不同溫度LED光萎凋?qū)﹁F觀音MEP上游關(guān)鍵基因和香氣的影響

游芳寧，鄧慧莉，胡娟，姚知靈，武帥強，秦藝嘉，湯銅華，孫云

不同溫度LED光萎凋?qū)﹁F觀音MEP上游關(guān)鍵基因和香氣的影響

游芳寧1，鄧慧莉1，胡娟1，姚知靈1，武帥強1，秦藝嘉1，湯銅華2，孫云1

（1福建農(nóng)林大學園藝學院/茶學福建省高等學校重點實驗室，福州 350002；2上杭縣蛟潭高山茶業(yè)發(fā)展有限公司，福建龍巖 364000）

【】萜類化合物是烏龍茶揮發(fā)性芳香物質(zhì)的重要組分，2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸途徑（MEP）上游關(guān)鍵基因直接參與調(diào)控萜類化合物前體物質(zhì)的合成。而烏龍茶香氣的形成與萎凋工序密切相關(guān)，光照和溫度是影響萎凋的重要因子，探討LED光與溫度在烏龍茶萎凋過程中對香氣的影響，為提高烏龍茶萎凋葉香氣品質(zhì)提供參考?；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，根據(jù)KEGG篩選出響應(yīng)光照的MEP上游關(guān)鍵基因（、、、）。對一芽三葉鐵觀音鮮葉進行LED白光和不同溫度（20℃（L20）、25℃（L25）、30℃（L30）、35℃（L35）和40℃（L40））萎凋處理，黑暗下溫度（20℃（D20）、25℃（D25）、30℃（D30）、35℃（D35）和40℃（D40））萎凋處理；分別測定鐵觀音萎凋葉的香氣組分和MEP上游關(guān)鍵基因的相對表達量。L30處理萎凋葉各基因表達量達到最大值，萜類基因（、、、）表達量分別為XY組（對照）的4.31、5.28、11.77、1.59倍，為D30處理的2.24、2.39、1.86和1.60倍。D30組各基因表達量為黑暗處理組最大，依次為XY組的1.92、2.21、6.34和0.99倍。L20處理萎凋葉的-法呢烯芳樟醇氧化物（I、II）含量最高，較XY依次提高了15.05%、4.92%和15.13%；L30處理萎凋葉的橙花叔醇、芳樟醇和香葉醇含量最高，較XY組依次提高了3.71%、6.14%和15.28%；LED組鐵觀音萎凋葉主要香氣組分含量均高于相對應(yīng)的溫度處理組。通過主成分分析法建立數(shù)學模型，對萎凋葉香氣組分進行評估，得出L20組萎凋葉得分最高，L30組萎凋葉次之；與香氣分析得出結(jié)果一致。鐵觀音萎凋葉基因表達量與香氣含量的變化趨勢不存在同步性；L30處理萎凋葉基因表達量、主要萜類香氣物質(zhì)含量和主成分分析得分均較高，這與鐵觀音生產(chǎn)上的萎凋溫度相一致。萎凋溫度過高（40℃）不利于萎凋葉萜類關(guān)鍵基因的表達和萜類化合物的形成。

鐵觀音；萎凋；LED；溫度；香氣；；；；；萜類化合物

0 引言

【研究意義】萜類化合物是烏龍茶揮發(fā)性芳香物質(zhì)的重要組分，芳香物質(zhì)主要通過2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸途徑（MEP）上游關(guān)鍵基因（、、、）直接參與調(diào)控合成。1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（）和脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（）是MEP途徑的第一、第二個限速酶，調(diào)控單萜、雙萜類香氣化合物以及類胡蘿卜素等重要物質(zhì)的合成，研究表明UV-B[1]、日光[2]和蟲害[3]等均等促進的相對表達量。4-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸合酶（）和4-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸還原酶（）是MEP途徑的最后一步反應(yīng)所需要的酶，能催化1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基?4-二磷酸HMBPP 轉(zhuǎn)化為異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）的混合物，其表達量的變化直接影響萜類代謝物的產(chǎn)量[1,4]。光照是一種重要的植物外源調(diào)控因子，與茶鮮葉和萎凋葉內(nèi)香氣成分的生物合成有重要關(guān)聯(lián)[5-7]。鐵觀音有“七泡有余香”之譽，其馥郁的蘭花香與萎凋工序密切相關(guān)。因此，以鐵觀音為試驗材料開展不同溫度LED光萎凋研究，探明溫度與光對萎凋葉萜類上游關(guān)鍵基因表達量和香氣含量的影響，對于提高烏龍茶萎凋葉香氣含量具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】研究表明，鐵觀音日光萎凋的時間過長或過短，均會導(dǎo)致毛茶花果香味不明顯，夾帶雜味[8]。Fu等[9]研究發(fā)現(xiàn)短時（3 d）LED補光栽培‘金萱’品種鮮葉的萜類化合物含量比長時處理（14 d）高；陳壽松等[10-11]對鐵觀音萎凋和搖青過程進行補光試驗，得出經(jīng)LED處理后，毛茶中的橙花叔醇和-法呢烯等主要呈香物質(zhì)含量較全程無光顯著提升；可見光照對烏龍茶萜類化合物的形成具有顯著調(diào)控作用。目前，前人大多把光和溫度作為統(tǒng)一的外在脅迫因子來研究其對茶葉生理生化的影響[12-14]?！颈狙芯壳腥朦c】溫度對萎凋工序的影響至關(guān)重要，溫度過高過低均影響茶葉的香氣品質(zhì)。在茶葉萎凋過程中，尚未見到將光照系統(tǒng)區(qū)分為光與溫度兩個影響因子的報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用自主研制的烏龍茶調(diào)溫排濕LED光補償萎凋裝置（Oolong tea LED withering equipment，OLW），簡稱“LED光萎凋裝置”[10]，系統(tǒng)研究不同光和溫度對烏龍茶香氣組分的影響。由于LED是冷光源，光譜中不存在紫外線和紅外線，因此不具有熱量和輻射，與溫度共同試驗處理研究，更為貼近生產(chǎn)實際?；谶@一原理，從筆者課題組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出響應(yīng)光照的萜類上游關(guān)鍵基因（、、、），以鐵觀音為供試材料，設(shè)計不同LED加溫度的萎凋處理試驗，分別測定各鐵觀音萎凋葉的香氣組分和MEP上游關(guān)鍵基因的相對表達量。結(jié)合分子和代謝水平研究，綜合評價和總結(jié)不同溫度和LED光萎凋處理對烏龍茶香氣品質(zhì)形成的工藝特點及變化規(guī)律，為烏龍茶人工光源萎凋提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和設(shè)備

1.1.1 試驗材料 品種為鐵觀音，2018年5月采摘一芽三葉鐵觀音鮮葉，經(jīng)3次重復(fù)測定，鮮葉含水率為（74.2±1.0）%。

1.1.2 試驗裝置 自主研制的烏龍茶調(diào)溫排濕LED光補償萎凋裝置。主要由箱體、LED燈源、增濕裝置等構(gòu)成，箱體四壁安裝勻光板，以消除光邊界效應(yīng)，控制各點光強在（400±10）μmol?m-2·s-1；熱泵機組春季制熱夏季制冷，控制萎凋溫度（20—50℃）；排濕風扇和氣流循環(huán)通道及時排除萎凋過程的水蒸汽。

1.1.3 試驗儀器 Agilent 6890N-5975B氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；BAS124S型電子天平（精度0.0001 g），梅特勒-托利多儀器有限公司；Allegra 64R臺式高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特有限公公司；Agilent 6890N-5975B氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；IMS-70全自動雪花制冰機，上海聲裕生物科技有限公司；超微量分光光度計（Thermo Electron corp.USA）；羅氏LightCycler480，天津津立儀器設(shè)備科技發(fā)展有限公司（天津），熒光共聚焦顯微鏡FV1000，OLYMPUS公司；LED白光燈源，深圳拓邦股份有限公司；其他常規(guī)檢測儀器等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗方案設(shè)計 設(shè)計LED與溫度共同作用和單獨溫度作用的萎凋處理，以鮮葉為對照，其中Dark組處理為黑暗條件處理，詳情見表1。LED光萎凋裝置參數(shù)：光照強度（400±5）μmol?m-2·s-1，相對濕度（60±2）%；LED距萎凋葉15 cm，攤?cè)~厚度10 mm；取樣時，萎凋葉含水率經(jīng)3次重復(fù)測定，為（68.4±1.3）%。

表1 不同溫度LED光萎凋條件下鐵觀音的處理方法

1.2.2 樣品取樣方法 鐵觀音鮮葉和各處理萎凋葉分別取30 g，稱樣結(jié)束立刻用液氮冷凍固樣，后置于-80℃超低溫保存箱凍存。主要用于總RNA提取，qRT-PCR及香氣測定。

1.2.3 測定項目與方法

1.2.3.1 茶樹總RNA的提取及cDNA的合成方法 試驗使用天根多糖多酚植物試劑盒，參考說明書操作步驟提取茶樹總RNA，通過超微量分光光度計測定RNA濃度及OD值,最后采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。按照TaKaRa的PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA，用于后續(xù)的qRT-PCR測定。

1.2.3.2 萜類上游關(guān)鍵基因?qū)崟r熒光定量PCR分析 根據(jù)、、和全長cDNA序列設(shè)計實時熒光定量PCR特異性引物，詳見表2，采用TaKaRa公司提供的SYBR Ex-ScriptTM試劑盒，按照說明書進行試驗操作，具體情況參照Lin和Lai[15]的操作步驟，以20 μL反應(yīng)體系進行qRT-PCR測定，采用為內(nèi)參基因，通過羅氏Light cyclers480熒光定量PCR儀，采用qRT-PCR檢測鐵觀音鮮葉的、、和在不同溫度和光照萎凋處理下的表達情況。采用2-ΔΔCt方法對試驗數(shù)據(jù)進行計算分析。

表2 引物序列

1.2.3.3 HS-SPME-GC-MS香氣組分測定 采用頂空固相微萃取HS-SPME提取香氣，稱取10.0 g磨碎茶樣加入2 mg?mL-1癸酸乙酯（內(nèi)標）25 μL，100 mL沸騰蒸餾水，放于磁力攪拌器上（轉(zhuǎn)速450 r/min），在50℃干燥箱中平衡5 min后再吸附40 min，最后在GC-MS進樣口于230℃下解析5 min。GC-MS條件：色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm ID×0.25 μm膜厚）；載氣為高純氮氣，99.999%；進樣口溫度：230℃；脈沖不分流，進樣1 μL，柱流速：1 mL?min-1；色譜-質(zhì)譜接口溫度：250℃。離子源溫度：230℃；離子化學式：EI；電子能量：70 eV；程序升溫參數(shù)：50℃保持2 min，以5 ℃?min-1升至180℃，保持2 min，再以10 ℃?min-1升到230℃，保持5 min，最后進行NIST數(shù)據(jù)庫匹配質(zhì)譜定性和峰面積歸一法相對定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel和SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，單因素方差（one-way ANOVA）和Duncan’s test、LSD顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 不同溫度LED光萎凋?qū)EP途徑上游關(guān)鍵基因表達量的影響

2.1.1和相對表達量 如圖1所示，經(jīng)LED光照萎凋后，各溫度處理萎凋葉和相對表達量均有所提高；其中LED組（L20、L25、L30、L35、L40）萎凋葉表達量分別是無光處理溫度組（D20、D25、D30、D35、D40）的1.61、1.82、2.24、1.29和0.96倍；L30和D30分別為LED組和黑暗組的最大值，表達量為4.31和1.92；各處理萎凋葉相對表達量變化趨勢和基本一致，經(jīng)光照處理萎凋葉含量依次為無光處理的3.81、4.04、2.39、1.74和4.97倍；其中L30和D30含量分別為5.28和2.21，為各自處理組的最大值。結(jié)果表明，光照可以大幅度增加和的相對表達量，兩基因的最適表達溫度為30℃，且光照對表達量的提升更顯著。

圖1 DXS和DXR在不同溫度LED光萎凋過程中的相對表達量

2.1.2和相對表達量 不同處理萎凋葉和相對表達量如圖2所示。經(jīng)LED光照處理后，LED組萎凋葉表達量依次是Dark組的1.51、1.40、1.86、1.33和1.13倍；LED組表達量按序依次是Dark組的3.03、3.00、1.60、1.65和5.22倍；無論是還是的表達量均在30℃處理時達到最大值，其中L30的和表達量為11.77和1.59，D30的和表達量為6.34和0.99。結(jié)果證明，光照和溫度對和的表達均有調(diào)控作用，光能大幅度提高兩基因的表達量，30℃是其最適表達溫度。

圖2 HDS和HDR在不同溫度LED光萎凋過程中的相對含量

2.2 不同溫度LED光萎凋?qū)﹁F觀音萎凋葉香氣的影響

烏龍茶感官審評中，香氣占35%的權(quán)重，是評判烏龍茶品質(zhì)的重要因子之一[6-18]。經(jīng)HS-SPME結(jié)合GC-MS對不同溫度處理的鐵觀音萎凋葉進行香氣組分檢測（表3）可知，鮮葉（對照）和10個處理測出的相對含量最高的前10位香氣組分分別為：芳樟醇氧化物II（0.06%—15.19%）、-法呢烯（0.08%—15.13%）、香葉醇（2.38%—17.66%）乙酸葉醇酯（2.32%—15.18%）、芳樟醇（4.32%—10.46%）、芳樟醇氧化物I（2.33%—7.25%）、順式-己酸-3-己烯酯（0.12%—7.05%）、苯乙醇（0.48%—3.57%）、橙花叔醇（0.33%—4.04%）和脫氫芳樟醇（0.95%—4.11%）。本研究篩選出相對含量前25的香氣組分（除對照外，各萎凋葉香氣組分含量均大于0.1%），差異性分析得出，與鐵觀音毛茶不同，毛茶中的橙花叔醇、α-法呢烯和吲哚的相對含量占極大比重[19-21]，在萎凋葉中，萜類化合物中的芳樟醇（鈴蘭香）、芳樟醇氧化物I（淡花香）[22]、芳樟醇氧化物II（弱木香）、-法呢烯（花香）、香葉醇（玫瑰花香）和乙酸葉醇酯（香蕉香）相對含量總量達到55.25%—69.01%，占鐵觀音萎凋葉的香氣比重最高。

2.2.1 對萎凋葉香氣組分的影響 如表3所示，不同溫度處理下鐵觀音萎凋葉的-法呢烯相對含量按序依次為：D20>D30>D35>D25>D40，D20比D40提高3.61%；與對照相比，D20的相對含量增長了7.07%，D40增長了3.46%。香葉醇的含量按序排列依次為：D30>D20>D25>D35>D40；D30比D40提高6.80%；與對照相比，D30的相對含量增長了14.12%，D40增長了7.32%。各萎凋葉橙花叔醇的相對含量按序依次為：D30>D35>D25>D20>D40，D30比D40提高1.16%；與對照相比，D30增長了3.23%，D40增長了2.07%。同樣，D30萎凋葉芳樟醇的相對含量最高，D40含量最低，二者相差約1.95%，其中D30較對照增長了5.51%，D40較對照增長了3.56%。芳樟醇氧化物I和芳樟醇氧化物II的相對含量均在D25達到最大值，在D40達到最小值。

LED光照處理下，-法呢烯的相對含量按序依次為：L20>L30>L35>L25>L40，L20比L40提高10.95%；與對照相比，L20增長了15.05%，L40增長了4.10%。香葉醇的含量按序依次為：L30>L25>L35>L40>L20，L30比L20提高6.08%，L30較對照增長了15.28%，L20較對照增長了9.20%。芳樟醇的含量按序依次為：L30>L20>L25>L35>L40，L30比L40提高1.86%；L30較對照增長了6.14%，L40較對照增長4.28%。橙花叔醇也在L30達到最大值，而在L40為最小值，其相對含量按序依次為：L30>L20>L35>L25>L40，L30較L40提高了1.08%；與對照相比，L30增長了3.71%，L40增長了2.63%。芳樟醇氧化物I和芳樟醇氧化物II均在L20達到最大值，分別為15.19%和7.25%，最小值則不同，芳樟醇氧化物II在L35為最小值，而芳樟醇氧化物I在L40為最小值，二者較對照分別增長了8.89%和3.06%。剩余香氣組分中，酯類物質(zhì)占8種，總相對含量為4.12%—29.27%；醇類物質(zhì)占5種，總相對含量為3.71%—11.76%；烷烴類物質(zhì)占3種，總相對含量占0.49%—1.12%；酸類、酮類和其他物質(zhì)各為1種。

表3 不同溫度LED光照處理鐵觀音萎凋葉主要香氣組分的相對含量

香氣相對含量（%）是以該香氣成分峰面積除以癸酸乙酯內(nèi)標峰面積歸一化法換算

The relative mass fraction represent the ratio peak area of components to ethyl decanoate

2.2.2 對萎凋葉主要萜類香氣組分的影響 由圖3可知，LED組萎凋葉中主要萜類化合物的相對含量較Dark組均有不同程度的增長，其中L30和D30處理的橙花叔醇、香葉醇和芳樟醇的相對含量均為各自處理組的最大值；-法呢烯和芳樟醇氧化物（I、II）則在L20處理為所有處理組的最大值；除芳樟醇外，L20橙花叔醇、香葉醇、-法呢烯和芳樟醇氧化物（I、II）的相對含量較D20的提升幅度最大，按序依次增加了1.01%、4.83%、7.98%、2.93%和7.26%；L25的芳樟醇、芳樟醇氧化物（I、II）較D25依次分別增長1.04%、1.66%和1.14%；L30的香葉醇、-法呢烯和芳樟醇氧化物（I、II）較D30依次分別增長了1.16%、2.32%、1.92%和3.24%；L35和L40的其他香氣組分較D35和D40增長不多，而香葉醇的增長幅度較大，依次為2.66%和2.67%。

2.3 基于主成分分析溫度和LED光照共同處理對萎凋葉香氣組分的影響

為了客觀評估不同溫度LED光萎凋葉的香氣質(zhì)量，本研究采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）技術(shù)對對照鮮葉和10個萎凋葉進行分析，得到123種共有香氣組分。通過閱讀國內(nèi)外與鐵觀音香氣組分相關(guān)的報道，結(jié)合已檢測出的香氣數(shù)據(jù)，篩選出25種達到人體嗅覺閾值的主要香氣組分（相對含量基本高于0.1%），25種香氣組分總相對含量占各萎凋葉香氣總含量的50%以上，因此，選擇前25種香氣成分進行主成分分析具有一定代表性。利用SPSS19.0對篩選出的25種香氣組分進行主成分分析，標準化處理后得到各主成分的特征值和累計貢獻率，具體如表4。對25個香氣組分進行主成分分析處理后，轉(zhuǎn)化為1、2、3、4、55個主成分。其方差貢獻率按序為51.367%、21.379%、7.968%、6.586%和4.408%，累計貢獻率達到91.708%；且1—5的特征根λ>1.000，能較為全面反映鐵觀音萎凋葉香氣品質(zhì)的綜合特點，因此選擇1—5進行主成分分析能較為客觀、全面的解釋和評價不同溫度LED光萎凋葉香氣質(zhì)量的全部信息。不同香氣組分對應(yīng)1—5的載荷系數(shù)如表5所示，其中i（i=1—25）分別代表鐵觀音香氣組分，詳見表3。

圖3 不同溫度LED光照處理鐵觀音萎凋葉主要香氣組分含量

綜合表4和表5可知，1的累計貢獻率達到51.367%，包含了50%以上的香氣信息，且鐵觀音萎凋葉香氣相對含量占大部分比重的-法呢烯（2）、橙花叔醇（9）、芳樟醇及其氧化物（I、II）（5X1）和香葉醇（3）的載荷系數(shù)為0.85、0.93、0.90、0.89、0.96和0.89，與主成分方程1呈高度正相關(guān)，而呈青香、刺激性味的鄰苯二甲酸酯和2,2,3,3-四甲基丁烷等成分載荷系數(shù)與主成分方程1呈高度負相關(guān)。

表4 主成分特征值與累積貢獻率

表5 主成分對應(yīng)的載荷矩陣

以不同特征值的1、2、3、4、5方差貢獻率作為加權(quán)系數(shù)，由1—5對應(yīng)的不同特征值的方差貢獻率為權(quán)重相乘再求和建立香氣的綜合評估數(shù)學模型：=0.5141+0.2142+0.083+0.0664+0.0445，通過數(shù)學模型對不同溫度LED光萎凋葉進行香氣質(zhì)量評估，并按值大小排序。根據(jù)方差貢獻率最大的1分析可知，值越大，萎凋葉的主要香氣主要組分含量越高，綜合評價結(jié)果如表6所示。通過主成分分析得出不同光照和溫度共同處理鐵觀音萎凋葉的香氣質(zhì)量綜合得分由高到低依次為：L20、L30、D30、L35、L25、L40、D20、D35、D25和D40；由于越大，萎凋葉香氣綜合質(zhì)量越好，因此可知L20萎凋葉的各主要香氣組分含量的綜合得分最高，L30處理次之；D30在無光處理組中得分最高；L40和D40在各自處理組得分最低，但各萎凋葉主要香氣組分的含量均高于對照，這與萎凋葉香氣組分分析所得的結(jié)果基本一致。

3 討論

綜合本研究結(jié)果可知，不同溫度處理的鐵觀音萎凋葉的、、、相對表達量均在30℃和35℃處理時達到較大值，而溫度過高或過低均會抑制其表達量，得出各基因的最適表達溫度為30℃—35℃。前人研究表明，改變萎凋溫度能增加紅茶的花香[24]。萎凋葉不同香氣組分的最大值分布在不同溫度處理，D20處理的α-法呢烯含量最高，D30的橙花叔醇、香葉醇、芳樟醇和芳樟醇氧化物I含量最高，D25的芳樟醇氧化物II的含量最高；但各主要香氣組分的含量基本在D40處理達到最小值，這與主成分分析得出的D30在無光處理組香氣綜合得分最高，D40得分最低這一結(jié)論一致。此外，在不同溫度萎凋處理下，萜類代謝途徑上游基因相對含量與主要萜類芳香物質(zhì)的含量變化不具有同步性；但均在30℃左右達到最大值，40℃處理最低；推測這與茶葉中各種酶的最適溫度有關(guān)，尤其是多酚氧化酶（PPO）和過氧化氫酶（POD）。有研究表明[25-26]，茶葉中的主要芳香物質(zhì)如芳樟醇及其氧化物、香葉醇等，都與-糖苷酶酶促水解作用所形成大量香氣前體物，特別是多酚類物質(zhì)與PPO、POD的接觸氧化密切相關(guān)；滑金杰等[27]設(shè)計20℃、28℃、36℃ 3個萎凋溫度梯度處理鮮葉，得出在28℃處理的多酚氧化酶PPO、POD酶活性最高，這與本研究30℃萎凋處理主要萜類芳香物質(zhì)含量最高這一結(jié)論基本一致。

表6 香氣質(zhì)量綜合評價結(jié)果

LED組鐵觀音萎凋葉、、、的相對表達量均高于對應(yīng)的Dark組，與鮮葉相比，LED組萎凋葉較Dark組提升更顯著；Dark組的、相對表達量均低于XY；經(jīng)LED處理后，、表達量均顯著高于XY；推測與溫度因子相比，LED光因子對、調(diào)控更顯著?？梢姡馀c溫度同時對萎凋葉、、、表達具有調(diào)控作用；在一定溫度范圍內(nèi)，兩者組合對萎凋葉的、、、表達具有正向調(diào)控作用；項麗慧等[28]研究得出紅茶萎凋過程中經(jīng)LED黃光處理，毛茶中萜類揮發(fā)性物質(zhì)大幅度增加。本研究結(jié)果表明，在烏龍茶萎凋過程中，增加LED光照可顯著提高萎凋葉主要萜烯類組分的含量，這與FU等[9]的研究結(jié)果基本一致；在同溫度梯度處理下，L20萎凋葉的主要香氣組分含量較D20提升最顯著，其次是L30；而L35、L40較D35、D40漲幅不大；其中L20、L25、L30主要萜類芳香物質(zhì)的含量較D20、D25、D30增長幅度較大，最顯著的為L20處理，而L35、L40處理，各香氣組分含量較D35、D40增長幅度不大；這與主成分分析得出的結(jié)論基本一致。

L20與D20主要香氣組分的含量在各自處理組中均占較高比例；L20的芳醇氧化物（I、II）、-法呢烯、乙酸葉醇酯、芳醇氧化物的相對含量為所有處理組的最大值；其香葉醇、芳樟醇、橙花叔醇的含量也僅次于L30，與主成分分析得出的結(jié)論一致。朱宏凱等[29]設(shè)計紅茶低溫（20±2℃）、中溫（30±2℃）、高溫（40±2℃）揉捻試驗，得出在低溫揉捻條件下酶活性保留相對較高，這可能與低溫條件減少了酶與鄰醌等物質(zhì)的結(jié)合有關(guān)[30]。因此，推測低溫條件有利萎凋和揉捻處理過程中鮮葉PPO和POD酶活性的保留，而PPO和POD酶活性與茶葉芳香物質(zhì)含量的累加直接相關(guān)，所以，L20和D20處理萎凋葉的主要香氣組分含量較高；此外，L30萎凋葉的香氣組分含量僅次于L20。

而L20、D20處理萎凋葉、、、的相對表達量卻較低，與其香氣總相對含量最高的結(jié)果相反；推測可能是MEP下游某些香氣合成基因受低溫誘導(dǎo)，在20℃處理顯著表達，直接提高萜類化合物的含量，進而使L20、D20萎凋葉香氣主要組分綜合含量最高，還有待更深入的研究。

4 結(jié)論

在LED光萎凋過程中各香氣組分形成的最適溫度并不一致，L20處理萎凋葉-法呢烯和芳樟醇氧化物（I、II）含量較高，L30處理萎凋葉橙花叔醇、芳樟醇和香葉醇含量較高；生產(chǎn)上可根據(jù)萎凋葉所需不同香氣類型來選擇不同的LED光萎凋溫度。D40處理不利于萎凋葉萜類關(guān)鍵基因（、、、）的表達，同時不利于萜類主要芳香物質(zhì)的合成；生產(chǎn)上應(yīng)注意萎凋時的通風狀況及其萎凋環(huán)境溫度的調(diào)控，攤?cè)~不能太厚，避免葉溫上升過快。烏龍茶萎凋過程中溫度參數(shù)的改變能影響MEP上游關(guān)鍵基因的表達量和萜類香氣組分相對含量；在溫度一致的條件下，單獨的光因子對MEP上游關(guān)鍵基因的表達和主要萜類香氣組分的生成具有調(diào)控作用。L30光照萎凋處理的萎凋葉MEP途徑上游關(guān)鍵基因相對表達量最高，同時橙花叔醇、芳樟醇和香葉醇含量最高，這與生產(chǎn)上的萎凋溫度一致。因此，烏龍茶萎凋過程中香氣組分積累、4個關(guān)鍵基因的表達量與光和溫度處理三者間不存在線性相關(guān)關(guān)系，調(diào)控好合適的光萎凋溫度有利于促進鐵觀音萎凋葉香氣的形成。

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Effects of LED Light Withering at Different Temperatures on Expression of Key Genes in the Upstream of MEP and Formation of Volatiles in Tieguanyin Tea

YOU FangNing1, DENG HuiLi1, HU Juan1, YAO ZhiLing1, WU ShuaiQiang1, QIN YiJia1, TANG TongHua2, SUN Yun1

(1College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Tea School of Fujian Province, Fuzhou 350002;2Shanghang County Jiao Tan Tea Industry Development Co., Ltd., Longyan 364000, Fujian)

【】Terpenoids are important aroma components of oolong tea, and the key upstream genes of the MEP are directly involved in the regulation of the synthesis of terpenoid precursors. Withering, a process closely related to the aroma formation of oolong tea, is affected by many factors such as light exposure and temperature. The present study was aimed at investigating the effects of LED light and temperature on the aroma formation of oolong tea during withering process and to provide reference for improving aroma quality of withered leaves of Oolong tea. 【】 Firstly, the key upstream genes of MEP (,,, and) in tea which responded to light were selected according to our previous transcriptome data and KEGG pathways. The tea cultivar Tieguanyin was chosen as test materials, which were plucked in Tea Science Teaching and Research Base of Fujian Agriculture and Forestry University with one bud and three leaves. The freshly plucked leaves were treated under white LED light coupling with series temperature ((20℃ (L20), 25℃ (L25), 30℃ (L30), 35℃ (L35) and 40℃ (L40) ), Dark treatment (20℃ (D20), 25℃ (D25), 30℃ (D30), 35℃ (D35), and 40℃ (D40) ), and then the aroma contents and key upstream gene of MEP of withered leaves were determined.【】Under L30 treatment,,,andgenes in the withered leaves were reached maximum, and which was 4.31, 5.28, 11.77, and 1.59 fold of XY (CK), respectively; these genes in L30 were 2.24, 2.39, 1.86 and 1.60 fold compared to D30 treatment; these genes expression were highest in D30 among Dark group and was 1.92, 2.21, 6.34 and 0.99 fold of XY, respectively. The contents of α-Farnesene and Linalool oxide (I, II) of L20 was the highest, which were increased by 15.05%, 4.92% and 15.13%, respectively, compared to XY. The highest content of Nerolidol, Linalool and Geraniol were occurred in L30 treatment, which were increased by 3.71%, 6.14% and 15.28%, respectively, compared with XY. The content of main aroma components in the LED group of Tieguanyin withered leaves was higher than that of temperature group. The mathematical model was established by principal component analysis method and the aroma components of the withered leaves were evaluated. It was found that the L20 treatment had the highest score and followed by L30, which were consistent with the aroma analysis. 【】According to the comprehensive test results, there was no synchronization between the expression of the genes and the aroma contents of Tieguanyin, The gene expression under L30 treatment, aroma contents and principal component analysis scores were higher than that under other treatments. These results were consistent with the withering temperature in Tieguanyin production: when withering temperature was too high (40℃), the related gene expression and the formation of terpenoids in the withered leaves were prohibited.

Tieguanyin; withering leaves; LED; temperature; aroma;;;;; terpenoids

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.02.009

2019-02-28；

2019-06-05

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（茶葉）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（CARS-19）

游芳寧，E-mail：youfangning123@163.com。通信作者孫云，E-mail：sunyun1125@126.com

（責任編輯 趙伶俐）