IL-6信號(hào)通路及其調(diào)節(jié)GATA-6啟動(dòng)子甲基化在肺動(dòng)脈高壓形成中的研究進(jìn)展

廖劍雄，張一馳，王炳今，張 謙，劉維佳

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension， PH)是以肺動(dòng)脈壓力和肺小血管阻力進(jìn)行性增加為特征的臨床-病理生理綜合征,主要表現(xiàn)為肺血管過度收縮、肺小動(dòng)脈重構(gòu)，最終導(dǎo)致心力衰竭。美國流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)資料表明，PH患病率至少為10.6/100萬，年發(fā)病率至少為2/100萬[1]。由于治療效果差和疾病不可逆性迅速進(jìn)展，PH病死率居高不下[2]。若PH不及時(shí)控制，患者預(yù)期生存時(shí)間僅為2.8年[3]。所以研究PH的發(fā)病機(jī)制，探討其治療新靶點(diǎn)具有重要意義。PH的發(fā)生與遺傳、個(gè)體、環(huán)境等多種因素相關(guān)，歐洲心臟病學(xué)會(huì)/歐洲呼吸病學(xué)會(huì)于2015年發(fā)布最新“肺動(dòng)脈高壓診斷和治療指南”，將PH分為動(dòng)脈性PH、左心疾病相關(guān)性PH、肺部疾病和(或)缺氧所致PH、慢性血栓栓塞性PH及機(jī)制不明和(或)多因素所致PH五大類[4]，但目前研究發(fā)現(xiàn)不同類型的PH存在共同的病理基礎(chǔ)，其中肺小動(dòng)脈重構(gòu)是主要環(huán)節(jié)[5-6]。而肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cell, PASMC)異常增殖、炎性反應(yīng)等因素共同參與了肺血管重構(gòu)過程，其中又以炎性反應(yīng)及PASMC異常增殖為PH肺小動(dòng)脈重構(gòu)的中心環(huán)節(jié)[7]。

近年來在PH動(dòng)物模型中白細(xì)胞介素6(IL-6)信號(hào)調(diào)控在肺血管重構(gòu)中的作用已成為PH研究熱點(diǎn)[8]。GATA-6基因主要表達(dá)于血管平滑肌,其作用為抑制PASMC進(jìn)入細(xì)胞周期，對(duì)維持靜止期PASMC表型的穩(wěn)定具有重要作用[9]；其通過穩(wěn)定細(xì)胞表型來抑制PASMC異常增殖最終防止肺小動(dòng)脈重構(gòu)。因此，闡明GATA-6、IL-6與PH發(fā)病的相關(guān)性及GATA-6與IL-6的聯(lián)系對(duì)尋找PH新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。

1 IL-6信號(hào)通路與PH的關(guān)系

1985年Kishimoto等從人T細(xì)胞中首先獲得IL-6 cDNA克隆。人體IL-6主要來源于單核細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMC),通過檢測(cè)PH患者肺組織和血清中IL-6的表達(dá)水平顯著升高，且單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6越多，動(dòng)脈重構(gòu)越迅速[10]。在未經(jīng)PH造模的正常小鼠中，IL-6的過表達(dá)在低氧誘導(dǎo)下導(dǎo)致的肺動(dòng)脈壓力和肺血管阻力明顯升高[11]，因而認(rèn)為血清IL-6水平能預(yù)測(cè)PH患者預(yù)后[12-13]。

1.1 IL-6調(diào)控TGF-β/Smad信號(hào)通路在PH形成中的作用 轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF)家族主要分為TGF-βs亞家族和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)亞家族，TGF-βs亞家族又分為TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3 3種亞型，其中以TGF-β1活性最強(qiáng)。臨床觀察到PH患者TGF-βs信號(hào)亢進(jìn)及在PH模型中發(fā)現(xiàn)編碼BMPs的骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2(BMPR2)基因突變,均會(huì)導(dǎo)致BMP信號(hào)減弱[14-15]。TGF-β1是一種抗炎細(xì)胞因子，在研究神經(jīng)干細(xì)胞的過程中發(fā)現(xiàn)，它具有促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育的作用，腓骨蛋白2(FBLN2)是在這一作用中的重要介質(zhì)[16]，其通過TGF-β/Smad信號(hào)通路維持血管正常結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)平衡。完整的Smad信號(hào)通路包括配體、膜受體、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和跨核膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)分子，該通路中的任意一個(gè)表達(dá)環(huán)節(jié)異常均可導(dǎo)致血管重構(gòu)[17]，但FBLN2主要表達(dá)于主動(dòng)脈中層的動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，是否為PASMC增殖導(dǎo)致PH的主要機(jī)制，目前尚不十分清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可刺激健康人近端和遠(yuǎn)端PASMC的增殖，從而促進(jìn)自發(fā)性PH的形成[18-19]，其機(jī)制可能與TGF-β刺激PASMC IL-6生成顯著增加有關(guān)，予IL-6抗體后可抑制TGF-β引起的PASMC增殖作用[20]。內(nèi)皮素1(ET-1)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的縮血管因子,其可間接調(diào)控TGF-β1/Smad信號(hào)通路而發(fā)揮作用。內(nèi)毒素血癥時(shí)肺組織中的ET-1上調(diào)，能明顯促進(jìn)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的PH，其機(jī)制可能為ET-1激活G蛋白偶聯(lián)的ETA和ETB受體，導(dǎo)致cAMP濃度增加，進(jìn)而激活磷脂酶C和蛋白激酶C，使得環(huán)氧合酶2的表達(dá)水平上調(diào)，最終促進(jìn)血管平滑肌收縮及VSMC增殖[21]。但隨后研究表明，ET-1對(duì)PASMC的增殖作用需要在炎癥介質(zhì)的協(xié)同下完成，其可能是通過炎癥介質(zhì)激活MAPK-ERK1/2信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的[22]。周細(xì)胞又稱Rouget細(xì)胞，在肺動(dòng)脈血管中周細(xì)胞參與內(nèi)皮細(xì)胞的生長、增殖、分化等。在慢性缺氧條件下，周細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為收縮型平滑肌細(xì)胞而發(fā)揮作用，而TGF-β協(xié)同IL-6可明顯影響周細(xì)胞的這一作用，隨后PH動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TGF-β信號(hào)通路被激活后可加速PH的進(jìn)展[23-24]。

1.2 IL-6通過調(diào)控p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致PH形成 MAPKs是信號(hào)傳導(dǎo)過程的重要介質(zhì)，在各種生理和病理?xiàng)l件下均可被激活，研究發(fā)現(xiàn)野百合堿處理使得造模后的大鼠肺部p38MAPK表達(dá)明顯上調(diào)，而后予選擇性p38MAPK抑制劑則阻止了PH的進(jìn)展[25]。已有研究表明，IL-6可通過激活p38MAPK細(xì)胞內(nèi)通路刺激胎兒肺發(fā)育[26]。Fujita等[27]研究也發(fā)現(xiàn)，在MC3T3-E1細(xì)胞中凝血酶可通過激活p38MAPK信號(hào)通路參與IL-6的合成，該研究在很大程度上證實(shí)IL-6與p38信號(hào)通路有著直接關(guān)系。IL-6表達(dá)升高通過對(duì)p38信號(hào)通路的直接作用來調(diào)節(jié)PASMC凋亡和增殖，進(jìn)而促進(jìn)肺血管重構(gòu)的發(fā)生，這在野百合堿誘導(dǎo)PH大鼠注射胸腺素可抑制肺血管重構(gòu)的研究中得到進(jìn)一步證實(shí)[28]。同時(shí)p38MAPK活性通路介導(dǎo)的IL-6與BMPs通路之間存在負(fù)反饋環(huán)，提示IL-6激活可能是家族性PH合并BMPR2突變的主要原因。

1.3 IL-6調(diào)控miR-17/92信號(hào)通路誘發(fā)PH的形成 miRNAs是一類高度保守的內(nèi)源性小非編碼RNA，在細(xì)胞增殖和分化過程中發(fā)揮重要作用，miR-17/92基因簇是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的miRNA癌基因。研究表明，miR-17/92基因簇信號(hào)通路是PH在體內(nèi)的關(guān)鍵調(diào)控因子，其在缺氧誘發(fā)PH中的表達(dá)成雙向性(早期呈誘導(dǎo)性表達(dá)、晚期表達(dá)降低)[29]。在一組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)，miR-17/92基因敲除小鼠可延緩缺氧誘發(fā)PH的進(jìn)展，而再將miR-17/93基因重組到miR-17/93基因敲除小鼠中又加快了缺氧誘發(fā)PH的進(jìn)展，且該實(shí)驗(yàn)還證實(shí)miR-17z92基因?qū)GFb/Smad通路有正調(diào)控作用[30]。所以目前國內(nèi)外對(duì)IL-6在肺血管重構(gòu)中作用的研究主要關(guān)注IL-6對(duì)miR-17/92信號(hào)通路是否有直接或間接的調(diào)控作用[31]。

1.4 IL-6通過STAT3信號(hào)通路誘發(fā)VSMC增殖 IL-6的經(jīng)典信號(hào)通路傳導(dǎo)與抗炎功能有關(guān)，而反式信號(hào)通路傳導(dǎo)則與促炎功能有關(guān)，IL-6的反式信號(hào)通路可誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)產(chǎn)生，但I(xiàn)L-6需激活STAT3通路才能誘導(dǎo)MCP-1的表達(dá)，MCP-1在人體主要為血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放，其功能與內(nèi)皮細(xì)胞炎癥及增殖有關(guān)。近年來有研究報(bào)道，IL-6的高表達(dá)可上調(diào)STAT3表達(dá)，最終誘導(dǎo)PASMC過度增殖和凋亡導(dǎo)致PH的發(fā)生[32]。在野百合堿誘發(fā)PH的大鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，予野百合堿后2～4 d PY-STAT3過度激活，證實(shí)IL-6的表達(dá)與PY-STAT3激活程度呈正相關(guān)[33]，其機(jī)制可能是在IL-6刺激下STAT3的特異性酪氨酸殘基出現(xiàn)磷酸化并聚合，然后通過細(xì)胞質(zhì)擴(kuò)散到核孔區(qū)域并導(dǎo)入細(xì)胞核，從而激活靶基因轉(zhuǎn)錄[34-36]。但目前該機(jī)制僅在癌細(xì)胞的增殖中得到證實(shí)，是否為PH的主要機(jī)制目前尚不清楚[37]。

2 IL-6調(diào)控基因啟動(dòng)子甲基化與GATA-6的關(guān)系

2.1 IL-6對(duì)基因啟動(dòng)子甲基化的作用 DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)基因調(diào)控的一種形式，當(dāng)甲基化發(fā)生在調(diào)控區(qū)域時(shí)，其與轉(zhuǎn)錄因子的改變通常會(huì)導(dǎo)致靶基因表達(dá)受抑制。通常DNA甲基化發(fā)生在鳥嘌呤前的胞嘧啶殘基，即CpG島，甲基在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmts)催化下于CpG雙重蛋白內(nèi)的胞嘧啶殘基中形成5甲基胞嘧啶而發(fā)揮作用，目前研究表明，DNA甲基化在胚胎發(fā)生和惡性腫瘤的生長中扮演著重要角色[38-39]。Dnmts是催化DNA甲基化的關(guān)鍵酶，包括Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b，其中Dnmt3a、Dnmt3b負(fù)責(zé)甲基化的建立，Dnmt1負(fù)責(zé)維持及修復(fù)DNA甲基化功能。DNA甲基化在IL-6介導(dǎo)的基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用，其原因是IL-6通過誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化來下調(diào)靶基因的表達(dá)，導(dǎo)致靶基因沉默。既往研究發(fā)現(xiàn)，IL-6對(duì)Dnmt1啟動(dòng)子及Dnmt1酶活性的調(diào)節(jié)有直接作用[40]。在胰腺癌細(xì)胞的增殖過程中觀察到，IL-6誘導(dǎo)的STAT3將Dnmt1集中到SOCS3啟動(dòng)子位點(diǎn)，通過DNA甲基化抑制其轉(zhuǎn)錄[41]；在血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成中也可觀察到IL-6通過調(diào)控Dnmt1和Dnmt3b，從而誘導(dǎo)啟動(dòng)子DNA甲基化來影響血管內(nèi)皮細(xì)胞基因的表達(dá)[42]。Wehbe等[43]發(fā)現(xiàn)，膽管癌的生長需甲基化依賴的IL-6調(diào)控基因參與，同時(shí)IL-6還可通過影響其他酶的表達(dá)或活性來間接參與基因甲基化和轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的表達(dá)。

2.2 GATA-6基因在PH形成中的作用 近年來，GATA轉(zhuǎn)錄因子家族在細(xì)胞增殖中的作用受到高度重視[44]。GATA家族具有兩個(gè)特征性鋅指結(jié)構(gòu)和特定的核苷酸序列,按表達(dá)方式的不同被分為兩個(gè)亞族。GATA-6是唯一表達(dá)于VSMC的GATA家族轉(zhuǎn)錄因子，由Tamura等[45]首次在兔胃組織中發(fā)現(xiàn),其作用與調(diào)節(jié)PASMC表型轉(zhuǎn)化有關(guān)，同時(shí)GATA-6可抑制細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，能維持靜止期細(xì)胞表型的穩(wěn)定性，即對(duì)平滑肌細(xì)胞的增殖與分化有重要的臨床意義。

2.2.1 關(guān)于血管平滑肌表型的轉(zhuǎn)化：1913年，Champy首次在體外培養(yǎng)出VSMC，并發(fā)現(xiàn)有2種功能截然不同的VSMC[46]，此后Chamley-Campbell等[47]提出兩種不同功能的VSMC可能是其分化狀態(tài)的兩個(gè)極端，并首次提出表型轉(zhuǎn)化的概念，即VSMC在來自胚胎發(fā)育時(shí),首先分化為不同的細(xì)胞群并獲得具有成年特征的收縮表型,主要功能是促進(jìn)及穩(wěn)定血管的正常生理活動(dòng)；當(dāng)分化成熟后的VSMC在內(nèi)外環(huán)境因素刺激下可發(fā)生去分化,成為分化程度較低的合成表型,表現(xiàn)為VSMC異常增殖、遷移、凋亡等。我們把VSMC從收縮表型轉(zhuǎn)化為合成表型并重獲增殖能力的過程稱為表型的轉(zhuǎn)化。

2.2.2 GATA-6在維持血管平滑肌表型中的作用：VSMC收縮表型中標(biāo)志基因的表達(dá)有賴于血清反應(yīng)因子(SRF)與位于這些基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子內(nèi)的CArG盒的結(jié)合，而SRF的表達(dá)又有賴于GATA-6的調(diào)控。在體外培養(yǎng)VSMC過程中發(fā)現(xiàn)，GATA-6 mRNA通過有絲分裂原的刺激和在增殖過程中過表達(dá)的GATA-6負(fù)反饋機(jī)制來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期的阻滯，從而使VSMC生長停滯[48-49]。有數(shù)據(jù)表明，單獨(dú)敲除GATA-6基因可使平滑肌細(xì)胞保持收縮表型的能力降低60%[48]。在敲除GATA-6基因的小鼠中可觀察到肺動(dòng)脈壓力明顯升高，并表現(xiàn)出血管肌化及肺部炎癥加強(qiáng)[49]。GATA-6基因腺病毒轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞的微點(diǎn)陣基因芯片分析表明，GATA-6轉(zhuǎn)錄因子也能激活ET-1的轉(zhuǎn)錄，促使血管平滑肌從收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化[48]?，F(xiàn)有研究表明，GATA-6的表達(dá)對(duì)肺血流動(dòng)力學(xué)的影響尤其重要，GATA-6的下調(diào)能明顯提高肺動(dòng)脈壓力，而對(duì)動(dòng)脈壓的增加無明顯作用，同時(shí)在野百合堿致大鼠缺氧模型和慢性缺氧小鼠模型中觀察到從損傷后第3天起肺GATA-6 mRNA水平便迅速下降，表明GATA-6表達(dá)變化可能是引起PH血管重構(gòu)的早期病理過程[50]。在PH患者中，內(nèi)皮細(xì)胞是CX3CL1的主要來源，而CX3CL1是大鼠GATA-6缺陷的血管內(nèi)皮細(xì)胞中顯著上調(diào)的基因之一[51]，表明GATA-6的下調(diào)可能直接導(dǎo)致了炎性反應(yīng)的發(fā)生。所以GATA-6在維持VSMC收縮表型的穩(wěn)定性及調(diào)控VSMC的發(fā)育和分化中發(fā)揮重要作用。

2.3 IL-6與GATA-6可能的潛在關(guān)系 既往證據(jù)表明，平滑肌細(xì)胞DNA是否甲基化在血管平滑肌表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用，而表型的轉(zhuǎn)化決定著VSMC是否進(jìn)行增殖[52]。雖然GATA-6在維持VSMC收縮表型的穩(wěn)定性及調(diào)控VSMC的分化中發(fā)揮重要作用，但是IL-6誘導(dǎo)GATA-6啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化最終引起VSMC增殖/凋亡異?？勺钄噙@種作用。但目前IL-6誘導(dǎo)GATA-6啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化引起靶基因沉默來參與PASMC異常增殖這一機(jī)制還未被完全證實(shí)。

3 前景與展望

關(guān)于PASMC異常增殖，國內(nèi)外已有學(xué)者開始研究IL-6在肺血管重構(gòu)中的促進(jìn)作用，但主要關(guān)注IL-6對(duì)信號(hào)通路的調(diào)控，而在炎癥狀態(tài)下，PASMC通過直接接受IL-6的刺激，并經(jīng)IL-6對(duì)GATA-6基因啟動(dòng)子進(jìn)行甲基化修飾，使GATA-6失去對(duì)下游增殖及凋亡基因的調(diào)控，從而在PH肺血管重構(gòu)中起重要作用的研究目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。所以研究IL-6信號(hào)通路調(diào)控GATA-6基因啟動(dòng)子甲基化在PASMC異常增殖中的作用尤為重要，這將為確定PH的發(fā)生機(jī)制和新的治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。