銀杏黃酮對非酒精性脂肪肝大鼠肝臟組織中脂質(zhì)和炎癥因子水平的影響

韓 靜，李亞偉，劉艷萍，劉 宏，郭金波，王素星

1)河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院體檢中心 石家莊 050000 2)石家莊市第三醫(yī)院心內(nèi)科 石家莊 050011 3)河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院東院區(qū)消化內(nèi)科 石家莊 050035 4)河北省人民醫(yī)院老年病二科 石家莊 050051

非酒精性脂肪肝以肝實質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和積累為臨床特征，肥胖、胰島素抵抗、脂代謝紊亂等均可誘發(fā)非酒精性脂肪肝[1]。研究[2]顯示，非酒精性脂肪肝與氧化應(yīng)激、炎癥等有關(guān)。銀杏黃酮是銀杏葉中的活性成分，臨床上常用于治療心腦相關(guān)疾病[3]。研究[4-5]表明，銀杏黃酮具有抗氧化、抗血小板聚集、調(diào)節(jié)自噬、消炎等功效，對心肌缺血再灌注損傷、動脈粥樣硬化等具有治療作用。有研究[6]顯示，銀杏黃酮處理后的非酒精性脂肪肝小鼠肝組織脂肪變性程度有所緩解，提示銀杏黃酮對于非酒精性脂肪肝具有保護(hù)作用。本研究通過構(gòu)建非酒精性脂肪肝大鼠模型，探討銀杏黃酮對非酒精性脂肪肝大鼠肝臟炎癥和脂質(zhì)水平的影響，為非酒精性脂肪肝的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料47只5～6周齡SD雄性健康大鼠，體重130～150 g，清潔級，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，大鼠飼養(yǎng)溫度為18～22 ℃，12 h光照，濕度為45%～55%。銀杏黃酮購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司，AST、ALT含量檢測試劑盒購自艾美捷科技有限公司，SOD檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒購自南京建成生物研究所，TG檢測試劑盒、LDL-C檢測試劑盒、游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司， TNF-α抗體購自美國Santa Cruz公司，IL-1β抗體購自美國Abcam公司。山羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2模型構(gòu)建大鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周以后，選擇9只大鼠給予普通飼料(正常對照組)，選取38只大鼠給予高脂飼料，取高脂飼料喂養(yǎng)4周的2只大鼠進(jìn)行肝臟病理變化檢測，確定造模成功后將余下的36只隨機分成為模型組和銀杏黃酮低、中、高劑量組，每組9只。第5～10周開始，銀杏黃酮低、中、高劑量組大鼠以80、160、320 mg/kg的銀杏黃酮灌胃處理，1次/d，模型組和正常對照組大鼠給予等量的生理鹽水。各組大鼠均不限制飲食。

1.3標(biāo)本采集和肝臟指數(shù)的計算第10周末各組大鼠禁食12 h，稱取體重，用20 g/L的戊巴比妥鈉(按照1 mL/kg)腹腔注射麻醉，心臟采血，摘取肝臟組織，稱量肝臟濕重。采集的心臟血以4 000 ×g離心5 min后分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。肝臟指數(shù)=[肝臟濕重(g)÷體重(g)]×100%。

1.4血清ALT、AST水平的檢測取各組大鼠血清，以全自動生化儀檢測ALT、AST水平，步驟參照試劑盒說明書。

1.5肝臟組織中TG、LDL-C、FFA、SOD、MDA水平檢測取各組大鼠肝臟組織，以生理鹽水洗滌后，取0.7 g肝臟組織，添加5 mL的生理鹽水，制成肝組織勻漿，用全自動生化分析儀檢測TG、LDL-C、FFA、SOD、MDA水平，步驟參照試劑盒說明書。

1.6肝臟組織中IL-1β、TNF-α蛋白水平檢測取各組大鼠肝臟組織，研磨后，添加含有苯甲基磺酞氟(PMSF)的RIPA蛋白裂解液充分裂解，12 000 ×g離心10 min，取總蛋白行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜。加100 g/L脫脂奶粉封閉，室溫孵育2 h。加入按1∶1 000稀釋的IL-1β、TNF-α一抗反應(yīng)過夜以后，再加按1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，反應(yīng)2 h后ECL顯色。利用Image Quant Las 4 000 mini拍照并分析條帶灰度值。以目的蛋白和β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白的表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。5組大鼠以上各指標(biāo)的檢測采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠肝臟指數(shù)及血清ALT、AST水平的比較與正常對照組比較，模型組大鼠肝臟指數(shù)及血清中ALT、AST水平均升高；與模型組比較，銀杏黃酮低、中、高劑量組大鼠血清中肝臟指數(shù)及ALT、AST水平均降低，且隨銀杏黃酮劑量的升高有降低的趨勢(表1)。

表1 各組大鼠肝臟指數(shù)及血清ALT、AST水平的比較

2.2各組大鼠肝臟組織中TG、LDL-C、FFA水平的比較與正常對照組比較，模型組大鼠肝臟組織中TG、LDL-C、FFA水平升高；與模型組比較，銀杏黃酮低、中、高劑量組大鼠肝臟組織中TG、LDL-C、FFA水平均降低，且隨銀杏黃酮劑量的升高有降低的趨勢(表2)。

表2 各組大鼠肝臟組織中TG、LDL-C、FFA水平的比較

2.3各組大鼠肝臟組織中IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平的比較與正常對照組比較，模型組肝臟組織中IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平升高；與模型組比較，銀杏黃酮低、中、高劑量組大鼠肝臟組織中IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平均降低，且隨銀杏黃酮劑量的升高有降低的趨勢(圖1、表3)。

1～5：分別為正常對照組、模型組及銀杏黃酮低、中、高劑量組

表3 各組大鼠肝臟組織中IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平的比較

2.4各組大鼠肝臟組織中SOD、MDA水平的比較與正常對照組比較，模型組肝臟組織中SOD活性降低，MDA含量升高；與模型組比較，銀杏黃酮低、中、高劑量組大鼠肝臟組織中SOD活性升高，MDA含量降低，且隨銀杏黃酮劑量的升高，SOD活性有升高的趨勢，MDA含量有降低的趨勢(表4)。

表4 各組大鼠肝臟組織中SOD、MDA水平的比較

3 討論

脂肪肝是一種臨床上常見的慢性疾病，其可以演變?yōu)楦卫w維化、肝硬化、肝炎等。非酒精性脂肪肝患者無過量飲酒史，以肝脂肪變性和脂肪貯積為特征[7]。非酒精性脂肪肝的發(fā)生與氧自由基損傷、營養(yǎng)失調(diào)、微循環(huán)障礙等有關(guān)[8]。ALT、AST是存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)的細(xì)胞因子，當(dāng)肝細(xì)胞受損時，能夠進(jìn)入血清中，導(dǎo)致血清ALT、AST水平升高，因此，血清ALT、AST水平的高低是肝損傷程度的標(biāo)志[9-10]。本實驗構(gòu)建的非酒精性脂肪肝模型大鼠血清ALT、AST水平升高，肝臟指數(shù)升高，肝組織中TG、LDL-C、FFA水平升高，說明成功構(gòu)建了非酒精性脂肪肝大鼠模型。

銀杏葉是傳統(tǒng)中藥，其主要成分為黃酮類化合物，具有調(diào)血脂、抗氧化、擴張血管、抑制血小板活化等作用，對于動脈粥樣硬化、腫瘤、中樞神經(jīng)功能障礙等具有明顯的治療或改善作用[11-14]。研究[6,15]表明，銀杏黃酮處理后的非酒精性脂肪肝鼠血清TG水平降低，鼠肝臟組織脂肪變性程度改善，對非酒精性脂肪肝具有治療作用。本實驗結(jié)果表明，銀杏黃酮灌胃處理后，非酒精性脂肪肝大鼠血清ALT、AST水平降低，肝臟指數(shù)降低，肝組織中TG、LDL-C、FFA水平降低，其作用隨劑量的增加而增強，說明銀杏黃酮尤其是高劑量銀杏黃酮可減輕非酒精性脂肪肝大鼠的肝損傷，減少肝臟脂質(zhì)沉積。

研究[16]表明，非酒精性脂肪肝發(fā)生時，肝臟脂質(zhì)沉積能夠誘發(fā)肝組織炎癥。TNF-α是一種典型的脂肪細(xì)胞因子，其可以降低肝細(xì)胞脂肪酸氧化受體水平，從而促進(jìn)細(xì)胞中氧自由基和脂肪酸的積累；另外，TNF-α還是一種肝損傷早期出現(xiàn)的一種促炎因子，其可以誘導(dǎo)Kupffer細(xì)胞合成大量的白介素，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞聚集，引起肝臟炎癥和損傷[17]。IL-1β作為一種促炎因子，除了參與組織炎癥反應(yīng)之外，還能夠抑制肝細(xì)胞對TG等脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運，脂質(zhì)通過過氧化反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞受損，引起組織炎癥[18]。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其表達(dá)水平升高標(biāo)志著氧化損傷的發(fā)生[19]。SOD是氧自由基清除劑，其活性降低導(dǎo)致組織中氧自由基的積累[20]。本實驗結(jié)果顯示，銀杏黃酮治療后，非酒精性脂肪肝大鼠肝臟組織中MDA含量降低，SOD活性升高，同時肝組織中TNF-α、IL-1β水平降低，說明銀杏黃酮可能通過抑制肝組織的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，銀杏黃酮能夠減輕非酒精性脂肪肝大鼠肝組織損傷，其作用機制與減少肝組織脂質(zhì)沉積、抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激有關(guān)，銀杏黃酮可能是治療非酒精性脂肪肝的有效藥物。