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      三種酶對(duì)采后‘海沃德’和‘華特’獼猴桃 AsA 的氧化作用

      2020-02-28 01:49:14封琦李朝政高貴田吳悠肖妍趙武奇雷玉山
      關(guān)鍵詞:海沃德華特貯藏期

      封琦,李朝政,高貴田,吳悠,肖妍,趙武奇,雷玉山

      (1 陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,西安 710119;2 陜西省農(nóng)村科技開發(fā)中心,西安 710054)

      0 引言

      【研究意義】抗壞血酸(ascorbic acid,AsA),又稱維生素C(Vc),是廣泛存在于植物中的抗氧化劑主要清除細(xì)胞內(nèi)的氧化物和超氧化物,或作為某些還原酶的輔因子參與還原反應(yīng)[1]。AsA 還參與植物的衰老調(diào)控[2]。另一方面,AsA 是人體不可缺少但無(wú)法自身合成,必須從食物中獲取的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。獼猴桃(Actinidia)果實(shí)AsA 含量高于大多數(shù)水果,享有“Vc之王”的美稱。深入了解獼猴桃果實(shí)采后AsA 的變化規(guī)律及影響因素,AsA 在成熟與衰老中的作用及其機(jī)制,對(duì)調(diào)控果實(shí)成熟和衰老進(jìn)程并有效保持果實(shí)采后品質(zhì)和延長(zhǎng)貯藏時(shí)間具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】植物中AsA 的含量由合成途徑和循環(huán)再生途徑綜合調(diào)節(jié)[3]。AsA 主要合成途徑為L(zhǎng)-半乳糖途徑[4],循環(huán)再生途徑主要為抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)(AsA-GSH)[5],是氧化態(tài)AsA 再生的主要途徑。在該途徑中,AsA 通過(guò)APX[6]或AO[7-8],將AsA 氧化成單脫氫抗壞血酸(monodehydroascorbate,MDHA),同時(shí)AsA 作為電子供體在APX 清除H2O2的過(guò)程中被氧化成MDHA[6],部分MDHA 發(fā)生非酶促歧化反應(yīng)后得到DHA,生成的DHA 借助AsA-GSH 循環(huán)還原成最初的AsA[9],APX 對(duì)AsA 的積累有調(diào)節(jié)作用[10]。MA 等[11]研究表明不同品種獼猴桃果實(shí)AsA 含量存在較大差異。原玉林等[3]研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中AsA 含量受合成和再生的共同調(diào)控,不同基因型獼猴桃果實(shí)中AsA 和AsA 相關(guān)氧化物水平存在明顯的多樣性,并且 L-半乳糖 1,4-內(nèi)酯脫氫酶(GalLDH)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)的活性均與AsA 含量存在極顯著相關(guān)性,并且MDHAR 活性與AsA 含量和APX 都有較高的相關(guān)性。目前,植物AsA 合成與氧化的研究主要集中在AsA 生物合成途徑方面[12],對(duì)果蔬采后AsA 分解氧化及其機(jī)理鮮有報(bào)道。薛敏等[13]研究發(fā)現(xiàn)‘海沃德’獼猴桃果實(shí)在貯藏期AsA 氧化率高達(dá)61.5%,另有研究表明,‘華特’獼猴桃在采后AsA 含量始終保持較高水平,在貯藏末期AsA的氧化率只有10%[14]?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】筆者課題組前期采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),發(fā)現(xiàn)‘海沃德’獼猴桃采后AsA 氧化通路中AO、漆酶基因家族中存在表達(dá)差異[15],并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 進(jìn)行了驗(yàn)證,為從基因水平研究獼猴桃采后AsA 分解氧化奠定了基礎(chǔ)?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以AsA 含量較低、采后流失嚴(yán)重的‘海沃德’獼猴桃和AsA 含量高、采后流失少的‘華特’獼猴桃作為試驗(yàn)材料,通過(guò)研究?jī)蓚€(gè)品種的獼猴桃在采后25℃貯藏條件下AsA 含量和相關(guān)酶活性及其基因表達(dá)的變化差異,以期探明影響獼猴桃AsA 含量變化的相關(guān)機(jī)制,為今后通過(guò)基因?qū)用婢S持和減少獼猴桃果實(shí)采后AsA 的損失提供理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 試驗(yàn)材料

      ‘華特’獼猴桃、‘海沃德’獼猴桃,于2017 年10 月21 號(hào)采于周至縣虎峰村的陜西佰瑞獼猴桃研究院有限公司實(shí)驗(yàn)基地。

      挑選果型大小均勻、完整、無(wú)病蟲害的果實(shí)于采后當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室?!A特’獼猴桃、‘海沃德’獼猴桃分別按每30 個(gè)一組放入已消毒的筐中,框外側(cè)套厚度為0.05 mm 的聚乙烯薄膜袋,讓袋口處于自然合攏狀態(tài),置于(25±0.5)℃的恒溫箱貯藏;每隔5 d 分別選‘華特’獼猴桃30 個(gè)和‘海沃德’獼猴桃30 個(gè),取果實(shí)果肉、中軸部分將其切碎混合后用液氮速凍,用錫箔紙把樣品包好后存放在-80℃冰箱,用于酶活測(cè)定及基因表達(dá)研究。

      1.2 主要儀器與試劑

      儀器:pH 計(jì),北京科偉永興儀器公司;超高速低溫離心機(jī),美國(guó)Sigma 公司;紫外分光光度計(jì),瑞典福斯公司;全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀,美國(guó)熱電公司;BIO-RAD梯度PCR 儀,北京元業(yè)伯樂(lè)科技發(fā)展有限公司;DYY-4C 型電泳儀,北京市六一儀器廠;格蘭仕微波爐,格蘭仕微波爐電器有限公司;XW-80A 漩渦混合儀,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;JY02G 型凝膠成像儀,北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;NanoDrop 2000 微量快速核酸定量?jī)x,賽默飛爾公司;RF-6000 熒光定量PCR 儀,美國(guó)熱力公司。

      分析純化學(xué)試劑:BP(純度>97.0%),磷酸,無(wú)水乙醇,標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸,氯化鐵(FeCl3),三氯乙酸(TCA)購(gòu)于天津天力化學(xué)試劑有限公司;HiPure Plant RNA Mini Kit,美基生物工程有限公司;Light cycler RNA SYBR green I,Sigma 生物工程有限公司;TRUEscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit,北京艾德萊生物科技有限公司;DNA Marker-D、6×Loading Buffer、EDTA、Tris-HCl、瓊脂糖,TaKaRa(大連)生物工程有限公司。

      1.3 試驗(yàn)方法

      1.3.1 T-AsA、AsA、DHA 含量測(cè)定 參考趙玉梅等[16]的方法測(cè)定。

      標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:在波長(zhǎng)534 nm 處測(cè)定吸光值,將AsA 質(zhì)量設(shè)置為橫坐標(biāo),吸光度值設(shè)置為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并求線性回歸方程。

      樣品提?。簻?zhǔn)確稱4.0 g 獼猴桃果實(shí)樣品,放入已加5 mL 50 g·L-1TCA 溶液的研缽中,冰浴條件下將樣品研磨成勻漿后轉(zhuǎn)移到25 mL 的容量瓶,用TCA 溶液沖洗研缽一并轉(zhuǎn)移到容量瓶后定容至刻度,搖勻,冰浴條件下提取10 min 后過(guò)濾,將濾液4℃、12 000×g離心10 min 后收集上清液,即樣品提取液。低溫備用(‘華特’獼猴桃果實(shí)上清液需稀釋10 倍備用)。

      T-AsA 測(cè)定:取1.0 mL 樣品提取液,加0.5 mL濃 度 為 60 mmol·L-1的 DTT- 乙 醇 溶 液, 用Na2HPO4-NaOH 溶液將pH 調(diào)至7—8,室溫下靜置10 min,加0.5 mL 的TCA 溶液。按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的方法進(jìn)行測(cè)定。記錄波長(zhǎng)534 nm 處的吸光值。重復(fù)3 次。

      AsA 測(cè)定:取1.0 mL 樣品提取液,加1.0 mL 的TCA 溶液,按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的方法進(jìn)行測(cè)定。記錄波長(zhǎng)534 nm 處的吸光值。重復(fù)3 次。

      DHA 含量等于樣品中T-AsA 的含量減去原有的AsA 的含量。

      1.3.2 漆酶、AO、APX 活性的測(cè)定 漆酶、AO、APX活性測(cè)定用Mlbio 酶聯(lián)免疫分析試劑盒(分別為Plant Laccase ELISA KIT、Plant AO ELISA KIT、Plant APX ELISA KIT)進(jìn)行測(cè)定。

      1.3.3 RNA 的提取及質(zhì)檢 裂解液加入濃度為2%(w/v)的PVP-40,其余步驟按照植物RNA 小提試劑盒說(shuō)明書(HiPure Plant RNA Mini Kit)進(jìn)行;通過(guò)2%的瓊脂糖凝膠電泳和微量快速核酸定量?jī)x檢測(cè)RNA的純度、濃度。

      1.3.4 單鏈cDNA 的合成 將檢測(cè)合格的RNA 使用第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TRUEscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit)進(jìn)行單鏈cDNA 合成。

      1.3.5 熒光定量PCR 用Gene ID 在獼猴桃數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/home.cgi)檢索并獲得相應(yīng)基因的CDS 區(qū)[17],通過(guò)Primer 6.0軟件,在NCBI 上使用Primer-BLAST 程序?qū)⒃O(shè)計(jì)的引物進(jìn)行模擬擴(kuò)增,通過(guò)比對(duì)引物擴(kuò)增的特異性,篩選出特異性最強(qiáng)的熒光定量PCR 引物對(duì),引物見(jiàn)表1。

      按照Light cycler RNA SYBR green I 試劑盒操作,以18s RNA 基因?yàn)閮?nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性10 min,90℃變性20 s、61℃退火20 s,40 個(gè)循環(huán),熔解曲線溫度范圍為55—95℃。分析熒光值變化曲線及熔解曲線,用2-△△Ct法計(jì)算兩個(gè)品種獼猴桃在不同的貯藏天數(shù)時(shí)AO、漆酶、APX相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。

      表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析使用的引物Table 1 Primers for quantitative real-time PCR

      1.3.6 數(shù)據(jù)處理 樣品進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)取平均值,運(yùn)用SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和差異性分析,取P<0.05 為顯著相關(guān),P<0.01 為極顯著相關(guān),采用Origin 8.6 繪圖。

      2 結(jié)果

      2.1 獼猴桃中T-AsA、AsA、DHA 含量

      ‘海沃德’和‘華特’獼猴桃在采后貯藏期AsA含量存在顯著差異(圖1-A)。‘海沃德’獼猴桃果實(shí)采后第1 天AsA 含量只有‘華特’獼猴桃的14%,在第6—11 天下降速度加快,在第11—21 天下降速度又趨于平緩,在貯藏末期,AsA 含量下降了約45%,損失嚴(yán)重?!A特’獼猴桃采后貯藏期AsA 含量遠(yuǎn)高于‘海沃德’獼猴桃,含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì);在第6—11 天AsA 含量急劇上升并達(dá)到峰值,從第11 天到貯藏末期,AsA 含量緩慢下降,仍高于采后第1 天AsA 含量,整體呈上升趨勢(shì)。

      ‘海沃德’獼猴桃DHA 含量在整個(gè)貯藏期都低于‘華特’獼猴桃,兩個(gè)品種都呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)(圖1-B)?!N值隆J猴桃第1—16 天DHA含量處于緩慢下降的趨勢(shì),在第16—21 天含量略有回升,在第21 天仍低于初期含量。‘華特’獼猴桃在采后第1—16 天,DHA 含量處于較快下降的趨勢(shì)且達(dá)到最低點(diǎn),16 d 之后含量開始回升,但仍遠(yuǎn)低于初期含量。

      ‘海沃德’和‘華特’獼猴桃的T-AsA 含量與其AsA 含量的變化趨勢(shì)接近(圖1-C)。T-AsA 是AsA與DHA 之和,由于兩個(gè)品種的獼猴桃果實(shí)中AsA 含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于DHA 含量,因此,AsA 含量的變化直接影響T-AsA 的變化趨勢(shì)。

      2.2 獼猴桃AsA/DHA 比值的變化

      AsA/DHA 的比值反應(yīng)果實(shí)中AsA 的氧化還原狀態(tài)和程度。如圖2,‘海沃德’和‘華特’獼猴桃在采后初期AsA/DHA 比值接近,‘海沃德’AsA/DHA比值整體緩慢波動(dòng)呈下降趨勢(shì),而‘華特’呈先上升后下降趨勢(shì)。在貯藏第1—6 天,兩個(gè)品種的AsA/DHA比值都略微上升,‘華特’上升較快?!N值隆诘?—11 天,AsA/DHA 比值呈下降趨勢(shì)?!A特’在第6—16 天,比值急劇上升且達(dá)到頂峰。在整個(gè)貯藏后期,‘海沃德’獼猴桃的AsA/DHA 比值遠(yuǎn)低于‘華特’。

      2.3 獼猴桃AO、漆酶、APX 活性的變化

      ‘海沃德’獼猴桃在貯藏期AO 活性呈先上升后下降的趨勢(shì),且在采后初期低于‘華特’,第1—16天緩慢上升,在第16 天達(dá)到最高值后呈下降趨勢(shì)。‘華特’獼猴桃在貯藏期AO 活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì),第11 天到達(dá)最低值,之后活性上升,但仍低于‘海沃德’(圖3-A)。

      在整個(gè)采后貯藏期,‘海沃德’獼猴桃的漆酶活性始終高于‘華特’,但兩者變化趨勢(shì)相似,均表現(xiàn)為先下降后上升再下降的趨勢(shì)。‘海沃德’獼猴桃漆酶活性在第16 天達(dá)到峰值后開始下降,在貯藏末期活性仍高于‘華特’;‘華特’獼猴桃在貯藏第1—11 天時(shí)漆酶活性呈快速下降趨勢(shì),在第11天達(dá)到最低值,貯藏末期的活性只有‘海沃德’的一半(圖3-B)。

      ‘華特’獼猴桃在貯藏期APX 活性始終高于‘海沃德’,且在第1 天遠(yuǎn)高于‘海沃德’,在采后第1—6天,‘華特’APX 活性迅速下降,在貯藏后期,呈現(xiàn)波動(dòng)變化趨勢(shì),但始終維持在20 U·g-1FW 以上?!N值隆J猴桃APX 活性在貯藏過(guò)程中呈先上升后下降的趨勢(shì),在第11 天達(dá)到峰值,隨后開始下降,貯藏后期活性始終維持在14.5 U·g-1FW 左右(圖3-C)。

      圖1 兩個(gè)品種獼猴桃采后AsA(A)、DHA(B)、T-AsA(C)含量變化Fig. 1 Changes of AsA (A), DHA (B), and T-AsA (C) contents of two varieties of kiwifruit during storage

      圖2 兩個(gè)品種獼猴桃采后AsA/DHA 比值變化Fig. 2 Changes of AsA/DHA ratio of two varieties of kiwifruit during storage

      圖3 兩個(gè)品種獼猴桃采后AO(A)、漆酶(B)、APX(C)活性變化Fig. 3 Changes of AO (A), laccase (B) and APX (C) activities of two varieties of kiwifruit during storage

      2.4 獼猴桃AsA 含量與T-AsA、AsA/DHA 及3 個(gè)酶的相關(guān)性分析

      如表2,‘海沃德’獼猴桃中AsA 含量與T-AsA含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),且相關(guān)系數(shù)為0.999,與AO 活性呈顯著負(fù)相關(guān)性且相關(guān)系數(shù)為0.910;‘華特’獼猴桃AsA 含量與T-AsA 含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),且相關(guān)系數(shù)為0.993,與AO 活性呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),且相關(guān)系數(shù)為0.958。

      表2 兩個(gè)品種獼猴桃AsA 含量與相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)Table 2 Relation coefficient among AsA content and related indexes of two varieties of kiwifruit

      2.5 兩個(gè)品種獼猴桃AsA 氧化相關(guān)酶基因相對(duì)表達(dá)量的變化

      Achn020161、Achn230551和Achn316521是獼猴桃AO 基因家族中的3 個(gè)基因。兩個(gè)品種的獼猴桃采后貯藏期內(nèi),Achn020161的表達(dá)變化趨勢(shì)如圖4-A 所示,在‘海沃德’中的表達(dá)量在第16 天達(dá)到峰值;‘華特’獼猴桃的表達(dá)量沒(méi)有明顯變化,且整個(gè)貯藏期表達(dá)量都明顯低于‘海沃德’。從圖4-B 可以看出,‘海沃德’獼猴桃Achn230551處于表達(dá)量較低的狀態(tài),且始終低于‘華特’;在‘華特’中,其表達(dá)量在第16 天達(dá)到峰值,第21 天時(shí)與最初表達(dá)量持平。由圖4-C 可知,‘海沃德’獼猴桃Achn316521表達(dá)量在第6 天達(dá)到最高表達(dá)量后急劇下降,第11 天后開始上升;‘華特’獼猴桃其基因表達(dá)量呈波動(dòng)變化,貯藏末期與最初表達(dá)量沒(méi)有明顯差異。

      圖4 兩個(gè)品種獼猴桃AsA 氧化相關(guān)酶基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig. 4 Changes of expression levels of related enzyme genes of two varieties of kiwifruit during storage

      Achn007661、Achn191341、Achn163871是獼猴桃漆酶基因家族中的3 個(gè)基因。由圖4-D 可見(jiàn),在獼猴桃整個(gè)采后貯藏期內(nèi),‘海沃德’Achn007661表達(dá)量在第16 天最高,‘華特’的表達(dá)量一直明顯低于‘海沃德’。Achn191341在‘海沃德’獼猴桃中表達(dá)量總體呈上升的趨勢(shì),第16 天表達(dá)量達(dá)到峰值且是第1天的5 倍;‘華特’獼猴桃表達(dá)量變化趨勢(shì)不明顯,且第6 天后明顯低于‘海沃德’(圖4-E)?!N值隆J猴桃Achn163871表達(dá)量在第11 天達(dá)到最高;‘華特’獼猴桃其表達(dá)量呈持續(xù)上升趨勢(shì),且貯藏末期高于‘海沃德’(圖4-F)。

      Achn123021、Achn082241、Achn187071是獼猴桃APX 基因家族中的3 個(gè)基因?!N值隆J猴桃Achn123021表達(dá)量在第16 天達(dá)到峰值;‘華特’獼猴桃其表達(dá)量在第1—6 天急劇上升,到貯藏末期相比于第1 天上升了約4 倍(圖4-G)?!N值隆蠥chn082241表達(dá)量始終高于‘華特’,第11 天表達(dá)量達(dá)到峰值;在‘華特’中的表達(dá)量變化整體差異不明顯(圖4-H)?!N值隆J猴桃中Achn187071表達(dá)量在第11 天表達(dá)量開始急劇上升;‘華特’獼猴桃的表達(dá)量在前期稍有下降,但整體變化趨勢(shì)不明顯(圖4-I)。

      2.6 獼猴桃AsA含量與AsA氧化相關(guān)酶基因相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性

      如表3 所示,AO 基因家族中,Achn020161表達(dá)量與‘海沃德’‘華特’獼猴桃果實(shí)中AsA 含量的變 化具有顯著負(fù)相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為0.922、0.920;Achn191341表達(dá)量與‘海沃德’獼猴桃中的AsA 含量變化正相關(guān),與‘華特’沒(méi)有顯著相關(guān)性;Achn316521表達(dá)量與‘海沃德’‘華特’獼猴桃的AsA 含量無(wú)顯著相關(guān)性。

      漆酶基因家族中,Achn007661表達(dá)量與‘海沃德’‘華特’獼猴桃貯藏期AsA 含量的變化呈顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.947、0.950;Achn191341表達(dá)量與‘海沃德’獼猴桃中的AsA 含量的變化呈負(fù)相關(guān),與‘華特’沒(méi)有顯著相關(guān)性;Achn163871表達(dá)量與‘海沃德’‘華特’獼猴桃中AsA 含量的變化沒(méi)有顯著相關(guān)性。

      APX 基因家族中,Achn123021表達(dá)量與‘海沃德’獼猴桃中AsA 的含量變化呈負(fù)相關(guān)性,與‘華特’沒(méi)有顯著相關(guān)性;Achn082241表達(dá)量與‘海沃德’‘華特’獼猴桃中的 AsA 含量變化無(wú)顯著相關(guān)性;Achn187071表達(dá)量與‘海沃德’獼猴桃中AsA 含量呈負(fù)相關(guān),與‘華特’無(wú)顯著相關(guān)性。

      表3 兩個(gè)品種獼猴桃AsA 含量與相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)Table 3 Relation coefficient among AsA content and genes expression of two varieties of kiwifruit

      3 討論

      3.1 AsA/DHA 對(duì)獼猴桃采后AsA 氧化的影響

      獼猴桃以富含高AsA 而著名,但在貯藏后期,不同品種的獼猴桃果實(shí)AsA 的損失情況有顯著差異?!A特’獼猴桃具有較高的AsA 含量且在采后貯藏期流失較少[14]。而‘海沃德’獼猴桃與‘華特’相比,AsA 在采后貯藏期損失很大[18]。DHA 是AsA 中的一種氧化產(chǎn)物,AsA 很容易在酶的作用下氧化,同時(shí)在脫氫抗壞血酸還原酶的作用下,DHA 還可以轉(zhuǎn)化為AsA 以維持較高水平。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),‘華特’獼猴桃AsA 含量是‘海沃德’的8—10 倍,與原玉林等[3]的研究結(jié)果一致;造成AsA 含量差異的主要因素為AsA合成和循環(huán)再生機(jī)制,‘華特’貯藏前期出現(xiàn)AsA 含量的上升現(xiàn)象,說(shuō)明果實(shí)中的AsA 合成和再生的協(xié)作速率大于氧化速率。有研究表明,‘華特’貯藏前期DHAR 活性上升,后期受到反饋抑制活性下降[19],因此,DHAR 以DHA 為底物會(huì)促進(jìn)果實(shí)貯藏前期AsA含量的積累;‘海沃德’獼猴桃剛好與其相反,說(shuō)明‘海沃德’AsA 氧化速度大于再生合成的速度。‘華特’獼猴桃DHA 含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于‘海沃德’,兩者變化趨勢(shì)一致,DHA 除自身氧化外還參與AsA 再生循環(huán)。由于獼猴桃中AsA 含量遠(yuǎn)高于DHA 含量,所以,‘華特’和‘海沃德’的T-AsA 含量變化趨勢(shì)與AsA基本保持一致,受DHA 變化影響很小。AsA/DHA 的比值反映的是果實(shí)中AsA 的氧化還原狀態(tài)[18],比值越大,說(shuō)明抗氧化能力越高[20],越有利于維持果實(shí)中T-AsA 的含量。AsA/DHA 的高比值可以阻止AsA的降解,‘華特’在貯藏期內(nèi)AsA 含量整體上升而DHA 下降,保持著較高的AsA 再生能力,AsA 再生酶可能對(duì)其后期可以保持較高的抗氧化能力也起到一定作用[21]?!A特’獼猴桃和‘海沃德’獼猴桃在貯藏過(guò)程中AsA/DHA 的比值存在顯著差異,較高含量的DHA 還原以及AsA/DHA 的高比值對(duì)AsA 的積累起到重要作用。

      3.2 3 種酶對(duì)獼猴桃采后AsA 氧化的影響

      通過(guò)AsA-GSH 循環(huán),植物有清除活性氧(ROS)的能力,同時(shí),AsA 會(huì)被氧化為單脫氫抗壞血酸(MDAH),這種能力在酶的催化下會(huì)增強(qiáng)。前人研究表明,在AsA-GSH 循環(huán)中,AO 在有氧情況下,APX 提供電子供體是AsA 分解氧化的主要途徑,植物APX 表達(dá)受生物和非生物脅迫以及植物發(fā)育期間的調(diào)節(jié)[22-24]。漆酶是一種含銅多酚氧化酶[25],作為催化劑可清除ROS,也可與抗壞血酸、胺類等物質(zhì)反應(yīng)[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn),AO 活性與兩個(gè)品種獼猴桃AsA 含量呈顯著負(fù)相關(guān)性;漆酶活性與兩個(gè)品種獼猴桃AsA 含量呈負(fù)相關(guān)性,與筆者課題組前期基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)漆酶可能是‘海沃德’采后氧化AsA 酶的結(jié)論一致[15]。獼猴桃AO 和漆酶活性在‘華特’采后第11 天達(dá)到最低值,在‘海沃德’采后第16 天達(dá)到最高值,而在采后第11 天‘華特’獼猴桃的AsA 含量上升到峰值,DHA 的含量接近最低值,推測(cè)這是導(dǎo)致‘華特’獼猴桃AsA 含量在貯藏后期始終維持較高含量而‘海沃德’AsA 含量呈下降趨勢(shì)的主要原因。進(jìn)一步比較AO 與漆酶的活力,發(fā)現(xiàn)AO 是漆酶活力的3—4 倍,據(jù)此推測(cè),AO 是導(dǎo)致兩個(gè)品種獼猴桃采后氧化的關(guān)鍵酶,漆酶對(duì)獼猴桃采后AsA 的氧化有一定的作用。而APX的活力變化趨勢(shì)在兩個(gè)品種之間差異較大,在采收當(dāng)天,‘華特’獼猴桃是‘海沃德’的2 倍多,在采后第7—21 天,‘華特’始終高于‘海沃德’;在采后第1—6 天,‘華特’APX 活力劇增,與其采后1—6 天的AsA 升高及DHA 降低的變化吻合,但采后第7—21 天,APX 活力變化與AsA 及DHA變化吻合度較低。而‘海沃德’APX 活力與其采后AsA 含量的相關(guān)系數(shù)僅為0.253,因此,APX 不是兩個(gè)品種氧化AsA 的主要酶,這與鐘雨[28]在‘華特’獼猴桃中的研究結(jié)果一致。植物中AsA-GSH循環(huán)途徑需要多個(gè)同工酶共同參與[29],這3 種酶對(duì)于ROS 的清除應(yīng)該都有一定的作用,但具體如何參與ASA 的氧化并不清楚,還需要進(jìn)一步探究驗(yàn)證。

      3.3 相關(guān)基因?qū)ΛJ猴桃采后AsA 氧化的影響

      AO 基因家族中,Achn020161在兩個(gè)品種獼猴桃中的表達(dá)變化趨勢(shì)與其對(duì)應(yīng)的酶活性變化趨勢(shì)相近,與其AsA 含量呈顯著負(fù)相關(guān),推測(cè)該基因是導(dǎo)致兩個(gè)品種獼猴桃AsA 氧化的關(guān)鍵基因之一。Achn230551、Achn316521表達(dá)量與AsA 含量無(wú)顯著相關(guān)性,推斷這兩個(gè)基因可能并不參與調(diào)控AO 氧化AsA 的過(guò)程。

      漆酶基因家族的Achn007661與Achn191341在‘海沃德’獼猴桃中表達(dá)量顯著高于‘華特’;‘華特’獼猴桃Achn007661與Achn191341在采后平穩(wěn)下降,與其對(duì)應(yīng)品種的漆酶活性變化趨勢(shì)基本一致,相關(guān)分析表明Achn007661與Achn19134與兩個(gè)品種AsA 變化分別為極顯著相關(guān)與負(fù)相關(guān),推測(cè)Achn007661與Achn19134對(duì)氧化AsA 有一定影響。Achn163871表達(dá)量在‘海沃德’獼猴桃中為先上升后下降的趨勢(shì),第11 天表達(dá)量達(dá)到最高,與漆酶活力變化趨勢(shì)一致;但在‘華特’獼猴桃中的表達(dá)量持續(xù)上升,且貯藏末期高于‘海沃 德’,與漆酶活力變化趨勢(shì)相反,表明Achn163871與兩個(gè)品種獼猴桃氧化 AsA 無(wú)相關(guān)性,也暗示Achn163871可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

      APX 基因家族的Achn123021在‘海沃德’獼猴桃中表達(dá)量與APX 活力的變化趨勢(shì)一致,與AsA 含量呈負(fù)相關(guān)性;但在‘華特’中采后第1—6 天APX活力下降一半,其表達(dá)量反而上升,采后第11 天,Achn123021表達(dá)量是采收當(dāng)天的4.5 倍,與AsA 含量上升的表型相反。在兩個(gè)品種中,Achn082241、Achn187071表達(dá)量變化與 APX 活力變化趨勢(shì)相近,但兩個(gè)基因的表達(dá)量在‘海沃德’中顯著高于‘華特’,與‘華特’APX 活性整體高于‘海沃德’的結(jié)果相反。其原因可能是由于本研究中APX基因家族Achn082241、Achn187071的CDS 序列來(lái)自中華獼猴桃‘紅陽(yáng)’基因組數(shù)據(jù)庫(kù)[17],而本研究所用的材料是美味獼猴桃‘海沃德’與毛花獼猴桃‘華特’,與中華獼猴桃‘紅陽(yáng)’存在較大的遺傳差異[30-31],APX 基因編碼區(qū)的序列也可能存在一定的多態(tài)性。另一方面,較多的研究表明APX 在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)等生理過(guò)程中都發(fā)揮著非常重要的作用,它催化H2O2依賴的L-抗壞血酸發(fā)生氧化作用,對(duì)AsA 表現(xiàn)出高度的專一性[23,32-33]。本研究不論從酶學(xué)層面,還是基因?qū)用婢砻鰽PX與兩個(gè)品種采后AsA 氧化相關(guān)性低,其原因有待進(jìn)一步研究。

      4 結(jié)論

      較高含量的脫氫抗壞血酸還原以及AsA/DHA 的高比值對(duì)抗壞血酸(AsA)的積累起重要作用??箟难嵫趸福ˋO)是氧化AsA 的關(guān)鍵酶,漆酶對(duì)氧化AsA 有一定作用,抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)不是主要氧化AsA 的酶。推測(cè)AO 基因家族中的基因Achn020161是導(dǎo)致AO 氧化AsA 的關(guān)鍵基因,而Achn191341和Achn316521則與AsA 氧化相關(guān)性不明顯;漆酶基因家族中的基因Achn007661對(duì)AsA 氧化有一定作用,Achn191341、Achn163871與AsA 的氧化沒(méi)有顯著相關(guān)性;APX 基因家族中的3 個(gè)基因Achn123021、Achn082241、Achn187071不是氧化AsA的關(guān)鍵基因。

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