代乳粉水平對羔羊血液指標(biāo)和腸道屏障功能的影響

李彥軍，牛驍麟，張千，王國秀，李發(fā)弟，，李飛，李沖，龐鑫，賈莉，樊海苗

代乳粉水平對羔羊血液指標(biāo)和腸道屏障功能的影響

李彥軍1，牛驍麟2，張千2，王國秀1，李發(fā)弟1，2，李飛2，李沖1，龐鑫1，賈莉1，樊海苗1

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，蘭州 730000）

代乳粉的合理利用對于提高羔羊健康和成活率具有重要意義，但代乳粉飼喂水平對羔羊免疫功能和腸道屏障功能的影響仍不清楚，羔羊免疫功能發(fā)育和腸道健康發(fā)育所需的最佳代乳粉飼喂水平仍無定論?！尽繌母嵫蜓簩W(xué)指標(biāo)動態(tài)變化規(guī)律、回腸和結(jié)腸組織形態(tài)、抗氧化指標(biāo)、免疫指標(biāo)以及腸道屏障功能相關(guān)基因表達(dá)量的角度分析代乳粉飼喂水平對羔羊免疫功能和腸道屏障功能的影響。選用16只初生重接近的初生湖羊公羔，隨機(jī)分成兩組，分別為對照組（CON，代乳粉每日飼喂量為羔羊體重的2%）和高飼喂水平組（H，代乳粉每日飼喂量為羔羊體重的4%）。所有羔羊從7日齡開始斷母乳飼喂代乳粉，49日齡時屠宰。代乳粉飼喂水平對羔羊白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白濃度影響不顯著（＞0.05）。21—49d羔羊淋巴細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白濃度隨日齡逐漸增加，49日齡時顯著較高（＜0.05），而中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞比49日齡時顯著較低（＜0.05）。H組羔羊回腸絨毛高度顯著高于CON組（＜0.05），回腸和結(jié)腸隱窩深度顯著低于CON組（＜0.05）?；啬c和結(jié)腸丙二醛（MDA）含量和免疫球蛋白A（IgA）含量顯著低于CON組（＜0.05）。結(jié)腸表達(dá)量顯著低于CON組（＜0.05），回腸和結(jié)腸腫瘤壞死因子（）表達(dá)量均顯著低于CON組（＜0.05）。高代乳粉飼喂水平可以降低腸道組織氧化損傷，促進(jìn)腸絨毛發(fā)育，降低腸道物理屏障損傷進(jìn)而減少腸道免疫反應(yīng)。生產(chǎn)中可以通過提高早期羔羊代乳粉飼喂水平促進(jìn)羔羊腸道健康發(fā)育。

羔羊；代乳粉；血液學(xué)指標(biāo)；腸道屏障；抗氧化

0 引言

【研究意義】在現(xiàn)代肉羊舍飼養(yǎng)殖中，由于母羊泌乳量不足、產(chǎn)羔數(shù)過多、乳房炎、母羊產(chǎn)后癱瘓等原因，羔羊人工哺乳的應(yīng)用非常廣泛。目前我國養(yǎng)羊模式正在從傳統(tǒng)的散養(yǎng)模式向現(xiàn)代化集約化規(guī)模化的方向轉(zhuǎn)型，通過人工哺乳實(shí)現(xiàn)羔羊早期斷奶，可以縮短母羊的繁殖周期，提高母羊利用效率，增加年產(chǎn)羔數(shù)，降低培育成本，從而提高肉羊飼養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。代乳料在肉羊養(yǎng)殖中的應(yīng)用加快了優(yōu)良種羊的培育，對母羊多胎多產(chǎn)和體弱母羊提高羔羊成活率都具有重要意義[1]。合理利用代乳粉飼喂早期斷奶羔羊有利于羔羊生長發(fā)育，提高羔羊抗病力，增強(qiáng)體質(zhì)，降低羔羊的發(fā)病率[2]。因此代乳粉的合理利用對于提高羔羊成活率和生產(chǎn)性能具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】適宜的營養(yǎng)水平和飼喂水平是代乳粉在羔羊生產(chǎn)中的合理應(yīng)用的關(guān)鍵。岳喜新研究了羔羊代乳粉蛋白水平對早期斷奶羔羊生長性能、消化代謝、血清生化指標(biāo)等的影響，認(rèn)為代乳粉的蛋白質(zhì)水平為25%時羔羊增重效果最好[3]。江喜春等研究認(rèn)為中等能量水平的代乳粉有利于羔羊的生長發(fā)育，代乳粉總能水平為19.0 MJ·kg-1較好[4]。但生產(chǎn)中代乳粉通常定量飼喂，而不同養(yǎng)殖場代乳粉飼喂水平差異較大，因此代乳粉飼喂水平對羔羊生長發(fā)育比營養(yǎng)水平更加重要。岳喜新等研究了代乳粉飼喂水平對早期斷奶羔羊生長發(fā)育、營養(yǎng)物質(zhì)消化代謝及血清生化指標(biāo)的影響，認(rèn)為0—50日齡羔羊的代乳粉飼喂水平為體重的2%為宜[5]。上述羔羊代乳粉適宜營養(yǎng)水平或飼喂水平的研究主要針對羔羊生產(chǎn)性能。然而有研究表明，最佳生長性能的養(yǎng)分需要量與最佳免疫系統(tǒng)和腸道健康發(fā)育的養(yǎng)分需要量可能并不相同[6]。初生動物免疫系統(tǒng)沒有完全建立，來源于母體的被動免疫提供幼齡動物的早期保護(hù)，而養(yǎng)分的攝入對于免疫系統(tǒng)的建立以及維持免疫調(diào)控和免疫反應(yīng)之間的平衡非常關(guān)鍵[6]。BALLOU 等研究發(fā)現(xiàn)高代乳粉飼喂水平增加了脂多糖（LPS）處理后犢牛抗病能力，表明提高代乳粉飼喂水平可以改善犢牛的免疫功能[7]。而JOHNSTON等報道認(rèn)為犢牛營養(yǎng)對免疫反應(yīng)的影響可以忽略不計[8]。鑒于免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性和眾多生理因素的影響，早期營養(yǎng)和飼喂方式對幼齡反芻動物免疫系統(tǒng)發(fā)育的影響仍不清楚[8-10]。同時腸道屏障是動物免疫防御系統(tǒng)中最為龐大的部分。腸道屏障是指腸道能夠防止腸內(nèi)的有害物質(zhì)如細(xì)菌和毒素穿過腸粘膜進(jìn)入人體內(nèi)其他組織、器官和血液循環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能的總和，包括腸粘膜上皮、腸粘液、腸道菌群、腸道免疫等。腸道屏障功能的建立對幼齡動物非常重要。有研究表明，斷奶應(yīng)激會影響羔羊、犢牛和仔豬的腸道屏障功能，這是斷奶導(dǎo)致幼齡動物健康問題的主要原因之一[11-14]。然而代乳粉飼喂水平影響羔羊免疫功能和腸道屏障功能的研究鮮有報道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】幼齡動物免疫功能和腸道屏障功能發(fā)育非常重要，養(yǎng)分的攝入對于免疫系統(tǒng)的建立以及維持免疫調(diào)控和免疫反應(yīng)之間的平衡非常關(guān)鍵，但最佳生長性能的養(yǎng)分需要量與最佳免疫系統(tǒng)和腸道健康發(fā)育的養(yǎng)分需要量可能并不相同。提高代乳粉飼喂水平有可能促進(jìn)羔羊免疫功能，但腸道健康發(fā)育所需的最適養(yǎng)分需要量和最佳代乳粉飼喂水平仍無定論?！緮M解決的關(guān)鍵問題】首先通過研究代乳粉飼喂水平對羔羊血液學(xué)指標(biāo)動態(tài)變化規(guī)律的影響來分析系統(tǒng)免疫發(fā)育規(guī)律，進(jìn)而從羔羊腸道組織形態(tài)、抗氧化指標(biāo)、免疫指標(biāo)和腸道屏障功能相關(guān)基因表達(dá)量等方面分析代乳粉飼喂水平對羔羊腸道屏障功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計和試驗(yàn)動物飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)動物選自民勤中天羊業(yè)有限公司，按照初生重接近原則，選用16只初生重接近的初生湖羊公羔，隨機(jī)均分為2組，分別為對照組（CON，初生重3.37±0.77kg）和高代乳粉飼喂水平組（H，初生重3.39±0.79kg），CON組代乳粉每日飼喂量（干物質(zhì)）為羔羊體重的2%，H組每日代乳粉飼喂量（干物質(zhì)）為羔羊體重的4%。所有羔羊從3日齡開始訓(xùn)練飼喂代乳粉，7日齡完全用代乳粉替代母乳，并開始補(bǔ)飼開食料。代乳粉由北京精準(zhǔn)動物營養(yǎng)研究中心生產(chǎn)，含23%蛋白質(zhì)和12%脂肪。代乳粉溶解于5倍重量的溫水，每天用奶瓶分3次人工飼喂（09:00, 15:00 和21:00）。所有羔羊均單籠飼養(yǎng)，自由采食開食料，自由飲水。開食料參考肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NYT816-2004）配制，配方及營養(yǎng)成分見表1。

表1 開食料配方及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

預(yù)混料為每kg開食料提供：25 mg Fe（FeSO4×H2O），40 mg Zn（ZnSO4×H2O），8 mg Cu（CuSO4×5H2O），40 mg Mn（MnSO4×H2O），0.3 mg I（KI），0.2 mg Se（Na2SeO3），0.1 mg Co（CoCl2），940 IU vitamin A; 111 IU vitamin D; 20 IU vitamin E, and; 0.02 mg vitamin B12

Premix provided the following per kg of the starter: 25 mg Fe as FeSO4×H2O; 40 mg Zn as ZnSO4×H2O; 8 mg Cu as CuSO4×5H2O; 40 mg Mn as MnSO4×H2O; 0.3 mg I as KI; 0.2 mg Se as Na2SeO3; 0.1 mg Co as CoCl2; 940 IU vitamin A;111 IU vitamin D;20 IU vitamin E, and; 0.02 mg vitamin B12

1.2 樣品采集

分別于21、28、35、42和49日齡，在早晨飼喂之前通過頸靜脈穿刺采集羔羊血液樣品。每次都由同一位經(jīng)驗(yàn)豐富的操作員抽取血液，收集到5mL K2-乙二胺四乙酸（K2EDTA）抗凝采血管中，用于血常規(guī)指標(biāo)分析。

羔羊于49日齡采用頸靜脈放血法屠宰。羔羊屠宰后立即采集回腸中段和結(jié)腸中段（結(jié)腸袢圓心處）組織樣品，在液氮中快速冷凍并儲存在-80℃下用于抗氧化指標(biāo)和免疫指標(biāo)測定，以及腸道組織總RNA提取。同時采集回腸中段和結(jié)腸中段樣品，固定在4％多聚甲醛中用于組織形態(tài)學(xué)分析。

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1 羔羊血液學(xué)指標(biāo)動態(tài)變化規(guī)律 使用血液分析儀（PROKAN PE6800，Prokan Electronics Inc，中國深圳）分析采集到5mL K2-乙二胺四乙酸（K2EDTA）抗凝采血管中的血液樣品總白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、中間細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白的濃度。

1.3.2 腸道組織形態(tài) 將4%多聚甲醛固定的回腸和結(jié)腸腸道組織樣品包埋在石蠟中切片（5μm），采用H.E（蘇木精-伊紅）染色。采用光學(xué)顯微鏡觀察切片，在每個切片中隨機(jī)選擇12個完整的腸絨毛，使用圖像分析系統(tǒng)確定絨毛高度、絨毛寬度、隱窩深度和肌層厚度。

1.3.3 腸道組織抗氧化指標(biāo)和免疫指標(biāo)分析 將采集的回腸和結(jié)腸組織樣品在液氮中研磨后加入預(yù)冷的1×PBS緩沖液，充分勻漿后3 000r/min低溫離心10min取上清，制成10%組織提取液。使用總SOD（超氧化物歧化酶）、GSH-Px（谷胱甘肽過氧化氫酶）、MDA（丙二醛）、IgA（免疫球蛋白A）測定試劑盒（中國南京建成生物工程研究所），通過自動酶標(biāo)儀（Thermo Scientific，Wilmington，USA）測定總SOD、GSH-Px活性和MDA、IgA濃度。

1.3.4 腸道組織屏障功能相關(guān)基因表達(dá) 使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（Takara, Kusatsu, Japan）提取回腸組織和結(jié)腸組織總RNA，并使用Transcript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒（TransGen Biotech，Beijing，China）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Primer 5.0軟件（PREMIER Biosoft International，Palo Alto，CA）設(shè)計腸道緊密連接蛋白（和）、Toll樣受體-4（）和腫瘤壞死因子-α（）基因引物，并通過將擴(kuò)增片段連接到T載體克隆后提取質(zhì)粒梯度稀釋的方法驗(yàn)證引物特異性和擴(kuò)增效率（表2）。通過Roche LightCycler 480 II熒光定量PCR儀（Roche Diagnostics，Mannheim，Germany）分析基因表達(dá)水平。PCR程序?yàn)椋?5℃30s；然后進(jìn)行40個循環(huán)：95℃5秒，55℃30秒，72℃30秒。采用β-Actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[15]。

表2 熒光定量PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel處理后，用SPSS19.0統(tǒng)計軟件一般線性模型對血液學(xué)指標(biāo)進(jìn)行雙因素方差分析，分析代乳粉飼喂水平和日齡及交互作用對各項(xiàng)指標(biāo)的影響；采用ANOVA過程分析各組不同日齡間血液學(xué)指標(biāo)差異，采用LSD法進(jìn)行多重比較；采用t檢驗(yàn)分析兩組間腸道組織形態(tài)、抗氧化和免疫指標(biāo)以及基因表達(dá)水平差異顯著性。＜0.05為差異顯著，＞0.05則差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 代乳粉飼喂水平對羔羊血液學(xué)指標(biāo)動態(tài)變化規(guī)律的影響

代乳粉飼喂水平以及代乳粉飼喂水平和日齡的交互作用對羔羊21—49 d白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞數(shù)以及血紅蛋白濃度均無顯著影響（表3，＞0.05）。日齡對羔羊淋巴細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白濃度有顯著影響（＜0.05）。CON組和H組羔羊49d淋巴細(xì)胞數(shù)均顯著高于21和28d（＜0.05）；H組49d中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞顯著低于21和28d（＜0.05）；CON組49d紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白濃度均顯著高于28和35d（＜0.05），H組49d紅細(xì)胞數(shù)顯著高于其它日齡而血紅蛋白濃度顯著高于28d（＜0.05）。

2.2 代乳粉飼喂水平對羔羊腸道組織形態(tài)的影響

代乳粉飼喂水平對49日齡羔羊回腸絨毛高度、隱窩深度以及結(jié)腸隱窩深度有顯著影響（表4），H組回腸絨毛高度顯著高于CON組（＜0.05），回腸和結(jié)腸隱窩深度顯著低于CON組（＜0.05）。代乳粉飼喂水平對羔羊回腸和結(jié)腸絨毛寬度和肌層厚度均無顯著影響（＞0.05）。

表3 代乳粉飼喂水平對羔羊血液學(xué)指標(biāo)動態(tài)變化規(guī)律的影響

同行數(shù)據(jù)標(biāo)不同小寫字母表示兩兩之間差異顯著 (＜0.05)，標(biāo)相同字母表示差異不顯著 (＞0.05)。下同

Different lowercase letters in row represent significant differences (＜0.05), same lowercase letters in row represent no significant differences (＞0.05). The same as below

表4 代乳粉飼喂水平對羔羊腸道組織形態(tài)的影響

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。下同

Results are expressed as mean ± standard deviation. The same as below

2.3 代乳粉飼喂水平對羔羊腸道組織抗氧化指標(biāo)和免疫指標(biāo)的影響

代乳粉飼喂水平顯著影響了回腸和結(jié)腸組織MDA含量和IgA含量（表5），H組羔羊回腸和結(jié)腸MDA含量和IgA含量均顯著低于CON組（＜0.05）。代乳粉飼喂水平對回腸和結(jié)腸GSH-Px活性和SOD活性均無顯著影響（＞0.05）。

2.4 代乳粉飼喂水平對羔羊腸道屏障功能相關(guān)基因表達(dá)的影響

代乳粉飼喂水平對羔羊回腸和結(jié)腸和表達(dá)量無顯著影響（圖1，＞0.05）。H組羔羊結(jié)腸表達(dá)量顯著低于CON組（＜0.05），但回腸表達(dá)量兩組間無顯著差異（＞0.05）。H組回腸和結(jié)腸表達(dá)量均顯著低于CON組（＜0.05）。

表5 代乳粉飼喂水平對羔羊腸道組織抗氧化指標(biāo)和免疫指標(biāo)的影響

圖1 代乳粉飼喂水平對羔羊腸道屏障功能相關(guān)基因表達(dá)的影響

Fig. 1 Effect of milk replacer feeding level on the expression of intestinal barrier function-related genes in lambs

3 討論

產(chǎn)生羔羊免疫功能尤其是適應(yīng)性免疫功能發(fā)育不完善，養(yǎng)分?jǐn)z入水平對于免疫系統(tǒng)的建立以及維持免疫調(diào)控和免疫反應(yīng)之間的平衡非常關(guān)鍵。由于動物有根據(jù)能量需要量調(diào)節(jié)采食量的調(diào)節(jié)機(jī)制，在自由采食開食料的條件下，本試驗(yàn)高代乳粉飼喂水平組羔羊開食料干物質(zhì)日均采食量（98.82±38.22 g·d-1）顯著低于對照組（168.00±69.33 g·d-1）（＜0.05），但總干物質(zhì)日均采食量（371.43±50.97 g·d-1）與對照組（304.31±69.33 g·d-1）無顯著差異（＞0.05）。在兩組羔羊總干物質(zhì)采食量無顯著差異的條件下，本試驗(yàn)從系統(tǒng)免疫功能出發(fā)首先研究了代乳粉飼喂水平對羔羊血液學(xué)指標(biāo)動態(tài)變化規(guī)律的影響，進(jìn)而針對腸道屏障功能分析了代乳粉飼喂水平對腸道組織形態(tài)、抗氧化指標(biāo)、免疫指標(biāo)和腸道屏障功能相關(guān)基因表達(dá)的影響。

血液白細(xì)胞具有產(chǎn)生抗體的作用、機(jī)體損傷的治愈能力、抵御病原體入侵的能力、對疾病的免疫抵抗力等功能。其中特異性炎癥反應(yīng)條件下淋巴細(xì)胞數(shù)量升高，而非特異性炎癥反應(yīng)會造成外周血細(xì)胞水平改變，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞數(shù)量升高、淋巴細(xì)胞數(shù)量降低以及中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞比升高[16]。同時有研究表明應(yīng)激條件下中性粒細(xì)胞數(shù)量會顯著升高[17]。本試驗(yàn)代乳粉飼喂水平對白細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞數(shù)量和中性粒細(xì)胞數(shù)量以及中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞比均無顯著影響。盡管有研究表明，養(yǎng)分的攝入對調(diào)控免疫系統(tǒng)功能非常重要，養(yǎng)分缺乏或過量攝入都會對免疫功能和病原易感性產(chǎn)生不利影響[6]，但本試驗(yàn)結(jié)果表明，體重2%的代乳粉飼喂量已經(jīng)能夠滿足羔羊系統(tǒng)免疫發(fā)育需要，且4%的代乳粉飼喂量也不會過量并產(chǎn)生不良影響。JOHNSTON的研究也表明斷奶犢牛的營養(yǎng)對免疫反應(yīng)的影響很小[8]。本試驗(yàn)21—49d羔羊淋巴細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白濃度隨日齡逐漸增加，49日齡時顯著較高，而中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞比49日齡時顯著較低。由于淋巴細(xì)胞與適應(yīng)性免疫功能關(guān)系密切，而早期羔羊缺乏發(fā)達(dá)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，本試驗(yàn)結(jié)果表明49日齡前羔羊適應(yīng)性免疫功能仍在不斷發(fā)育過程中。

白細(xì)胞源于中樞免疫器官，分化發(fā)育后經(jīng)過血液進(jìn)入腸道組織，進(jìn)而通過淋巴、血液進(jìn)行再循環(huán)，系統(tǒng)免疫功能與腸粘膜免疫功能關(guān)系密切。盡管本試驗(yàn)代乳粉飼喂水平對血液中各種白細(xì)胞數(shù)量均沒有產(chǎn)生顯著影響，但我們發(fā)現(xiàn)代乳粉飼喂水平顯著影響了腸道屏障功能。腸道屏障是指腸道能夠防止腸內(nèi)的有害物質(zhì)如細(xì)菌和毒素穿過腸粘膜進(jìn)入體內(nèi)其他組織、器官和血液循環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能的總和，包括腸粘膜上皮、腸粘液、腸道菌群、腸道免疫等。首先，代乳粉飼喂水平影響了羔羊回腸和結(jié)腸組織形態(tài)，高飼喂水平組回腸絨毛高度顯著高于對照組，回腸和結(jié)腸隱窩深度顯著低于對照組。覆蓋于小腸表面上的上皮細(xì)胞層構(gòu)成了腸道的物理屏障。腸上皮細(xì)胞快速和持續(xù)的更新動力依賴于隱窩處的Lgr5陽性（Lgr5+）特異標(biāo)記的底部柱狀細(xì)胞（crypt base columnar cell，CBC細(xì)胞），CBC細(xì)胞分裂增殖后產(chǎn)生的子代細(xì)胞繼續(xù)分化為“短暫擴(kuò)增細(xì)胞”（transit amplifying cell，TA細(xì)胞）并繼續(xù)向上遷移分化[18]。如果腸上皮細(xì)胞的損傷增加，更新不及時，腸絨毛高度就會降低。腸干細(xì)胞位于隱窩基底部，不斷增殖分化，并離開隱窩，移動至絨毛來替代損傷的腸上皮細(xì)胞，隱窩加深則表明腸干細(xì)胞在頻繁增殖分化，這也是腸上皮細(xì)胞受損的標(biāo)志[19]。有研究表明斷奶應(yīng)激會導(dǎo)致仔豬腸粘膜損傷，其典型特征主要表現(xiàn)為腸絨毛高度降低和隱窩深度增加[12-13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明高代乳粉飼喂水平條件下，羔羊腸絨毛發(fā)育較好，且腸粘膜不易受到損傷。

腸粘膜損傷的機(jī)制有可能是氧化損傷或免疫反應(yīng)增加。有研究表明應(yīng)激條件下仔豬氧自由基產(chǎn)生增多，抗氧化能力下降，同時也表現(xiàn)出腸道粘膜絨毛高度下降，隱窩加深和消化酶活性下降[13,20]。也有研究通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)斷奶影響了RIG樣受體和NOD樣受體通路，同時斷奶主要激活了干擾素和胱門蛋白酶家族基因，從而認(rèn)為斷奶激活了免疫和炎癥反應(yīng)，是導(dǎo)致小腸粘膜損傷的主要原因[21]。本試驗(yàn)進(jìn)而分析了腸道抗氧化性能和腸道粘膜免疫中的優(yōu)勢性抗體IgA含量。試驗(yàn)結(jié)果表明，盡管代乳粉飼喂水平對腸道組織SOD和GSH-Px活力的影響不顯著，但高代乳粉飼喂水平顯著降低了回腸和結(jié)腸組織MDA含量。通常認(rèn)為，氧化損傷是活性氧自由基的產(chǎn)生與機(jī)體清除體內(nèi)氧自由基的能力失衡所導(dǎo)致的[22-23]，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如MDA，使細(xì)胞膜的流動性和通透性發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變，會導(dǎo)致不可修復(fù)細(xì)胞死亡。MDA是脂質(zhì)過氧化，也是細(xì)胞氧化損傷的一個重要檢測指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，高代乳粉飼喂水平可以顯著降低腸道組織氧化損傷。同時本試驗(yàn)高代乳粉飼喂水平組羔羊腸道IgA含量顯著較低。腸道粘膜固有層中分布有大量分泌IgA的漿細(xì)胞，每日產(chǎn)生的IgA數(shù)量達(dá)3—4g，遠(yuǎn)超其他類別的抗體，因此IgA是粘膜免疫系統(tǒng)中的優(yōu)勢抗體。腸道IgA可以抑制微生物粘附，中和微生物產(chǎn)生的毒素或酶，還能對進(jìn)入上皮細(xì)胞間及固有層的細(xì)胞LPS（脂多糖）和病毒發(fā)揮中和作用。由于相當(dāng)一部分IgA的產(chǎn)生依賴于微生物成分活化的固有免疫系統(tǒng)，因此高代乳粉飼喂水平組腸道IgA濃度較低的原因可能是由于相對于對照組腸粘膜損傷程度較低，共生微生物與入侵微生物數(shù)量較少。

高代乳粉飼喂水平組羔羊腸絨毛發(fā)育較好損傷程度較低的原因可能是氧化損傷以及免疫反應(yīng)較低。筆者進(jìn)一步分析了與腸粘膜機(jī)械屏障有關(guān)的緊密連接蛋白基因的表達(dá)量，以及主要的細(xì)菌模式識別受體和細(xì)胞因子的表達(dá)量。研究結(jié)果表明，代乳粉飼喂水平對和這兩種緊密連接蛋白基因表達(dá)量以及表達(dá)量沒有顯著影響，但高代乳粉飼喂水平組和表達(dá)量顯著低于對照組。是主要的腸道上皮細(xì)胞的緊密連接蛋白，是決定腸粘膜通透性和物理屏障功能的關(guān)鍵性因素。一旦其發(fā)生變異、減少或缺失可引起腸上皮細(xì)胞之間的通透性增加，導(dǎo)致病原侵入，因此緊密連接蛋白基因表達(dá)量是衡量腸上皮屏障功能的重要指標(biāo)[24]。有研究表明，腸絨毛受損時，腸道上皮細(xì)胞分化增加以補(bǔ)充受損的細(xì)胞，緊密連接蛋白的表達(dá)量有可能會相應(yīng)增加[11]，本試驗(yàn)對照組羔羊腸道隱窩深度顯著較高，同時表達(dá)量較高，與上述研究結(jié)果相一致，證明了對照組腸粘膜損傷程度較高。細(xì)菌入侵后，Toll樣受體作為主要的細(xì)菌分子模式識別受體可以識別特定微生物分子成分，進(jìn)而啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生。本試驗(yàn)代乳粉飼喂水平對羔羊腸道表達(dá)量沒有顯著影響，但高代乳粉飼喂水平組回腸表達(dá)量顯著較低，該結(jié)果與腸道IgA濃度相一致，均表明高代乳粉飼喂水平組羔羊腸道免疫反應(yīng)程度較低。綜合血液學(xué)指標(biāo)、腸道組織形態(tài)、抗氧化和免疫指標(biāo)以及腸道屏障功能相關(guān)基因表達(dá)水平可以看出，低代乳粉飼喂水平條件下腸粘膜損傷的原因可能是氧化損傷導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞死亡，同時腸上皮細(xì)胞分化增加，而腸道緊密連接和物理屏障的損傷增加了病原侵入的風(fēng)險，進(jìn)而導(dǎo)致腸道免疫反應(yīng)增加。本試驗(yàn)結(jié)果提示在生產(chǎn)中可以通過提高早期羔羊代乳粉飼喂水平促進(jìn)羔羊腸道健康發(fā)育，但腸道健康發(fā)育所需的最適養(yǎng)分需要量和最佳代乳粉飼喂水平仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

代乳粉飼喂水平對羔羊血液學(xué)指標(biāo)無顯著影響，但高代乳粉飼喂水平可以促進(jìn)腸絨毛發(fā)育，降低隱窩深度，降低回腸和結(jié)腸組織MDA含量，并且減少腸道免疫反應(yīng)。生產(chǎn)中可以通過提高早期羔羊代乳粉飼喂水平促進(jìn)羔羊腸道健康發(fā)育。

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Effects of Milk Replacer Feeding Level on Hematology Index and Gut Barrier Function in Lambs

LI YanJun1, NIU XiaoLin2, ZHANG Qian2, WANG GuoXiu1, LI FaDi1，2, LI Fei2, LI Chong1, PANG Xin1, JIA Li1, FAN HaiMiao1

(1College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070;2College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730000)

【】The application of milk replacer powder has important significance for improving the health and survival rate of lambs. However, the effects of milk replacer feeding levels on immune function and intestinal barrier function of lambs were still unclear. The optimal level of milk replacer for development of immune function and intestinal health is still inconclusive.【】 The objective of this experiment was to analyze the effects of the milk replacer feeding level on the immune function and intestinal barrier function of lambs through the dynamic of hematological indicators, the morphology of ileum and colon, antioxidant index, immune index and expression of intestinal barrier function related genes.【】16 newborn lambs were randomly divided into two groups: the control group (CON, milk replacer feeding level was 2% of average body weight) and the intensive feeding group (H, milk replacer feeding level was 4% of their average body weight). All lambs were fed milk replacer from the 7th day of age and were slaughtered at 49 days of age. 【】The results showed that the milk replacer feeding level had no significant effects on leukocyte count, lymphocyte count, neutrophil count, red blood cell count and hemoglobin concentration (＞0.05). The number of lymphocytes, red blood cells and hemoglobin in the 21-49d lambs increased gradually with age, significantly higher at 49 days of age (＜0.05), while neutrophil lymphocytes were significantly lower than at 49 days (＜0.05). The ileal villus height of the H group was significantly higher than that of the CON group (＜0.05), the ileum and colon crypt depth was significantly lower than that of the CON group (＜0.05), the ileal and colonic malondialdehyde (MDA) content and immunoglobulin A (The content of IgA) was significantly lower than that of CON group (＜0.05). The expression of Claudin4 in colon was significantly lower than that in CON group (＜0.05), and the expression of tumor necrosis factor (TNF-α) in ileum and colon was significantly lower than that in CON group (＜0.05). 【】The intensive milk replacer feeding could reduce intestinal oxidative damage, promote intestinal villus development, reduce intestinal physical barrier damage and reduce intestinal immune response. In the sheep production, an intensive milk replacer-feeding program benefits to the healthy intestinal development.

lamb; milk replacer; hematological index; intestinal barrier; antioxidant

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.02.015

2019-07-08；

2019-08-23

國家自然科學(xué)基金（31660670）、甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)盛彤笙科技創(chuàng)新基金（GSAU-STS-1620）、甘肅省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（201710733021）

李彥軍，Tel：18893721015；E-mail：1963771334@qq.com。通信作者李沖，E-mail：lichong@gsau.edu.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）