅迫響應通路中發(fā)揮重要的調控作用。本研究通過RNA-Seq 手段共檢測到水稻根系鹽脅迫差異表達的miRNA 54 個，分屬于25 個miRNA 家族，其中8 個miRNA 表達量上調，23 個miRNA 表達量下調。利用實時熒光定量PCR 方法對測序結果進行了驗證，miRNA 定量結果與測序結果基本一致，說明RNA-Seq能夠高通量、準確可靠地鑒定鹽脅迫下水稻根系miRNA 的表達情況。

由于miRNA 的堿基序列較短，靶定的靶基因較多，且參與許多較復雜的生物學過程并起很重要的調控作用，因而預測miRNA 的靶基因是研究miRNA 作用機制的基礎，研究miRNA 的功能及作用機制就要研究靶基因與其miRNA 的相互作用方式。本研究運用psRNATarget 網站分析鑒定了RNA-Seq 中篩選得到的鹽脅迫相關差異表達的miRNA 靶基因162 個。這些miRNA 通過對其靶基因的轉錄后表達調控影響水稻鹽脅迫響應的生理生化過程。

3.2 miRNA 在不同植物生長發(fā)育和脅迫響應中功能的通用性

在本研究檢測到的差異表達基因中，有8 個miRNA 家族在其他物種中也被報道為鹽脅迫響應miRNAs，如表達量下調的osa-miR397、osa-miR396、osa-miR156、osa-miR167、osa-miR1432 和表達量上調的osa-miR159、osa-miR168、osa-miR164。研究表明，紅花miR397a表達可增強植物對NaCl 的敏感性[30]；番茄的miR397過表達植株中，LeLACmiR397表達量降低，從而使番茄出現鹽敏感表型[31]。煙草中Sp-miR396a-5p 通過作用于NtGRF1和NtGRF3的調控網絡，靶向NtGRF7調控滲透應激反應基因的表達和病原菌感染，在非生物脅迫中發(fā)揮重要作用[32]。紫花苜蓿在重度鹽脅迫下，miR156 下調了SPL 轉錄因子家族基因，修飾了重要轉錄因子的表達，并下調下游鹽脅迫應答基因，說明miR156 在紫花苜蓿對鹽脅迫的生理反應和轉錄過程中起著調節(jié)作用[33]。在番茄中鹽、干旱和熱處理導致了miR167 表達量下調，表明不同脅迫激活了miR167a調控替代機制[34]；擬南芥中miR167 與其靶基因ARF6和ARF8之間存在反饋調節(jié)作用，ARF6激活miR167表達，ARF8抑制miR167 表達，它們之間的彼此激活或抑制作用調控不定根的形成[35]。毛竹經強光、黑暗、高溫、低溫、NaCl 等脅迫處理后，葉片中phe-miR1432的表達下調[36]。YIN 等[37]利用棉花耐鹽品種和鹽敏感品種研究miRNA 的表達差異，發(fā)現在鹽脅迫條件下，鹽敏感品種中的miR159 表達下調；而在耐鹽品種中miR156a/d/e、miR169 顯著下調，miR167a、miR397a/b上調。miR168 介導的反饋調控環(huán)調節(jié)ARGONAUTE1（AGO1）的穩(wěn)態(tài)對基因表達調控和植物發(fā)育至關重要，過表達miR168a 的植株和AGO1功能缺失突變體均表現出ABA 超敏性和耐旱性，而mir168a突變體表現出ABA 低敏性和干旱超敏性[38]；高鹽條件下擬南芥中miR168 的表達量在初期上升，但6 h 后恢復正常水平[39]。李賀春等[40]利用miRNA 基因芯片雜交技術對鹽脅迫條件下耐鹽棉花品系和鹽敏感棉花品種的miRNA 進行差異表達發(fā)現，在鹽脅迫條件下miR156、miR164、miR167、miR397 和miR399 在耐鹽棉花品系較鹽敏感品系表達上調。以上分析表明，部分水稻中的鹽脅迫響應miRNA 在其他植物的鹽脅迫信號通路中依然適用，說明了這些miRNA 在調節(jié)不同植物生長發(fā)育和脅迫響應中功能的通用性及進化的整體性。

在miRNA 與下游靶基因的對應關系中，某一miRNA 可能有不止一個靶基因，這些靶基因可能含有類似結構域，也可能隸屬不同家族的蛋白，涉及植株不同的發(fā)育進程和調控路徑。如本研究中的miR156 參與了水稻鹽脅迫響應過程，其靶基因有OsSPL11和OsSPL12，說明miRNA 與其靶基因共同參與的植物逆境應答是一個極其復雜多變的動態(tài)調控網絡。

3.3 tRF 在水稻鹽脅迫條件下差異表達

tRF 作為新近發(fā)現的含量豐富的非編碼小分子調控性RNA，日益受到研究者的關注。盡管tRF 已被證明在生物細胞中普遍存在，其產生機制、結構、分布、生物學功能和作用機制等方面的研究仍處于起步階段。已有研究表明，tRF 可調控基因的轉錄和翻譯[41-43]、應激條件下的細胞應答[44-46]、惡性腫瘤[47-48]等人類疾病，但目前植物中tRF 的研究鮮有報道。本研究通過RNA-Seq 技術手段，在全基因組層面挖掘了水稻鹽脅迫響應tRF。鹽脅迫處理后，水稻根系產生的34—38nt tRF 顯著多于未處理材料，說明tRF 的產生并非是隨機的，而是通過某種特定機制或特定信號誘發(fā)tRNA 的加工[41,17]。與對照組相比，共檢測到鹽脅迫響應的6 個表達量很高且由鹽脅迫誘導的tRF，而未檢測到表達量下調的tRF。推測這些差異tRF 是潛在的水稻鹽脅迫響應tRF。利用實時熒光定量PCR手段證實了它們的存在和驗證了測序結果的可靠性。進一步證明tRF 可能受到鹽脅迫誘導，tRNA 加工增強，導致tRF 表達量上升。

靶基因分析發(fā)現，這些tRF 的靶基因為葉綠體核糖核酸酶Ⅲ域蛋白、F-box 和DUF 結構域蛋白質、LMBR1 膜內蛋白、內吞體分選轉運復合體及玉米素葡萄糖基轉移酶等，表明其參與了水稻不同的調控路徑，也說明了tRF 在水稻鹽脅迫調控網絡中的功能重要性。而不同結構的tRF 與其靶基因之間的對應關系，tRF 表達量與其靶基因表達量之間的對應關系有待進一步的研究。

根據以上的研究結果，構建了依賴miRNA 和tRF的水稻鹽脅迫響應調控網絡（圖6）。

4 結論

水稻中大多數tRF 受鹽脅迫誘導表達；共檢測到12 種水稻根系中鹽脅迫響應miRNA，其靶基因多為轉錄因子編碼基因，推測其通過對其靶基因轉錄因子的轉錄后調控參與了鹽脅迫響應的表達調控。其中8個水稻鹽脅迫響應miRNA 家族是不同物種間保守的通用鹽脅迫響應miRNA。另外，從轉錄組水平挖掘出水稻鹽脅迫響應tRF，并鑒定了6 個鹽脅迫誘導表達的tRF。

圖6 水稻根系中可能的鹽脅迫響應miRNA 及tRF 調控網絡Fig. 6 The potential regulating network of salt-responsive miRNAs and tRFs in rice roots