自噬抑制劑3-MA對重度急性胰腺炎大鼠腸道黏膜屏障作用的實(shí)驗(yàn)研究*

羅旭娟 彭 燕 陳 霞 石 蕾

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科1(637000) 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科2

背景：腸道黏膜屏障功能與重度急性胰腺炎(SAP)患者病情轉(zhuǎn)歸有密切關(guān)系，保護(hù)腸道黏膜屏障功能已成為SAP治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目的：探索自噬與SAP腸道黏膜屏障功能的關(guān)系以及自噬抑制劑3-MA對SAP腸道黏膜屏障功能的影響。方法：將SD大鼠分為假手術(shù)組(SO組)、急性壞死性胰腺炎組(ANP組)、3-MA組，并進(jìn)一步分為術(shù)后3 h、6 h、12 h三個(gè)亞組。采用HE染色觀察胰腺組織、腸道組織病理變化，檢測血淀粉酶，ELISA法檢測血清內(nèi)毒素、腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(I-FABP)水平，蛋白質(zhì)印跡法檢測Beclin-1蛋白表達(dá)。結(jié)果：與SO組相比，ANP組各時(shí)間點(diǎn)胰腺和末端回腸組織病理學(xué)評分、血淀粉酶、內(nèi)毒素、I-FABP明顯升高(P<0.05)，Beclin-1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，且均呈時(shí)間依賴性(P<0.05)；給予3-MA后，上述各指標(biāo)均明顯改善(P<0.05)。結(jié)論：在SAP中，腸道自噬隨病情進(jìn)展逐漸增加，以3-MA干預(yù)后，腸道自噬有所減少，且腸道黏膜屏障功能損傷減輕。提示腸道自噬與SAP腸道黏膜屏障功能損傷有關(guān)，3-MA對其有一定抑制作用。

重度急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是臨床上常見急腹癥之一，其發(fā)病迅速，病情進(jìn)展快，病死率高，已成為臨床治療難點(diǎn)之一[1]。SAP早期即合并多器官功能障礙，而腸道是最早出現(xiàn)障礙的器官之一。大量研究表明，腸道黏膜屏障功能障礙可導(dǎo)致腸道細(xì)菌、內(nèi)毒素移位，從而使SAP患者感染并發(fā)癥發(fā)生率上升，加重病情。預(yù)防和治療腸道功能障礙已成為SAP治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。自噬在SAP中的作用是近年研究的新領(lǐng)域，已有研究表明，SAP時(shí)自噬被異常激活且自噬通路受阻，自噬泡異常堆積，導(dǎo)致胰蛋白酶原在胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)激活損傷胰腺腺泡細(xì)胞從而啟動(dòng)并加重SAP[2]。但自噬與SAP腸道黏膜屏障功能關(guān)系的研究目前尚少見。本研究通過采用急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)模型觀察自噬與SAP腸道黏膜屏障功能障礙的關(guān)系以及自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)對SAP腸道黏膜屏障功能的作用，旨在為SAP腸道黏膜屏障功能的保護(hù)探索新的治療措施。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

健康雄性Sprague-Dawley大鼠共90只，體質(zhì)量200～250 g，購自西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)48 h。本研究方案由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：201906-2)，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

3-MA(Sigma公司)，ELISA檢測試劑盒(武漢默沙克生物科技有限公司)，Beclin-1、GAPDH抗體(Cell Signaling Technology, Inc.)。

二、研究方法

1. 動(dòng)物分組和模型制備：實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，大鼠自由飲水，實(shí)驗(yàn)前2 h禁水。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO組)、ANP組、3-MA組，每組各30只，各組再進(jìn)一步分為術(shù)后3、6、12 h亞組，每亞組各10只。采用改良Aho方法制備ANP模型[3]，SO組大鼠開腹后僅將十二指腸提出切口，輕輕翻動(dòng)胰腺后立即關(guān)腹。3-MA組大鼠在建立ANP模型前30 min腹腔注射3-MA(15 mg/kg)。各組大鼠分別于術(shù)后3 h、6 h、12 h經(jīng)腹主動(dòng)脈穿刺采血，分離血清后置于-80 ℃冰箱保存。采血后迅速將大鼠處死，快速取出胰腺、末端回腸組織，部分于4%多聚甲醛固定，部分-80 ℃保存用于后續(xù)測定。

2. 血淀粉酶：收集各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血淀粉酶。

3. 組織病理學(xué)檢查：取各組大鼠胰腺、末端回腸組織，4%多聚甲醛固定標(biāo)本，石蠟包埋，切片，HE染色。采用盲法由兩位?？撇±磲t(yī)師于光學(xué)顯微鏡下閱片評分，胰腺組織采用改良Schmidt評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[4]，末端回腸組織采用Chiu小腸組織損傷評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[5]。

4. 腸道通透性的測定：采用ELISA法測定造模3 h、6 h、12 h大鼠血清內(nèi)毒素、腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(I-FABP)，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

5. 腸道組織Beclin-1蛋白表達(dá)：取各組大鼠末端回腸組織，加入組織裂解液于冰上裂解，提取總蛋白，使用BCA法定量蛋白濃度。每孔上樣20 μg蛋白，行SDS聚丙烯凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉，加入一抗(按1∶1 000稀釋Beclin-1)4 ℃過夜，PBST洗滌，加入二抗室溫孵育1 h；ECL顯色，采用Quantity One軟件測定各條帶灰度值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、胰腺、腸道組織病理學(xué)改變

SO組胰腺、腸道組織無明顯改變。ANP組大鼠腹腔出現(xiàn)淡紅色腹水，胰腺不同程度充血、點(diǎn)片狀壞死；鏡下可見胰腺水腫，腺泡結(jié)構(gòu)破壞，小葉間隔增寬，腺泡細(xì)胞不同程度壞死，周邊可見中性粒細(xì)胞浸潤，且隨時(shí)間延長而加重。ANP組大鼠末端回腸黏膜層重度水腫，小腸絨毛短小、稀少、脫落、斷裂現(xiàn)象明顯；上皮細(xì)胞脫落明顯；絨毛固有層結(jié)締組織松散，中性粒細(xì)胞浸潤明顯，小腸腺變淺，數(shù)量明顯減少，且隨時(shí)間延長而損傷加重。ANP組和3-MA組胰腺和末端回腸組織病理學(xué)評分均隨時(shí)間延長而升高(P<0.05)。與SO組相比，ANP組、3-MA組各時(shí)間點(diǎn)胰腺和末端回腸組織病理學(xué)評分均顯著升高(P<0.05)；與ANP組相比，3-MA組12 h時(shí)的胰腺組織病理學(xué)評分顯著降低(P<0.05)，6 h、12 h時(shí)的末端回腸組織病理學(xué)評分亦顯著降低(P<0.05；圖1、表1)。

表1 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)胰腺和末端回腸組織病理學(xué)評分比較

二、血淀粉酶

ANP組、3-MA組血淀粉酶水平均隨時(shí)間延長而顯著升高(P<0.05)。與SO組相比，ANP組、3-MA組血淀粉酶水平均顯著升高(P<0.05)；與ANP組相比，3-MA組各時(shí)間點(diǎn)血淀粉酶水平均顯著降低(P<0.05；表2)。

表2 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血淀粉酶比較

三、血清內(nèi)毒素、I-FABP變化

ANP組、3-MA組血清內(nèi)毒素、I-FABP均隨時(shí)間延長而顯著升高(P<0.05)。與SO組相比，ANP組、3-MA組血清內(nèi)毒素、I-FABP水平均顯著升高(P<0.05)；與ANP組相比，3-MA組6 h、12 h時(shí)的血清內(nèi)毒素、I-FABP水平顯著降低(P<0.05；表3)。

表3 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清內(nèi)毒素、I-FABP比較

四、腸道組織Beclin-1表達(dá)情況

ANP組、3-MA組末端回腸組織Beclin-1表達(dá)隨時(shí)間延長而逐漸升高，且各時(shí)間點(diǎn)3-MA組Beclin-1表達(dá)均明顯低于ANP組(P<0.05；圖2)。

1 Da=0.992 1 u

討 論

近年來，SAP發(fā)病機(jī)制和治療的研究取得了不少進(jìn)展，但病死率仍很高，可達(dá)36%～50%[6]。如何從源頭上抑制SAP局部炎癥反應(yīng)的發(fā)生以及級聯(lián)炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大，是治療SAP的關(guān)鍵。

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)發(fā)病早期，胰腺腺泡細(xì)胞死亡方式是決定病情發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的關(guān)鍵。胰腺腺泡死亡方式分為壞死和凋亡兩種形式，AP病情嚴(yán)重程度與腺泡細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)，與壞死呈正相關(guān)[7-9]。SAP常伴有胰腺腺泡細(xì)胞大量壞死，導(dǎo)致胰腺局部炎癥反應(yīng)加重，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙。但既往觀點(diǎn)認(rèn)為，壞死為一種不可調(diào)控、被動(dòng)的非程序性死亡方式，廣泛參與各種病理生理過程，因其不可調(diào)控性，故未引起各研究者的重視。2005年，Degterev等[10]在研究缺血性腦損傷的細(xì)胞死亡方式時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一種可被調(diào)控的特殊類型細(xì)胞壞死方式，并將其命名為程序性壞死。即部分細(xì)胞的壞死可被一些內(nèi)外因子啟動(dòng)，通過特定的信號(hào)通路和程序發(fā)生，可對其啟動(dòng)、發(fā)生、發(fā)展進(jìn)行有目的地調(diào)控。AP早期，腺泡細(xì)胞存在程序性壞死現(xiàn)象，可能為有效調(diào)控AP病情，特別是SAP的發(fā)生、發(fā)展提供了一條潛在干預(yù)途徑。自噬作為一種程序性細(xì)胞死亡方式，已成為調(diào)控SAP病情的研究熱點(diǎn)。

自噬廣泛存在于真核生物的病理生理過程中，對維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)起有重要作用。既往研究[11]表明，生理狀態(tài)下胰腺外分泌組織中的生理性自噬高于心、肺、腎和胰腺內(nèi)分泌組織，且禁食24 h后，胰腺外分泌的生理性自噬增強(qiáng)，對胰腺外分泌組織起有保護(hù)作用。但發(fā)生AP時(shí)，小鼠腺泡細(xì)胞中的自噬體增大增多，但自噬溶酶體蛋白降解能力降低，提示AP時(shí)自噬通量可能受阻[12]。Mareninova等[13]對分離的胰腺細(xì)胞、動(dòng)物模型和人體組織的研究證實(shí)AP時(shí)自噬通量受損，胰腺腺泡內(nèi)大量異常自噬空泡堆積，異常自噬參與腺泡細(xì)胞空泡和酶原的激活，導(dǎo)致AP的發(fā)生。通過抑制SAP胰腺腺泡細(xì)胞自噬，能減輕炎癥反應(yīng)及其嚴(yán)重程度[14]。

自噬的主要形式是巨自噬。巨自噬是一個(gè)多步驟過程，始于形成自噬體。自噬體形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，觸發(fā)階段包括形成所謂的隔離膜或吞噬細(xì)胞，延伸以吞噬細(xì)胞質(zhì)的部分(包括細(xì)胞器，如線粒體)，并最終閉合以形成成熟的自噬體。該過程由一系列進(jìn)化保守的Atg基因以及脂質(zhì)激酶如Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(PI3KⅢ)控制。PI3K/Akt信號(hào)通路是調(diào)節(jié)自噬的重要途徑。Lupia等[15]的研究表明，以PI3K基因敲除小鼠建立AP模型，其炎癥反應(yīng)明顯減輕。Singh等[16]發(fā)現(xiàn)PI3K抑制劑處理過的AP模型炎癥反應(yīng)減輕，且主要是PI3KⅢ介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的加重。由此可見，自噬與AP的發(fā)生存在相互關(guān)聯(lián)的因子。

Beclin-1是酵母自噬基因Atg6/Vps30在哺乳動(dòng)物中被確認(rèn)的第一個(gè)同源類似物，位于人染色體17q21位點(diǎn)，主要通過參與組成PI3KⅢ復(fù)合體，募集含F(xiàn)YVE或PX結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，形成蛋白復(fù)合體，是自噬啟動(dòng)的關(guān)鍵蛋白之一，參與早期自噬體膜的形成，通過與Bcl-2結(jié)合來調(diào)控自噬和凋亡的發(fā)生[17-18]。Zhang等[19]采用不同劑量雨蛙素腹腔注射至雄性小鼠內(nèi)，通過免疫組化和蛋質(zhì)白印跡法發(fā)現(xiàn)，胰腺腺泡細(xì)胞Beclin-1蛋白表達(dá)明顯下降。本研究對大鼠胰膽管逆行注射牛磺膽酸鈉成功制備ANP模型后，末端回腸組織Beclin-1蛋白表達(dá)較SO組顯著降低，提示SAP中可能存在Beclin-1的消耗或其他未知因素，尚需進(jìn)一步研究。

Wan等[20]的研究結(jié)果顯示，雨蛙素+脂多糖誘導(dǎo)的ANP小鼠中腸道自噬過度激活，腸道組織存在病理損傷，且反映腸道黏膜屏障功能的蛋白包括occludin、ZO-1和claudin-4等的表達(dá)顯著降低；而加入自噬抑制劑3-MA后，腸道病理損傷恢復(fù)，腸道功能相關(guān)蛋白表達(dá)逐漸恢復(fù)。Huang等[21]對自噬與ANP大鼠腸道氧化應(yīng)激的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，不存在腸道細(xì)菌移位的ANP組與存在腸道細(xì)菌移位的ANP組均存在自噬激活，且前者的表達(dá)高于后者，ZO-1、occludin、claudin-1表達(dá)亦明顯升高。說明自噬可有效保護(hù)腸黏膜屏障免受氧自由基的傷害。本研究顯示，隨著造模時(shí)間延長，末端回腸組織中Beclin-1蛋白表達(dá)明顯升高，與病理學(xué)表現(xiàn)、血淀粉酶、血清內(nèi)毒素、I-FABP的變化一致，提示隨著AP病程延長，腸道可能存在異常自噬，且異常自噬逐漸增強(qiáng)，導(dǎo)致腸道黏膜屏障功能受損。但加入自噬抑制劑3-MA后，末端回腸組織中Beclin-1表達(dá)較ANP組明顯降低，腸道病理損傷減輕，腸道通透性改善，說明抑制自噬能有效保護(hù)SAP患者腸道黏膜屏障功能，促進(jìn)病情恢復(fù)。

目前認(rèn)為正常自噬對SAP患者有一定保護(hù)作用，但在SAP時(shí)，自噬通量受損，自噬過度激活，異常自噬會(huì)加重SAP炎癥反應(yīng)，加重病情。但對異常自噬導(dǎo)致SAP，還是SAP導(dǎo)致異常自噬的發(fā)生這一問題，目前尚無相關(guān)定論，從SAP異常自噬的上下游機(jī)制進(jìn)行研究，有助于發(fā)現(xiàn)SAP治療的新靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)加入自噬抑制劑3-MA后能減輕SAP腸道損傷，有望成為治療SAP的潛在靶點(diǎn)之一。但自噬的啟動(dòng)、自噬體的形成涉及多個(gè)關(guān)節(jié)，目前尚未明確從哪個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)才能有效控制SAP腸道屏障功能的損傷。且長期抑制自噬可能對SAP恢復(fù)階段產(chǎn)生不良影響，故不能單純刺激或抑制自噬發(fā)生，使異常自噬正?；l(fā)揮有利作用，才是SAP治療的關(guān)鍵。