舒芬太尼對心肌缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2、LC3Ⅱ、Beclin-1表達(dá)的影響

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)是指心肌缺血后重新獲得血液灌注而引起的，以心律失常、心肌頓抑、心肌梗死面積擴(kuò)大等為主要表現(xiàn)的功能障礙及結(jié)構(gòu)損傷性疾病[1]。MIRI好發(fā)于冠狀動脈支架植入手術(shù)、急性心肌梗死溶栓等治療后，是制約心血管阻塞性疾病再通后療效的主要因素之一[2]。近年來，隨著生活水平改變和人口老齡化進(jìn)展，我國心血管疾病的發(fā)生率不斷增加，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國目前約有2.9億心血管疾病病人，死亡率占死亡構(gòu)成的40%以上[3]，高于腫瘤及其他疾病，居于首位。使缺血的心肌盡快恢復(fù)灌注是治療心血管疾病的主要方向，但MIRI的存在又嚴(yán)重影響治療效果，故采取措施減輕MIRI對于心血管疾病的治療有重要意義。目前，臨床上對于MIRI仍無特效治療方案，有研究認(rèn)為，阿片類藥物對于器官缺血再灌注損傷有明確的保護(hù)作用[4]。舒芬太尼是臨床常用的阿片類麻醉劑之一，也可以拮抗MIRI[5]，但具體的作用機(jī)制尚未完全明確。本研究探討舒芬太尼對心肌缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ(LC3Ⅱ)、Beclin-1表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 6～7周齡SPF級健康雄性SD大鼠52只，體重200～260(231.37±17.63)g，動物許可證號：生產(chǎn)許可SCXK(滬)2017-0003，由中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)(實(shí)驗(yàn)動物中心)提供。所有大鼠分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室內(nèi)安靜、通風(fēng)，溫度設(shè)定為20～25 ℃，濕度控制在50%～70%，晝夜節(jié)律為12 h，大鼠自由活動并攝入標(biāo)準(zhǔn)飼料、滅菌水，定期更換墊料、清掃飼養(yǎng)室、消毒。

1.1.2 主要藥品與試劑 枸櫞酸舒芬太尼注射液，規(guī)格：每支50 μg，批號：20170223，購自宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司；3-甲基腺嘌呤(3-MA)，規(guī)格：每瓶50 mg，純度98%，CAS號：5142-23-4，貨號：Z-DLM-7471-PK-50MG，購自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司。10%水合氯醛，購自成都普濟(jì)醫(yī)藥化工有限公司；肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法試劑盒，購自齊一生物科技(上海)有限公司；RIPA組織細(xì)胞快速裂解液(含苯甲基磺酰氟)，購自北京泰澤瑞達(dá)科技有限公司；二喹啉甲酸法(BCA)法蛋白定量試劑盒，購自上海澤葉生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE凝膠)制備試劑盒、聚偏二氟己稀膜(PVDF膜)，購自金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(TBS)緩沖液，購自武漢賽維爾生物科技有限公司；B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bax)、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG，購自美國CST公司；超敏化學(xué)發(fā)光底物(ECL)試劑盒，購自上海喬羽生物科技有限公司；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記測定法(TUNEL法)細(xì)胞凋亡試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑，購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 SAR-830小動物呼吸機(jī)，美國CWE公司產(chǎn)品；LS-20ECG動物心電圖記錄分析儀，北京拜安吉科技有限公司產(chǎn)品； Heraeus biofuge 22R型離心機(jī)，德國Heraeus公司產(chǎn)品；酶免之星E-STAR 4CH全自動酶免分析儀，瑞士Asubio公司產(chǎn)品；SPIFE 3000型全自動電泳儀，美國Helena公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 造模及實(shí)驗(yàn)方法[6]所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)時(shí)間為5 d，結(jié)束后，按隨機(jī)數(shù)字表法將所有大鼠分為對照組、模型組、3-MA組及舒芬太尼組，各13只。模型組、3-MA組及舒芬太尼組大鼠均建立心肌缺血再灌注模型，予以10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射以麻醉大鼠，之后將其仰臥位固定于鼠板上，氣管插管，連接小動物呼吸機(jī)及心電圖儀；在左側(cè)第四肋間取縱向切口，長度為1 cm，切開皮膚，逐層打開胸壁，暴露心臟，于動脈圓錐和左心耳間冠狀靜脈處，用6號普理靈不可吸收縫線結(jié)扎左冠狀動脈前降支；結(jié)扎后，心臟局部有發(fā)紺出現(xiàn)，心電圖ST段弓背抬高即為結(jié)扎成功，30 min后解開縫線，恢復(fù)灌注，心臟局部發(fā)紺區(qū)轉(zhuǎn)紅，心電圖弓背抬高的ST段回落即為再灌注恢復(fù)。對照組大鼠接受相同的手術(shù)操作，但不結(jié)扎冠狀動脈。

冠狀動脈結(jié)扎前30 min，3-MA組給予3-MA溶液20 mg/kg，尾靜脈注射；舒芬太尼組給予枸櫞酸舒芬太尼注射液3 μg/kg，尾靜脈注射；模型組、對照組分別給予等體積0.9%氯化鈉溶液，尾靜脈注射。整個(gè)過程中如有造模失敗或意外死亡的大鼠及時(shí)補(bǔ)充。

1.2.2 標(biāo)本采集與處理[7]心肌再灌注2 h后，打開大鼠腹腔，自腹主動脈取血2 mL，靜置30 min，采用離心機(jī)以3 000 r/min速度離心15 min，分離血清，置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)錂z；之后完整摘取心臟，采用預(yù)冷的生理鹽水洗去殘血，于冰上切取左冠狀動脈供血區(qū)心肌組織，取其中1/2心肌組織，4%甲醛固定4 h，經(jīng)梯度濃度乙醇脫水、二甲苯透明后，常規(guī)采用石蠟包埋，切片，厚度為4 μm；剩余1/2心肌組織置于液氮內(nèi)迅速冷凍，-80 ℃保存?zhèn)錂z。

1.2.3 ELISA法檢測血清心肌酶水平檢測 取1.2.2中制備的血清，迅速解凍，按照試劑盒說明書步驟，采用全自動酶免分析儀，通過ELISA法檢測血清CK、LDH、CK-MB水平[8]。

1.2.4 TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡 取1.2.2中制備的心肌組織石蠟切片，常規(guī)二甲苯作用10 min脫蠟，依次采用100%、95%、95%、80%乙醇處理5 min水化，采用3%過氧化氫溶液處理10 min，PBS沖洗3 min×3次；按照試劑盒說明配制TUNEL檢測液并滴加在切片上，37 ℃濕盒內(nèi)反應(yīng)60 min，PBS沖洗3 min×3次；滴加DAB顯色劑，待顯色清晰時(shí)自來水沖洗結(jié)束顯色，常規(guī)85%、95%、100%梯度濃度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察TUNEL染色結(jié)果并進(jìn)行拍照，在40×高倍鏡下選擇5個(gè)不重復(fù)視野，采用Image-Pro Plus 4.5圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞核數(shù)和細(xì)胞核總數(shù)，并根據(jù)凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞核數(shù)/細(xì)胞核總數(shù)×100%，計(jì)算心肌細(xì)胞AI，取平均值[9]。

1.2.5 Western Blot法檢測大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平[9]取出1.2.2中冷凍保存的心肌組織40 mg，剪碎，加入RIPA組織細(xì)胞快速裂解液0.5 mL，采用透明玻璃勻漿器充分勻漿，轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)置于冰上裂解30 min，以14 000 r/min速度低溫離心10 min，獲取上清液；按照BCA法蛋白定量試劑盒說明書中步驟，檢測上清液中總蛋白質(zhì)含量；制備SDS-PAGE凝膠并固定于電泳儀上，每個(gè)蛋白樣品上樣20 μg，設(shè)定電泳條件為濃縮膠100 V、時(shí)間30 min，分離膠120 V、時(shí)間1 h，分離目的蛋白；將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF上，采用TBS緩沖液(5%脫脂奶粉)4 ℃搖床封閉過夜；洗膜，置于分別含有Bcl-2(1∶1 000稀釋)、Bax(1∶1 000稀釋)、LC3Ⅱ(1∶1 000稀釋)、Beclin-1(1∶1 000稀釋)蛋白抗體及1∶50稀釋的GAPDH(內(nèi)參)3 mL的小槽內(nèi)，室溫?fù)u床孵育1 h；洗膜，置于含有3 mL HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)的小槽內(nèi)，室溫?fù)u床孵育40 min；洗膜，在暗室內(nèi)，按照ECL試劑盒說明進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，晾干膠片；掃描膠片，采用Image-Pro Plus 6.0凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，確定目的蛋白條帶的光密度值，計(jì)算心肌組織Bcl-2、Bax、LC3Ⅱ、Beclin-1相對表達(dá)量以及Bcl-2/Bax比值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清CK、LDH、CK-MB水平比較 與對照組比較，其他各組大鼠血清CK、LDH、CK-MB水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，3-MA組和舒芬太尼組大鼠血清CK、LDH、CK-MB水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；舒芬太尼組大鼠血清CK、LDH、CK-MB水平低于3-MA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

組別只數(shù)CK(×102 U/L)LDH(×102 U/L)CK-MB(ng/mL)對照組1315.37±2.1111.45±1.530.21±0.03模型組1332.49±4.18①28.64±3.85①1.73±0.24①3-MA組13 26.44±3.36①② 21.18±3.02①② 0.56±0.06①②舒芬太尼組13 23.65±3.02①②③ 16.83±2.16①②③ 0.38±0.05①②③F值62.10588.651381.387P0.0000.000 0.000

與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與3-MA組比較，③P<0.05。

2.2 各組大鼠心肌組織AI比較 TUNEL法檢測結(jié)果顯示，光鏡下，正常心肌細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)色，而凋亡陽性細(xì)胞的細(xì)胞核被染成棕褐色，且細(xì)胞核固縮，各組心肌凋亡陽性細(xì)胞數(shù)量存在差異(見圖1)。與對照組比較，各組大鼠心肌組織AI升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，3-MA組和舒芬太尼組大鼠心肌組織AI降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且舒芬太尼組大鼠心肌組織AI低于3-MA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

注：A為對照組；B為模型組；C為3-MA組；D為舒芬太尼組。

組別只數(shù)AI對照組132.48±0.32模型組1338.74±5.17①3-MA組13 23.36±3.06①②舒芬太尼組13 17.25±2.39①②③F值279.667P0.000

與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與3-MA組比較，③P<0.05。

2.3 各組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較，各組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2/Bax比值降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，3-MA組和舒芬太尼組大鼠心肌組織Bax蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且舒芬太尼組大鼠心肌組織Bax蛋白表達(dá)水平低于3-MA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，3-MA組和舒芬太尼組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白表達(dá)水平及Bcl-2/Bax比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且舒芬太尼組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白表達(dá)水平及Bcl-2/Bax比值高于3-MA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3、圖2。

組別只數(shù)Bcl-2蛋白Bax蛋白Bcl-2/Bax對照組130.33±0.040.18±0.021.83±0.12模型組130.42±0.06①0.63±0.08①0.72±0.09①3-MA組13 0.61±0.08①② 0.37±0.05①② 1.64±0.22①②舒芬太尼組13 0.68±0.05①②③ 0.29±0.04①②③ 2.17±0.31①②③F值97.608175.043119.714P0.000 0.000 0.000

與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與3-MA組比較，③P<0.05。

注：A為對照組；B為模型組；C為3-MA組；D為舒芬太尼組。

2.4 各組大鼠心肌組織LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較，各組大鼠心肌組織LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，3-MA組和舒芬太尼組大鼠心肌組織LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且舒芬太尼組大鼠心肌組織LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平低于3-MA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 詳見表4、圖3。

表4 各組大鼠心肌組織LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平比較(±s)

與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與3-MA組比較，③P<0.05。

注：A為對照組；B為模型組；C為3-MA組；D為舒芬太尼組。

3 討 論

血運(yùn)重建是恢復(fù)冠心病病人心肌血供的重要手段，而MIRI不僅影響治療效果，而且可加重心肌細(xì)胞損傷、壞死，是冠心病治療中亟待解決的問題之一。MIRI是多種因素共同作用的結(jié)果，發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前常見的有氧化應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和心肌損傷、細(xì)胞內(nèi)和線粒體鈣離子超載、生理pH值迅速恢復(fù)致心肌細(xì)胞過度攣縮、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放致三磷酸腺苷缺失和細(xì)胞死亡[10]等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬在MIRI的發(fā)生過程中具有重要作用，生理狀態(tài)下的細(xì)胞自噬有助于改善能量代謝維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，而過度自噬則會加速必要蛋白質(zhì)、細(xì)胞器等降解，引起細(xì)胞功能障礙、死亡[11]。Tsai等[12]研究發(fā)現(xiàn)，自噬抑制劑3-MA能在體外抑制心肌細(xì)胞死亡，也側(cè)面證實(shí)了自噬能誘發(fā)心肌細(xì)胞死亡這一觀點(diǎn)。因此，細(xì)胞自噬也可能是減輕MIRI的作用靶點(diǎn)之一。關(guān)于減輕MIRI的策略，目前主要包括缺血預(yù)適應(yīng)、缺血后處理、遠(yuǎn)程缺血預(yù)適應(yīng)、藥物干預(yù)等，其中藥物干預(yù)適用性最強(qiáng)。

本研究采用左冠狀動脈結(jié)扎法建立缺血再灌注大鼠模型，并于結(jié)扎前分別采用3-MA、舒芬太尼干預(yù)大鼠，以探討舒芬太尼對MIRI的影響及作用機(jī)制。舒芬太尼為臨床廣泛應(yīng)用的阿片類麻醉藥物，具有較好的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用，醫(yī)學(xué)界關(guān)于其在MIRI中的作用已經(jīng)有了一部分研究。劉祥等[13]研究認(rèn)為，舒芬太尼可能通過激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(Akt)信號通路來減輕大鼠MIRI，起到保護(hù)心肌的作用。常健[14]則發(fā)現(xiàn)，舒芬太尼對一氧化氮、超氧化物歧化酶等氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)有調(diào)節(jié)作用，并因此減輕了MIRI大鼠的心肌損傷程度。以上研究均證實(shí)舒芬太尼具有心肌保護(hù)作用，但具體的作用機(jī)制尚未有定論。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，3-MA組和舒芬太尼組大鼠血清CK、LDH、CK-MB水平降低，且舒芬太尼組大鼠血清CK、LDH、CK-MB水平低于3-MA組，CK、LDH、CK-MB均為評估心肌損傷的敏感指標(biāo)，可用于判斷MIRI程度，該結(jié)果再次證實(shí)舒芬太尼能夠減輕心肌損傷，保護(hù)心肌組織。

而關(guān)于舒芬太尼的具體作用機(jī)制，本研究主要從細(xì)胞自噬方面分析。LC3Ⅱ和Beclin-1均為細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白。LC3Ⅱ?qū)儆谧允审w膜蛋白，為自噬體的標(biāo)志分子，其水平與自噬泡的形成數(shù)量有關(guān)，可以相對定量評價(jià)自噬的活性程度；Beclin-1為酵母自噬相關(guān)基因6的同源物，屬于自噬激活的參與蛋白，可調(diào)控自噬體形成過程。Disatnik等[15]通過體外研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷期間的自噬活性升高與Beclin-1過度表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，3-MA組和舒芬太尼組大鼠心肌組織LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平降低，且舒芬太尼組大鼠心肌組織LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平低于3-MA組，表明舒芬太尼可以有效下調(diào)LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)，抑制自噬過度激活，減輕相關(guān)損傷。

細(xì)胞自噬除了引起細(xì)胞代謝障礙外，激活超過一定閾值還會引發(fā)Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡或凋亡，而這個(gè)過程取決于Beclin-1和Bcl-2之間的平衡。Bcl-2是常見的凋亡分子，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，Maejima等[16]研究認(rèn)為，Bcl-2對于Beclin-1有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，剝奪心肌細(xì)胞營養(yǎng)后，Bcl-2表達(dá)下降，能夠促進(jìn)Beclin-1激活介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬。Bax屬于Bcl-2家族的促凋亡蛋白，具有加速細(xì)胞凋亡的作用，故相關(guān)研究中多采用Bcl-2/Bax比值來評價(jià)細(xì)胞凋亡的程度。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，3-MA組和舒芬太尼組大鼠心肌組織Bax蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平及Bcl-2/Bax比值升高，且舒芬太尼組大鼠心肌組織Bax蛋白表達(dá)水平低于3-MA組，Bcl-2蛋白表達(dá)水平及Bcl-2/Bax比值高于3-MA組，表明舒芬太尼能夠調(diào)控Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而使得舒芬太尼組大鼠心肌組織AI低于3-MA組，缺血再灌注損傷的程度相應(yīng)減輕。

綜上所述，舒芬太尼能明顯減輕心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷，減少心肌細(xì)胞凋亡，其作用可能與下調(diào)LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞自噬有關(guān)。