抗生素相關(guān)性腹瀉病原菌的檢測方法

王 碩，張志華

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 血液科，河北 承德 067000)

廣譜抗生素的使用可消滅患者機(jī)體的大多數(shù)致病菌，但同時(shí)也嚴(yán)重破壞了腸道微生態(tài)平衡，引發(fā)菌群失調(diào)甚至二重感染[1-3]，近年對(duì)于艱難梭菌相關(guān)性腹瀉(Clostridiumdifficile-associated diarrhea,CDAD)研究較多，CDAD約占抗生素相關(guān)性腹瀉(antibiotic-associated diarrhea，AAD)的1/3，但仍有2/3病原菌尚不明確，導(dǎo)致AAD的診斷及治療仍是臨床的一個(gè)難題，因此對(duì)于抗生素相關(guān)腹瀉的病原菌檢測十分重要，本文就抗生素相關(guān)腹瀉的檢測方法進(jìn)行綜述。

1 AAD的危險(xiǎn)因素

研究提示，幾乎所有的抗生素均能引起AAD，既往流行病學(xué)研究顯示導(dǎo)致AAD的危險(xiǎn)因素包括：廣譜抗生素的應(yīng)用、患者本身免疫力低下、化療藥物的使用、應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑、年齡≥65歲、住院時(shí)間長等[4-7]，應(yīng)注意臨床預(yù)防。

2 AAD的發(fā)生機(jī)制和分類

AAD的病理生理學(xué)發(fā)生機(jī)制包括分泌性、動(dòng)力性、滲出性、滲透性等，臨床常按照感染性AAD和非感染性AAD進(jìn)行分類。

2.1感染性AAD 目前，感染性AAD的原因主要是廣譜抗生素的使用導(dǎo)致腸道菌群失衡，致病菌或條件致病菌大量生長繁殖，導(dǎo)致不同嚴(yán)重程度的腹瀉，AAD的病原微生物包括艱難梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡葡萄球菌、克雷伯桿菌、念珠菌、沙門菌[8]以及無毒梭菌等[9]，CDAD產(chǎn)生腸毒素A和細(xì)胞毒素B(分別與tcdA和tcdB基因相關(guān))，臨床上，艱難梭菌的表現(xiàn)范圍很廣，從無癥狀的攜帶到嚴(yán)重的、危及生命的暴發(fā)性偽膜性腸炎和中毒性巨結(jié)腸[10]。

2.2非感染性AAD 非感染性AAD又稱功能性AAD，其原因主要為：(1)一方面抗生素可增加胃腸動(dòng)力引起腹瀉，另一方面抗生素的不良反應(yīng)可引起腸黏膜損害和腸上皮萎縮，進(jìn)而導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)吸收障礙引起腹瀉；(2)抗生素引起腸道正常菌群失調(diào)使得代謝功能受損，包括多糖類發(fā)酵障礙、糖吸收不良，最終腸內(nèi)滲透壓升高引起滲透性腹瀉[11]。

3 AAD的實(shí)驗(yàn)室檢查

3.1糞便常規(guī)的檢測 大便常規(guī)檢測對(duì)AAD缺乏特異性，對(duì)于腹瀉較輕的患者的糞便檢測可無異常，而較嚴(yán)重患者檢測也只能出現(xiàn)白細(xì)胞或紅細(xì)胞。

3.2便菌群比例 糞便涂片的革蘭染色法不僅能直接觀察出腸道內(nèi)菌群數(shù)是否產(chǎn)生變化，還能觀察出革蘭陽性菌與陰性菌的比例及球菌與桿菌的比例是否失調(diào)，或有無真菌，由此判斷腸道菌群紊亂程度，該方法實(shí)用、可靠、經(jīng)濟(jì)，可快速對(duì)臨床下一步治療提供依據(jù)指導(dǎo)治療。

3.3腸道細(xì)菌定量培養(yǎng)法 通過不同培養(yǎng)基的菌落培養(yǎng)，以期對(duì)菌數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)于CDAD的培養(yǎng)，多采用CCFA選擇性培養(yǎng)基，但培養(yǎng)陽性率低，而且不能區(qū)分產(chǎn)毒性菌株和非產(chǎn)毒性菌株，該方法主要用于流行病學(xué)研究，很少用于臨床診斷。近年來采用瓊脂顯色選擇性培養(yǎng)基，比CCFA培養(yǎng)基選擇性好，艱難梭菌培養(yǎng)陽性率增加了20%，目前仍需大量的研究證實(shí)其在臨床中的應(yīng)用價(jià)值[12]；毒力生成培養(yǎng)(TC)是在選擇性培養(yǎng)艱難梭菌的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，主要分為2部分，即艱難梭菌培養(yǎng)和毒素檢測，通過觀察毒素引起的細(xì)胞病變和加入中和毒素判斷有無產(chǎn)毒菌株，由于TC檢測需要時(shí)間長，使艱難梭菌感染診斷延遲，另一方面，體外菌株的產(chǎn)毒能力能否準(zhǔn)確代表該菌株在體內(nèi)的情況尚需進(jìn)一步研究[13]。由于培養(yǎng)方法操作起來耗時(shí)多并且腸道菌群種類培養(yǎng)的局限性，因此目前不能將該法用于AAD的診斷。

3.4細(xì)胞毒性中和試驗(yàn)(CCTA) CCTA通過檢測糞便中毒素B進(jìn)行診斷，通過觀察引起的細(xì)胞病變，然后通過特異性抗血清中和試驗(yàn)確定細(xì)胞病變的特異性[14]，具有特異度、靈敏度較高等優(yōu)點(diǎn)，曾認(rèn)為是艱難梭菌感染檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但該實(shí)驗(yàn)的糞便標(biāo)本需為新鮮糞便，如果糞便放置太久導(dǎo)致毒力減退可引起假陰性結(jié)果，另外，該技術(shù)要求高、花費(fèi)時(shí)間長，尚未得到廣泛應(yīng)用。

3.5谷氨酸脫氫酶(GDH)實(shí)驗(yàn) 糞便GDH檢測方法靈敏度高，特異度中等，出結(jié)果快，價(jià)格便宜，操作簡單，在臨床實(shí)驗(yàn)室易于執(zhí)行，但GDH是艱難梭菌菌株表面的一種共同抗原，產(chǎn)毒性和非產(chǎn)毒性艱難梭菌菌株都可產(chǎn)生，不能區(qū)分產(chǎn)毒性和非產(chǎn)毒性艱難梭菌,需要聯(lián)合毒素測試來診斷艱難梭菌感染[15]，GDH陰性樣本可排除，GDH陽性樣本仍需要進(jìn)行毒素測試來確定。

3.6競爭性酶免疫分析(EIA)毒素檢測 EIA毒素檢測是最早應(yīng)用于艱難梭菌感染臨床檢測的方法，具有操作簡單、出結(jié)果快、價(jià)格便宜、特異度高等優(yōu)點(diǎn)，但因靈敏度較低在臨床診斷中價(jià)值有限。EIA檢測毒素的靈敏度約為45%。與艱難梭菌培養(yǎng)相比，EIA檢測毒素靈敏度及陽性預(yù)測值較低，可能造成輕中度艱難梭菌感染漏診，而且不能對(duì)毒素基因和核糖體型進(jìn)一步分析。綜上，結(jié)合GDH的兩步法和三步法可提高CDAD診斷的準(zhǔn)確率[16]。

3.7核苷酸擴(kuò)增檢測(NAAT) 實(shí)驗(yàn)室常用的NAAT檢測方法包括常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、實(shí)時(shí)PCR、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)。NAAT靈敏度和特異度均較高，并且操作簡單、出結(jié)果快，但價(jià)格較毒素EIA較貴。與GDH檢測和EIA毒素測試比較，NAAT能更快、更準(zhǔn)確診斷艱難梭菌感染。然而，僅可檢測具有產(chǎn)毒素潛能的艱難梭菌毒素基因，而不是直接檢測艱難梭菌毒素，因此檢測結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽性[17]。

3.8結(jié)腸鏡檢測 結(jié)腸鏡檢查對(duì)絕大部分AAD無特異性，僅可以發(fā)現(xiàn)假膜性腸炎(PMC)患者結(jié)腸的特異性病變即結(jié)直腸黏膜上可見2～10 mm微黃色的斑塊，文獻(xiàn)[18]報(bào)道,PMC與抗菌藥物的使用相關(guān)，即便結(jié)腸鏡檢查是鑒別PMC的最佳方法，但該操作可能增加感染和腸穿孔風(fēng)險(xiǎn)。

3.9實(shí)時(shí)熒光定量PCR 1992年Higuchi等首次采用動(dòng)態(tài)PCR和封閉式檢測方法對(duì)目的核酸數(shù)量進(jìn)行實(shí)時(shí)分析，最初是將熒光計(jì)和PCR儀連接，在反應(yīng)管中加入與雙聯(lián)DNA分子結(jié)合而發(fā)射熒光的燃料，在PCR擴(kuò)增過程中，隨擴(kuò)增產(chǎn)物不斷增加，與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合的染料所產(chǎn)生的熒光也不斷增強(qiáng)，可通過熒光計(jì)檢測到的熒光強(qiáng)度估算擴(kuò)增產(chǎn)物量，目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)方法主要有熒光探針TaqMan、熒光探針-分子信標(biāo)、熒光染料-SYBRGreen、熒光引物L(fēng)UX等，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法因其簡便快捷、可定量、重復(fù)性好、靈敏度高、特異度高及PCR反應(yīng)后不需要電泳檢測等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于遺傳性疾病的診斷、腫瘤分子的診斷、病原體檢測，由于完全閉管操作，可以克服PCR反應(yīng)過程中污染造成假陽性結(jié)果，可用于檢測復(fù)雜微生物環(huán)境，目前已成為腸道微生態(tài)研究中重要的分子生物學(xué)技術(shù)方法之一，李芬[19]通過比較實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與常規(guī)細(xì)菌鑒定法檢測腸道致病菌的對(duì)比研究中發(fā)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的陽性率更高，另一方面PCR技術(shù)避免了細(xì)菌接種培養(yǎng)-生化鑒定-血清學(xué)鑒定的不足，其主要針對(duì)細(xì)菌DNA進(jìn)行檢測，該方法被國內(nèi)外學(xué)者廣泛應(yīng)用于追蹤、檢測細(xì)菌性腹瀉，為臨床早期診斷和治療提供了依據(jù)[20]，雖然該技術(shù)受到檢測范圍的限制(僅限于細(xì)菌或真菌甚至更有限的范圍，取決于所用的引物)以及靈敏度的影響[21]，不利于我們更加深入的了解AAD，但在一定程度上有利于我們指導(dǎo)臨床治療。

3.10基于宏基因組的二代測序技術(shù)(metagenomic next-generation sequencing,mNGS) 目前，上述檢查方法無法全面、具體分析AAD的腸道菌群，mNGS應(yīng)運(yùn)而生，近十年來，世界各國啟動(dòng)“人類微生物計(jì)劃”和“地球微生物組計(jì)劃”，2015年10月，美國科學(xué)家在Science呼吁實(shí)施“聯(lián)合微生物研究計(jì)劃(UMI)”，與此同時(shí)，我國科學(xué)家聯(lián)合美、德兩國科學(xué)家在Nature提出成立“國際基因組計(jì)劃”，得益于mNGS的發(fā)展，我們可以更全面的了解微生物群落特點(diǎn)，該技術(shù)的原理是將DNA(cDNA)隨機(jī)片段化、加接頭，制備測序文庫，通過對(duì)文庫進(jìn)行延伸反應(yīng)，檢測相應(yīng)的信號(hào)從而獲取文庫信息，具體實(shí)驗(yàn)流程包括樣品的準(zhǔn)備、DNA的提取和檢測、PCR的擴(kuò)增及產(chǎn)物純化、文庫制備和庫檢、Miseq測序。mNGS是目前常用的測序技術(shù)，以illumina公司的Soiesa為代表，因其能夠檢測標(biāo)本中存在的所有DNA或RNA，故而能夠分析患者標(biāo)本的整個(gè)微生物組以及人宿主基因組及轉(zhuǎn)錄組，所以被廣泛應(yīng)用于微生物的研究，例如腸道微生態(tài)中物種多樣性和豐富度的菌群分析[22]，mNGS首次用于感染性疾病的診斷報(bào)道于2014年關(guān)于1例中樞神經(jīng)系統(tǒng)鉤端螺旋體病患者的臨床診斷,基于mNGS的臨床診斷指導(dǎo)抗生素的使用從而使患者最終恢復(fù)健康，該病歷首次證明了mNGS可以為臨床診斷提供依據(jù)[23]，此后不斷有個(gè)案報(bào)道，劉桂等[24]通過二代基因測序技術(shù)成功分析應(yīng)用中藥湯劑葛根芩連湯后對(duì)2型糖尿病患者腸道菌群變化的影響。Nobel等[25]通過mNGS研究發(fā)現(xiàn)幼年小鼠應(yīng)用抗生素后對(duì)腸道菌群、機(jī)體生長和代謝產(chǎn)生影響，進(jìn)而研究兒童早期應(yīng)用抗生素對(duì)機(jī)體的影響，目前，越來越多mNGS提供的數(shù)據(jù)被廣泛應(yīng)用于臨床，mNGS可以對(duì)包括病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲等多種病原體檢測，根據(jù)DNA和(或)RNA序列直接對(duì)糞便標(biāo)本進(jìn)行鑒定[26]，具有絕對(duì)的優(yōu)勢，mNGS的另外一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢是測序數(shù)據(jù)可以對(duì)除了致病病原體之外的潛在病原體進(jìn)行分析，例如微生物組特征和通過RNA測序的轉(zhuǎn)錄組分析對(duì)人類宿主反應(yīng)的平行分析，以預(yù)測感染原因和評(píng)估疾病風(fēng)險(xiǎn)[27-28]。盡管如此，mNGS仍面臨巨大的挑戰(zhàn)，尤其對(duì)于免疫功能低下患者，因其潛在病原體范圍更廣，故無法區(qū)分污染物、定植菌及致病菌，導(dǎo)致最終的診斷結(jié)果必須依靠于臨床，而且，mNGS目前缺乏通用參考標(biāo)準(zhǔn)及臨床測定質(zhì)量保證，此外，限制其臨床應(yīng)用的因素還包括成本、報(bào)銷等。盡管目前該技術(shù)存在很多局限性，但將來mNGS必將成為AAD診斷的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，從而推進(jìn)臨床診斷及精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。

綜上，臨床上雖然可以利用各類益生菌制劑預(yù)防和治療AAD，但治療效果一般，而且前期診斷的方法還尚不完善，需要更加深入地認(rèn)識(shí)腸道菌群與AAD的關(guān)系從而尋找靈敏度、特異性較高的診斷方法。