ATRA對(duì)甲狀腺鱗癌細(xì)胞株SW579細(xì)胞CDK4、CyclinD1、Rb 表達(dá)的影響

張秀梅，劉 超，閆紀(jì)亮，趙 頌，王翠瑤，肖建英

(遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

目前研究表明，CyclinD1、CDK4表達(dá)異常及Rb蛋白的磷酸化狀態(tài)與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)［1］。我們以往的研究［2］表明，全反式維甲酸(ATRA)能夠抑制SW579細(xì)胞生長(zhǎng)，并將細(xì)胞阻滯于G1期;同時(shí)在mRNA水平上調(diào)P21及RARβ的表達(dá)。P21及RARβ是否通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、CDK4、Rb的表達(dá)水平從而阻滯細(xì)胞周期還不明確。我們于2009年10月～2010年8月進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)，用ATRA處理甲狀腺鱗癌細(xì)胞株SW579，應(yīng)用RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)加入ATRA前后細(xì)胞周期因子CyclinD1、CDK4、pRb表達(dá)的變化，以期進(jìn)一步了解ATRA抑制甲狀腺鱗癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 ATRA、L15培養(yǎng)液、RT-PCR試劑盒(大連寶生物)、TRIzol試劑(Gibco BRL)、兔抗人CyclinD1、CDK4、Rb磷酸化多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf公司)，Sunrise自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀(瑞士TECAN公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與觀察 甲狀腺鱗癌細(xì)胞株SW579購(gòu)自上海生命科學(xué)院細(xì)胞和生物化學(xué)研究所。培養(yǎng)于L15培養(yǎng)液中，飽和濕度、37℃、無CO2的條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)以105個(gè)/ml濃度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶，24 h后待細(xì)胞貼壁后給藥，使 ATRA 終濃度分別為 10－7、10－6、5×10－6、10－5mol/L，對(duì)照組加入 5 μl無水乙醇［乙醇濃度小于 0.1%(V/V)］。

1.3 半定量RT-PCR檢測(cè)CDK4、CyclinD1、Rb基因mRNA的表達(dá) 采用TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA。使用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第1鏈，在Taq酶的作用下進(jìn)行PCR的擴(kuò)增。CDK4的循環(huán)條件:94 ℃ 2 min、94 ℃變性30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min(30個(gè)循環(huán))，72℃ 5 min;CyclinD1的循環(huán)條件:94 ℃ 2 min、94 ℃變性30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min(30個(gè)循環(huán))，72℃ 5 min;Rb的循環(huán)條件:94℃2 min、94 ℃變性30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min(30 個(gè)循環(huán))，72℃ 5 min;β-actin的循環(huán)條件:94℃ 2 min、94 ℃變性30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min(30 個(gè)循環(huán))，72℃ 5 min。取PCR產(chǎn)物10 μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并拍照，應(yīng)用凝膠圖像分析管理系統(tǒng)進(jìn)行灰度測(cè)量，mRNA的表達(dá)水平以每一樣品與其內(nèi)參βactin灰度比值表示。PCR引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度如下:CDK4上游引物5'-TGATGCGCCAGTTTCTAAGAGG-3'，下游引物:5'-GGTCGGCTTCAGAGTTTCCACA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度308 bp。CyclinD1上游引物:5'-GAAAGTAGGGACCTCAGAGG-3'，下游引物:5'-CTGTCCTCCCTCACACGTCA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 577 bp。Rb 上游引物:5'-TACCTAGCTCAAGGGTTAAT-3'，下游引物:5'-TAGCCATATGCACATGAATG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 300 bp。β-actin上游引物:5'-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3'，下游引物:5'-CAGGAGGAGCAATGATCTT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 384 bp。β-actin上游引物:5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3'，下游引物:5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度661 bp。

1.4 Western blot檢測(cè) CDK4、CyclinD1、pRb 蛋白的表達(dá) 用蛋白裂解液提取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒蛋白濃度?？偟鞍祝?0℃或－80℃保存?zhèn)溆?。電泳前加入SDS樣品緩沖液，100℃煮沸5 min，離心后上樣，10%SDS-PAGE電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，之后用含5%BSA的TBS(pH 7.4)將濾膜于室溫?fù)u動(dòng)溫育2 h進(jìn)行封閉，封閉后的濾膜再分別與CyclinD1、CDK4、pRb磷酸化抗體(稀釋比為1∶200)4℃溫育過夜。經(jīng)TTBS洗滌后，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG作為二抗(稀釋比為1∶5000)室溫溫育2 h，洗膜后使用ECL發(fā)光法顯色，內(nèi)參采用β-actin。掃描X光片，計(jì)算機(jī)軟件處理，進(jìn)行密度分析，計(jì)算灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組數(shù)據(jù)以表示，多樣本均數(shù)檢驗(yàn)采用方差分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ATRA 對(duì) SW579 細(xì)胞 CDK4、CyclinD1、Rb 基因mRNA表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，ATRA組在一定濃度(10－7～10－5mol/L)范圍內(nèi)隨著藥物濃度的增加，CyclinD1 mRNA表達(dá)水平逐漸下降，且呈劑量依賴性(P ＜0.05)，但 CDK4、Rb mRNA 表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，見表1、圖1～3。2.2 ATRA 對(duì) SW579 細(xì)胞 CDK4、CyclinD1、pRb 蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，ATRA組在一定濃度(10－7～10－5mol/L)范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，CyclinD1蛋白表達(dá)水平、Rb蛋白的磷酸化水平逐漸下降，且呈劑量依賴性(P＜0.05)，但CDK4蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，見表2、圖4。

表 1 CDK4、CyclinD1、Rb mRNA 的表達(dá)水平(，n=3)

表 1 CDK4、CyclinD1、Rb mRNA 的表達(dá)水平(，n=3)

組別 CDK4/β-actin CyclinD1/β-actin Rb/β-actin空白對(duì)照組0.381 ±0.021 0.574 ±0.072 0.202 ±0.022乙醇對(duì)照組 0.376 ±0.023 0.563 ±0.028 0.203 ±0.034 ATRA組(mol/L)10 －7 0.372 ±0.027 0.437 ±0.011 0.205 ±0.05410 －6 0.363 ±0.018 0.335 ±0.025 0.196 ±0.0395 ×10 －6 0.376 ±0.051 0.228 ±0.034 0.208 ±0.04210－50.385 ±0.046 0.115 ±0.015 0.211 ±0.023

表 2 CDK4、CyclinD1、pRb 蛋白的表達(dá)水平(，n=3)

表 2 CDK4、CyclinD1、pRb 蛋白的表達(dá)水平(，n=3)

組別 CDK4/β-actin CyclinD1/β-actin pRb/β-actin空白對(duì)照組0.398 ±0.076 0.582 ±0.089 0.653 ±0.016 ATRA組(mol/L)10 －7 0.343 ±0.051 0.411 ±0.023 0.492 ±0.06410 －6 0.331 ±0.075 0.336 ±0.045 0.396 ±0.0955 ×10 －6 0.343 ±0.026 0.248 ±0.018 0.287 ±0.03610－50.332 ±0.069 0.151 ±0.045 0.162 ±0.045

圖4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，ATRA在mRNA和蛋白水平都下調(diào)了SW579細(xì)胞CyclinD1的表達(dá)，并呈劑量依賴性，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道［3～5］相一致。提示 ATRA抑制SW579細(xì)胞增殖與其下調(diào)CyclinD1的表達(dá)有關(guān)。

Rb是一個(gè)抑癌基因，非磷酸化(或低磷酸化)形式為活性型，能促進(jìn)細(xì)胞分化，抑制細(xì)胞增殖。Rb蛋白的磷酸化程度與細(xì)胞周期密切相關(guān)，Rb蛋白通過結(jié)合或釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F來控制檢測(cè)點(diǎn)進(jìn)而控制細(xì)胞周期。E2F是一類激活轉(zhuǎn)錄作用的活性蛋白，控制著S期的重要蛋白質(zhì)(包括DNA合成酶)的合成。低磷酸化的Rb蛋白與E2F結(jié)合，使E2F處于非活化狀態(tài)，從而抑制相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，抑制細(xì)胞分裂;高磷酸化的Rb蛋白釋放E2F，促使細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期。有研究表明，ATRA能夠降低胃癌細(xì)胞株 BGC-823、SGC-7901、MKN-45 Rb蛋白的磷酸化水平［6］，在MEPM細(xì)胞中，ATRA能夠下調(diào)Rb蛋白的磷酸化水平，并降低CyclinD1、E蛋白的表達(dá)［7］。本研究證實(shí)，ATRA在一定濃度范圍內(nèi)下調(diào)甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞Rb蛋白的磷酸化水平，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。提示ATRA抑制SW579細(xì)胞增殖與下調(diào)Rb蛋白的磷酸化水平有關(guān)。Yu等［8］研究證實(shí)ATRA抑制MEPM細(xì)胞增殖，下調(diào) CyclinD1、Rb蛋白的磷酸化水平，依賴于P21的表達(dá)，并需要維甲酸受體的參與，支持我們的結(jié)果［2］。

綜合以往研究，我們認(rèn)為ATRA抑制SW579細(xì)胞增殖的機(jī)制可能是通過高表達(dá)的RARβ與P21啟動(dòng)子上的維甲酸反應(yīng)元件結(jié)合，促進(jìn)P21的表達(dá)。P21下調(diào)了CyclinD1的表達(dá)，抑制CDK4的活性，從而使Rb蛋白的磷酸化水平降低，低磷酸化的Rb蛋白與E2F結(jié)合，使E2F處于非活化狀態(tài)，從而抑制相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，抑制細(xì)胞分裂，將細(xì)胞阻滯于G1期，從而抑制SW579細(xì)胞的增殖。這種抑制機(jī)制是否也存在于其他甲狀腺癌細(xì)胞中，本研究室還在進(jìn)一步研究中。

［1］付錦艷，潘曉琳，楊安強(qiáng).細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白 Cyclin D1、CDK4和pRb在新疆維吾爾族婦女宮頸癌中的表達(dá)及意義［J］.腫瘤防治研究，2009，36(11):969-972.

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