CD90在肝內(nèi)膽管細胞癌中的表達及其與患者預后不良的關(guān)系

朱 彤， 饒井芬， 劉承一， 肇 爽， 張 力

1 承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院 腫瘤科， 河北 承德 067000； 2承德醫(yī)學院， 河北 承德 067000

肝內(nèi)膽管細胞癌是一種源于肝內(nèi)膽管上皮細胞的原發(fā)性腺癌，在原發(fā)性肝癌中發(fā)病率僅次于肝細胞癌位居第2位，且近年來其發(fā)病率有所上升[1]。目前對于肝內(nèi)膽管細胞癌主要以手術(shù)切除為首選治療方式，但是由于患者早期診斷困難、手術(shù)切除率低以及術(shù)后容易轉(zhuǎn)移復發(fā)等因素，患者預后情況并無明顯提高[2-3]。因此，研究肝內(nèi)膽管細胞癌的發(fā)生以及促進腫瘤轉(zhuǎn)移復發(fā)關(guān)鍵因子，對于腫瘤的治療以及預后改善具有著重要意義[3]。CD90是錨定于糖基磷脂酰肌醇的一種糖蛋白，在成纖維細胞、胸腺細胞、內(nèi)皮細胞以及神經(jīng)系統(tǒng)等多種細胞中均有所表達，目前研究[4-5]顯示，CD90是肝細胞癌重要的一種抗原標志物，在肝細胞癌發(fā)病和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，而其在肝內(nèi)膽管細胞癌中的表達情況及與患者預后相關(guān)性目前尚無相關(guān)報道。本研究旨在探討CD90在肝內(nèi)膽管細胞癌中的表達及與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預后不良的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2013年3月-2016年3月承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院手術(shù)切除的肝內(nèi)膽管細胞癌患者組織標本及其癌旁組織標本。另收集同期肝臟外傷手術(shù)中所取正常肝組織標本作為對照。肝內(nèi)膽管細胞癌患者均行根治性切除術(shù)，且手術(shù)由同一組醫(yī)師完成，均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實為肝內(nèi)膽管細胞癌。患者術(shù)前未行放療、化療等相關(guān)治療；癌旁組織取自距離腫瘤組織邊緣2 cm以外的區(qū)域。術(shù)中切取新鮮組織，分類收集并標記基本信息后迅速轉(zhuǎn)移至液氮罐中暫存，最后轉(zhuǎn)移至承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院標本庫保存(-80 ℃)。排除合并嚴重心、腦、腎等系統(tǒng)疾病以及合并其他系統(tǒng)腫瘤患者。標本均在患者或家屬知情同意情況下獲取。本研究方案經(jīng)由承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院委員會審批(批號：20121208)。

1.2 免疫組化檢測及結(jié)果判讀 將石蠟標本連續(xù)切片后置于恒溫烘箱內(nèi)烤片，脫蠟后進行乙醇脫水以及高壓抗原修復；加入3%過氧化氫溶液以及稀釋后的CD90鼠抗人單克隆抗體(北京博奧森科技有限公司)，置于4 ℃條件下孵育過夜；加入第二抗體以及DAB顯色。采用顯微鏡觀察，使用自來水沖洗終止染色。蘇木素復染3 min后使用自來水清洗；使用濃度1%的鹽酸乙醇適度分化，溫水返藍；最后將切片晾干后封片。

結(jié)果判斷：將切片置于400倍顯微鏡下，任選5個視野進行觀察。參照文獻[6]結(jié)果判斷標準，細胞質(zhì)染色呈深黃色或黃色作為CD90陽性細胞，計算陽性細胞百分比并進行評分：0分(陽性細胞0)、1分(陽性細胞≤25%)、2分(26%<陽性細胞≤50%)、3分(50%<陽性細胞≤75%)、4分(陽性細胞>75%)；然后根據(jù)陽性細胞染色強度進行評分：0分(無顯色)、1分(淺棕黃色)、2分(棕黃色)、3分(棕褐色)。將陽性細胞百分比評分與染色強度評分相加，評分0分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)、4～5分為中度陽性(++)、6～7分為強陽性(+++)。

1.3 術(shù)后隨訪 術(shù)后對患者進行隨訪，隨訪截止日期為2019年7月31日，分別以術(shù)后局部/遠期復發(fā)以及死亡作為終點事件，分析患者術(shù)后無復發(fā)生存情況及總體生存情況。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入49例肝內(nèi)膽管細胞癌患者，其中男39例，女10例，年齡33～78歲，平均(53.27±12.95)歲；對照組40例，其中男31例，女9例，年齡25～74歲，平均(52.93±10.94)歲。2組患者性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。

2.2 3組CD90蛋白表達情況比較 肝內(nèi)膽管細胞癌組織CD90中強度陽性表達率為65.31%，癌旁正常組織CD90中強度陽性表達率為30.61%，正常肝組織CD90中強度陽性表達率為0。肝內(nèi)膽管細胞癌組織中CD90蛋白中強度陽性表達率顯著高于癌旁正常組織與正常肝臟組織(P值均<0.05)(表1)。

表1 3組CD90蛋白表達情況比較[例(%)]

注：與肝內(nèi)膽管細胞癌組織比較，1)P<0.05；與癌旁正常組織比較，2)P<0.05。

2.3 CD90蛋白表達與肝內(nèi)膽管細胞癌患者臨床指標的關(guān)系 CD90蛋白表達與肝內(nèi)膽管細胞癌患者TNM分期及肝門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P值均<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤數(shù)目、腫瘤分化情況無關(guān)(P值均>0.05)(表2)。

2.4 CD90蛋白表達與肝內(nèi)膽管細胞癌患者預后的關(guān)系 CD90蛋白陰性/弱陽性表達患者術(shù)后無復發(fā)生存率及總體生存率均明顯優(yōu)于中/強陽性表達患者(χ2值分別為3.845、4.152，P值分別為0.025、0.021)(圖1、2)。

3 討論

肝內(nèi)膽管細胞癌為原發(fā)性肝癌的一種，是繼肝細胞癌的第二常見肝內(nèi)惡性腫瘤，以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為特征，其腫瘤侵襲以及轉(zhuǎn)移的惡性程度較肝細胞癌更高[6]。近些年來，肝內(nèi)膽管細胞癌發(fā)病率明顯上升，由于患者發(fā)病較為隱匿，臨床表現(xiàn)缺乏特異性，患者早期診斷較為困難且術(shù)后復發(fā)率高，大部分患者在臨床診斷時已經(jīng)處于疾病晚期，手術(shù)治療效果不佳甚至無手術(shù)指征，患者臨床預后極差，已成為肝內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤死亡的主要原因，因此對于肝內(nèi)膽管細胞癌病理發(fā)展機制的研究有著重要的臨床意義[7-9]。

CD90是免疫球蛋白超家族中的一員，其主要通過甘油二酯錨定于糖基磷脂酰肌醇的羧基端而附著于細胞膜上[10]。在血液干細胞中發(fā)現(xiàn)CD90蛋白的表達，經(jīng)過6 d細胞因子的處理，CD90+細胞群進入細胞周期，而CD90-細胞群仍處于細胞靜止期，提示CD90陽性表達可促進細胞增殖[11]。此外，有研究[12]顯示，CD44+CD90+細胞亞群在小細胞肺癌中的成球能力更強，且具有上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化特征。而從胚胎干細胞中分選出來的CD90+細胞群增殖能力明顯強于CD90-細胞群，且CD90隨著胚胎干細胞的成熟表達逐漸降低[13-14]。而在前列腺癌組織標本中，同樣發(fā)現(xiàn)CD90表達較正常前列腺組織高，且其在血管周圍的表達水平更高，提示在腫瘤的生長以及血管形成過程中，CD90均發(fā)揮著重要作用[15]。

表2 CD90蛋白表達與肝內(nèi)膽管細胞癌患者臨床指標關(guān)系分析[例(%)]

圖1肝內(nèi)膽管細胞癌患者術(shù)后無瘤生存情況分析

本研究結(jié)果顯示，肝內(nèi)膽管細胞癌組織CD90中強度陽性表達率為65.31%，癌旁正常組織CD90中強度陽性表達率為30.61%，正常肝組織CD90中強度陽性表達率為0，肝內(nèi)膽管細胞癌組織中CD90蛋白中強度陽性表達率顯著高于癌旁正常組織與正常肝組織(P<0.05)。提示在肝內(nèi)膽管細胞癌發(fā)生發(fā)展過程中，CD90蛋白表達發(fā)揮著重要的影響，可能促進了腫瘤細胞的增殖。此外，本研究進一步分析了CD90表達與患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，CD90蛋白表達與肝內(nèi)膽管細胞癌患者TNM分期及肝門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P值均<0.05)。提示CD90蛋白與肝內(nèi)膽管細胞癌患者疾病進展密切相關(guān)，同時CD90可能促進腫瘤細胞的血行轉(zhuǎn)移，與相關(guān)研究[16-17]報道結(jié)果相似。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，CD90蛋白陰性/弱陽性表達患者術(shù)后無復發(fā)生存率及總體生存率均顯著優(yōu)于中/強陽性表達患者(P值均<0.05)，提示CD90表達與術(shù)后復發(fā)及生存情況密切相關(guān)，CD90蛋白高表達可促進腫瘤的術(shù)后復發(fā)，影響患者生存預后，可能與CD90促進腫瘤血行轉(zhuǎn)移等因素有關(guān)[18-19]。有學者[20-21]從肝癌細胞株、肝癌患者組織以及血液中分選出CD90+細胞群，結(jié)果顯示，與CD90-細胞群比較，CD90+細胞群具有更強的成瘤能力，且能夠無限增殖，因此認為CD90+細胞群可能是“肝癌干細胞”。本研究也進一步證實了在肝內(nèi)膽管細胞癌中，CD90對腫瘤的發(fā)生可能同樣發(fā)揮了重要的作用。但是由于本研究納入樣本量有限，且腫瘤作為一種多因素影響的共同結(jié)果，CD90可能只是其中因素之一，還需要進一步深入研究分析。

綜上所述，CD90在人肝內(nèi)膽管細胞癌組織內(nèi)高表達，且與患者肝門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預后有關(guān)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中產(chǎn)生了重要的影響。