紫花苜蓿MsSQE1的克隆及對(duì)皂甙合成的功能分析

康俊梅，張俏燕，蔣旭，王珍，張鐵軍，龍瑞才，崔會(huì)婷，楊青川

紫花苜蓿的克隆及對(duì)皂甙合成的功能分析

康俊梅，張俏燕，蔣旭，王珍，張鐵軍，龍瑞才，崔會(huì)婷，楊青川

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

【】鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidases，SQE）是苜蓿皂甙合成途徑中的一種限速酶，與苜蓿皂甙的合成密切相關(guān)。通過對(duì)苜蓿鯊烯環(huán)氧酶（）基因的克隆及在苜蓿中過表達(dá)，探究鯊烯環(huán)氧酶對(duì)皂甙合成的作用機(jī)制。以模式植物蒺藜苜蓿鯊烯環(huán)氧酶基因序列設(shè)計(jì)引物，同源克隆苜蓿對(duì)MsSQE1進(jìn)行生物信息學(xué)分析；通過基因槍轟擊技術(shù)，使MsSQE1在洋蔥表皮瞬時(shí)表達(dá)，進(jìn)行亞細(xì)胞定位。利用qRT-PCR方法分析該基因在根、莖、葉中的表達(dá)水平，以及在紫外輻射、ABA和GA3條件下的表達(dá)模式。在茉莉酸甲酯（MeJA）的誘導(dǎo)下，分析的轉(zhuǎn)錄水平，及對(duì)苜蓿皂甙含量的影響。利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系，獲得過表達(dá)的陽性轉(zhuǎn)基因植株，并測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株的皂甙含量?？寺×说腸DNA序列，開放閱讀框1 578 bp，編碼525個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為8.59。同源性比對(duì)分析，其氨基酸序列與蒺藜苜蓿中SQE1氨基酸序列同源性為98.6%，與擬南芥的同源性為80%。亞細(xì)胞定位顯示，MsSQE1可能定位于細(xì)胞膜。組織特異性表達(dá)分析顯示，在葉中的表達(dá)量最高，莖中次之，根中的表達(dá)量最低。在紫外輻射、ABA和GA3的誘導(dǎo)表達(dá)顯示，紫外輻射誘導(dǎo)24 h，葉中表達(dá)量最高； GA3（50 μmol·L-1）和 ABA（100 μmol·L-1）處理，均為8 h葉中表達(dá)量最高；MeJA處理能誘導(dǎo)表達(dá)量上調(diào)的同時(shí)苜?？傇磉昂恳搽S著表達(dá)的上調(diào)而增加。分析過表達(dá)轉(zhuǎn)基因苜蓿和轉(zhuǎn)空載體苜蓿株系發(fā)現(xiàn)，的表達(dá)水平和總皂甙含量均升高，其中的表達(dá)水平是對(duì)照的3.11—9.45倍，總皂甙含量比對(duì)照提高14.26%—28.05%，暗示是苜蓿皂甙合成途徑中的一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶。從豆科牧草紫花苜蓿中克隆了并進(jìn)行功能分析。在苜蓿中過表達(dá)能增加苜?？傇磉昂?，暗示的表達(dá)影響苜蓿皂甙的生物合成，可能對(duì)皂甙的合成有重要的調(diào)節(jié)作用。

紫花苜蓿；鯊烯環(huán)氧酶基因（）；苜蓿皂甙；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

0 引言

【研究意義】皂甙又稱皂苷、皂素和堿皂體，是普遍存在于自然界的一類糖苷類化合物，包括三萜類化合物、甾醇和類固醇。皂甙主要分布于高等植物中，尤其是中草藥（如人參、雷公藤、三七、甘草等）的有效成分，具有良好的降膽固醇、降血脂、抗炎、抗癌、抗菌、殺蟲等生物學(xué)活性[1-4]。因此，在藥用植物中提取純化皂甙得到了廣泛應(yīng)用，并對(duì)皂甙生物合成途徑相關(guān)酶及調(diào)控機(jī)制開展了大量研究[5]。紫花苜蓿營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，是公認(rèn)的高蛋白飼草，并富含有維生素和礦物質(zhì)。此外，苜蓿含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，如苜蓿皂甙（alfalfa saponins），由于其藥用功效，被視為保健品的原料，具有潛在的開發(fā)價(jià)值[6-7]。關(guān)于苜蓿皂甙的提取純化與含量測(cè)定方面已有相關(guān)研究，但苜蓿皂甙合成的分子機(jī)制研究甚少。因此，開展苜蓿皂甙合成途徑中關(guān)鍵基因的功能研究，對(duì)苜蓿皂甙的開發(fā)應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鯊烯環(huán)氧酶（squalene eposidases，SQE），又稱鯊烯單加氧酶，在甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）途徑中催化鯊烯Ｃ＝Ｃ雙鍵的環(huán)氧化反應(yīng)，生成2,3-氧化鯊烯。這一反應(yīng)是三萜皂甙合成途徑中第一個(gè)氧化反應(yīng)，生成甾醇及三萜類物質(zhì)的前體物質(zhì)，故鯊烯環(huán)氧酶的活性和含量決定了下游產(chǎn)物的量[8]。在三萜代謝途徑中SQE的作用至關(guān)重要。由于SQE負(fù)責(zé)氧化還原反應(yīng)，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)含有氧化還原反應(yīng)所需要的輔助因子——黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）結(jié)合位點(diǎn)[9]。SQE不僅在植物次生代謝中起重要作用，而在動(dòng)物和微生物中也是藥物抑制病原菌生長(zhǎng)和降低膽固醇的關(guān)鍵酶[10-11]。目前，許多生物的SQE基因被克隆，并進(jìn)行功能分析，如植物中有擬南芥[12-13]、人參[14-15]、三七[16-18]、南非醉茄[19]、雷公藤[20-21]、甘草[22]、絞股藍(lán)[23]、白樺[24]、羅漢果[25]，微生物有酵母[26-27]、牛樟芝[28]，動(dòng)物有鼠[29]等。不同物種中，鯊烯環(huán)氧酶基因的拷貝形式是不同的。在酵母和小鼠中，基因是以單拷貝形式存在的[26-27,29]。在植物中，基因通常以基因家族的形式存在，例如在擬南芥基因組中，發(fā)現(xiàn)6個(gè)SQE基因成員，其中編碼有活性的鯊烯環(huán)氧酶，而編碼的蛋白則沒有催化功能[12]。在藥用植物人參中發(fā)現(xiàn)SQE基因家族有2個(gè)成員，均具有生物活性，在MeJA誘導(dǎo)下，的表達(dá)上調(diào)，而的表達(dá)卻受到抑制[14-15]。三七中SQE家族的2個(gè)成員和也存在組織特異性表達(dá)模式，而且用MeJA誘導(dǎo)4年生三七植株發(fā)現(xiàn)，的表達(dá)量在24 h達(dá)到最高，表達(dá)量無明顯變化，推測(cè)PnSQE1可能在皂甙、甾醇類次生代謝物的合成途徑中起催化作用[16-18]。也有研究表明，體外誘導(dǎo)增加的mRNA表達(dá)，三萜類物質(zhì)生成量隨之増加，降低的mRNA表達(dá)，三萜類物質(zhì)的生物合成受到抑制。人參鯊烯環(huán)氧酶基因的RNAi高效植物表達(dá)載體pMHZ111-SQE轉(zhuǎn)化人參愈傷組織中，發(fā)現(xiàn)人參皂甙含量大幅度下降。進(jìn)一步證實(shí)了基因與皂甙的合成有關(guān)[14]。【本研究切入點(diǎn)】目前，有關(guān)皂甙生物合成途徑的關(guān)鍵基因及其功能研究主要集中在中草藥植物，如人參、刺五加、三七等，還有模式植物擬南芥等，關(guān)于苜蓿皂甙合成的相關(guān)研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究克隆了苜蓿，對(duì)其編碼的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位和原核表達(dá)分析，研究其在不同組織和誘導(dǎo)條件下的表達(dá)模式及對(duì)皂甙含量的影響，通過研究在苜蓿中過表達(dá)對(duì)苜蓿皂甙含量的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證其在皂甙合成中的作用機(jī)制，以期為利用基因工程手段培育高皂甙含量的苜蓿品種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與培養(yǎng)

紫花苜蓿中苜1號(hào)（L.Zhongmu No.1）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所飼草育種課題組育成。挑選飽滿的中苜1號(hào)種子萌發(fā)1周，移入霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液中，置于光照培養(yǎng)箱（16 h晝/8 h夜，24℃晝/20℃夜，相對(duì)濕度40%）培養(yǎng)4周。取部分幼苗分別收獲根、莖、葉組織，另取部分幼苗進(jìn)行15 W紫外照射30 min、ABA（100 μmol·L-1）、GA3（50 μmol·L-1）和MeJA（200 μmol·L-1）脅迫處理，在不同時(shí)間點(diǎn)收集地上部分組織，所有植物樣品冷凍于液氮中備用。中苜1號(hào)種子經(jīng)75%酒精溶液和0.1% HgCl2溶液消毒后，用無菌水洗滌7次后放置在無菌濕潤(rùn)濾紙上，室溫黑暗培養(yǎng)2 d后，將發(fā)芽的種子移入1/2 SH培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)4周（條件同上），獲得無菌苗用于遺傳轉(zhuǎn)化。

1.2 MsSQE1的克隆

根據(jù)已知蒺藜苜蓿鯊烯環(huán)氧酶基因的CDS序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物P1和P2（表1），以紫花苜蓿第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃5 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收，與pEASY-T3克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans-T1，挑取陽性克隆送北京天一輝遠(yuǎn)公司測(cè)序。

表1 本研究所用引物序列

小字母區(qū)域?yàn)槊盖形稽c(diǎn)序列 The sequences in low case indicated the restriction enzyme cutting sites

1.3 MsSQE1的生物信息學(xué)分析

通過NCBI/BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi）搜索同源序列并比對(duì)分析；用DNAMAN軟件進(jìn)行蛋白多重序列比對(duì)。應(yīng)用MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。利用SOPMA（http://npsa-pbil.ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html）程序分析蛋白質(zhì)序列的氨基酸組成，分子量等理化性質(zhì)。借助生物學(xué)軟件SignalP 4.1Server（http://www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。采用TMHMM Server在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)、疏水性和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成。

1.4 MsSQE1的亞細(xì)胞定位

通過在線軟件TargetP 1.1（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TargetP/）和PSORT prediction（http://psort.hgc. jp/form.html）預(yù)測(cè)目標(biāo)基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位。利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物SQE1-GFP-f/SQE1-GFP-r（含有Ⅰ和Ⅰ酶切位點(diǎn)，表1），擴(kuò)增編碼序列，確定序列的正確性，通過雙酶切將目的片段整合到pA7-GFP，構(gòu)建35S啟動(dòng)下的瞬時(shí)表達(dá)載體35S和35S，通過基因槍轟擊法，轉(zhuǎn)入到洋蔥表皮細(xì)胞。25°C培育24 h，然后用共聚焦顯微鏡觀測(cè)并拍照（Olympus FV500，日本）。

1.5 原核表達(dá)分析

由于編碼蛋白N端存在信號(hào)肽，信號(hào)肽的存在會(huì)影響編碼蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)。故原核表達(dá)采用2種方案，一是將的整個(gè)編碼區(qū)序列插入原核表達(dá)載體；二是將編碼區(qū)N末端截掉信號(hào)肽（25個(gè)氨基酸序列），再插入原核表達(dá)載體。因此，設(shè)計(jì)2對(duì)引物SQE1-PE-f/SQE1-PE-r（擴(kuò)增全長(zhǎng)編碼區(qū)）和SQE1-PE-f/SQE1-PE-SPt-f（擴(kuò)增去掉信號(hào)肽的序列），分別擴(kuò)增目標(biāo)編碼區(qū)序列，然后連接到pEASY-E2載體中。將2種原核表達(dá)重組子和ΔN25，以及分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transetta（DE3）。然后加入終濃度為1.0 mmol·L-1的IPTG，在30℃誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)5 h，收集菌體并提取蛋白，處理好的蛋白樣品用10% SDS-PAGE檢測(cè)，凝膠用G-250考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后拍照。

1.6 MsSQE1的表達(dá)分析

苜蓿樣品總RNA的提取采用植物RNA提取試劑盒（詳細(xì)步驟見說明書），紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度（NanoDrop 2000）。采用qRT-PCR檢測(cè)苜蓿不同組織根、莖、葉中的相對(duì)表達(dá)水平，同時(shí)測(cè)定苜蓿幼苗受紫外輻射、ABA、GA3和MeJA誘導(dǎo)后，在不同時(shí)間點(diǎn)地上部分的相對(duì)表達(dá)量。取1 μg總RNA，以SQE1-RT-f1/SQE1-RT-r1和Actin-f/Actin-r為引物（表1），看家基因作內(nèi)參，采用ABI公司的7300 Real Time PCR System進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.7 MeJA誘導(dǎo)條件下皂甙含量的測(cè)定

取MeJA處理組中不同時(shí)間點(diǎn)地上部分樣品粉碎后經(jīng)石油醚脫脂，-80℃凍干70 h，取出后過60目篩，置于干燥器中保存。稱取30 mg凍干樣品各3份，用1 ml 70%乙醇在超聲清洗機(jī)中提取30 min，4℃過夜，再次超聲30 min。3 300 r/min離心30 min，取上清液100 μL注入預(yù)處理過的SPE柱，分別用5 mL水和5 mL 30%甲醇沖洗后，再以甲醇洗脫4次，每次1 mL。合并洗脫液置于10 mL具塞試管中進(jìn)行比色測(cè)定，具體方法參考徐瑯等[30]方法。以空白平行樣作對(duì)照，用分光光度計(jì)在545 nm處測(cè)定各管中溶液的吸光度，計(jì)算總皂苷含量。

1.8 超表達(dá)載體構(gòu)建及苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化

設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)Ⅰ和HⅠ的引物SQE1-P1/SQE1-P2（表1），以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物回收后連接到pEASY-T3載體。經(jīng)測(cè)序確定序列的正確性，并提取重組質(zhì)粒pEASY-T3-。用Ⅰ和HⅠ快速限制性內(nèi)切酶對(duì)pBI121和重組子pEASY-T3-進(jìn)行雙酶切，在T4連接酶的作用下將目的基因編碼區(qū)序列插入到植物超表達(dá)載體pBI121中，構(gòu)建目的基因超表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。采用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化紫花苜蓿中苜1號(hào)，具體操作參考Cosson等[31]方法。

1.9 過表達(dá)MsSQE1轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的鑒定及對(duì)皂甙含量的影響

以抗性T0轉(zhuǎn)基因植株的總DNA為模板，用pBI121上35S啟動(dòng)子的上游引物35S-f和的下游引物SQE1-r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定陽性轉(zhuǎn)基因苜蓿，轉(zhuǎn)空載體pBI121再生株系的DNA為陰性對(duì)照，pBI121-SQE1質(zhì)粒為陽性對(duì)照。利用qRT-PCR檢測(cè)陽性轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿，轉(zhuǎn)空載體苜蓿地上部分的表達(dá)水平（方法同1.6），同時(shí)測(cè)定其總皂苷含量（方法同1.7）。

2 結(jié)果

2.1 MsSQE1的克隆及序列分析

以紫花苜蓿DNA為模板，P1/P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條約1 800 bp的條帶，經(jīng)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)該基因的最大開放閱讀框?yàn)? 578 bp，編碼525個(gè)氨基酸（圖1）。同源性分析發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列與蒺藜苜蓿的同源性最高（98.9%），與水稻、擬南芥、衣藻和動(dòng)物中鯊烯環(huán)氧酶氨基酸序列的同源性分別為81.4%、80%、57.4%和44.6%（圖2）。通過氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，不同物種均具有2個(gè)典型的FAD綁定結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域高度保守，表明是鯊烯環(huán)氧酶的活性中心。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，該基因編碼的SQE與蒺藜苜蓿MtSQE1的親緣關(guān)系最近，屬于基因（圖2），命名為。MsSQE1與蒺藜苜蓿的3個(gè)SQEs、大豆的2個(gè)SQEs屬于同一分支，表明親緣關(guān)系較近。據(jù)報(bào)道擬南芥AtSQE1-3具有鯊烯環(huán)氧酶活性功能，而AtSQE4-6則沒有酶活性，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示MsSQE1與AtSQE1-3同屬于一個(gè)大的分支上，而與AtSQE4-6屬于不同的分支，暗示MsSQE1具有鯊烯環(huán)氧酶活性。衣藻、酵母與動(dòng)物的SQE均單獨(dú)一個(gè)分支，表明親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3）。

通過SOPMA在線軟件預(yù)測(cè)表明，MsSQE1二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋與無規(guī)則卷曲為主，其中α-螺旋為38.10%，無規(guī)則卷曲為39.62%，β-轉(zhuǎn)角為7.24%，延伸鏈為15.05%。理化性質(zhì)分析MsSQE1蛋白分子量為56.97 kD，理論等電點(diǎn)為8.59。借助SignalP 4.1 Server軟件分析MsSQE1序列結(jié)果顯示，SQE1蛋白序列第26位谷氨酸殘基具有最高的原始剪切位點(diǎn)分值0.357和第4位谷氨酰胺殘基具有最高的信號(hào)肽分值0.751，推測(cè)MsSQE1序列前25個(gè)氨基酸可能組成一個(gè)信號(hào)肽，在跨膜運(yùn)輸中起信號(hào)識(shí)別作用，信號(hào)肽剪切位點(diǎn)位于第25—26位氨基酸。TMHMM Server在線軟件分析顯示，MsSQE1有3個(gè)跨膜螺旋區(qū)（TM helix），第一個(gè)跨膜螺旋區(qū)從第5個(gè)氨基酸殘基到第24個(gè)氨基酸殘基，方向由外向內(nèi)；第二個(gè)從第455個(gè)氨基酸殘基到第477個(gè)氨基酸殘基，方向由內(nèi)向外；第三個(gè)從第484個(gè)氨基酸殘基到第501個(gè)氨基酸殘基，方向由外向內(nèi)（圖3）。

A：MsSQE1的PCR擴(kuò)增；B：MsSQE1的cDNA全序列

MsSQE：紫花苜蓿M. sativa；MtSQE：蒺藜苜蓿M. truncatula；OsSQE：水稻O. sativa；AtSQE：擬南芥A. thaliana；CrSQE：衣藻C. reinhardtii；HsSQE：人H. sapiens。黑色方框代表預(yù)測(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)域；黑色下劃線表示FAD結(jié)合域The predicted transmembrane domain was boxed; FAD binding domain was underlined in black

2.2 亞細(xì)胞定位

利用PSORT prediction軟件預(yù)測(cè)MsSQE1蛋白主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、質(zhì)膜、高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。為了驗(yàn)證MsSQE1蛋白的亞細(xì)胞定位，采用基因槍轟擊法將含有編碼序列的瞬時(shí)表達(dá)載體pA7--GFP轉(zhuǎn)入洋蔥表皮，在35S強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，MsSQE1-GFP融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中過量表達(dá)，用激光共聚顯微鏡觀察融合蛋白的熒光信號(hào)確定MsSQE1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)空載體pA7-GFP的細(xì)胞，熒光信號(hào)分布在整個(gè)細(xì)胞的膜和細(xì)胞核上；而轉(zhuǎn)化了pA7-GFP的細(xì)胞，只有細(xì)胞膜上有微弱的熒光信號(hào)，同時(shí)經(jīng)過細(xì)胞失水發(fā)生質(zhì)壁分離時(shí)觀測(cè)熒光信號(hào)，同樣融合蛋白只有在細(xì)胞膜上有微弱的表達(dá)。由于試驗(yàn)方法的局限性，不能觀測(cè)到細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)，無法確定高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上是否能表達(dá)。結(jié)合軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，MsSQE1蛋白可能是分泌性蛋白，主要集中在分泌途徑上，分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、質(zhì)膜、高爾基體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)。

Zm01g028299、Zm01g047998：玉米Zea mays；Os03g0231800、Os03g0231700：水稻Oryza sativa；Gm15g061800、Gm13g253100：大豆Glycine max；MsSQE：紫花苜蓿Medicago sativa；Mt04g092640、Mt06g035065、Mt06g034955：蒺藜苜蓿Medicago truncatula；A4A49-24460、A4A49-34922：煙草Nicotiana tabacum；Pt07g007600v3、Pt02g114500v3：楊樹Populus trichocarpa；Ta02g059900、Ta02g235500：小麥Triticum aestivum；At02g22830、At04g37760、At01g58440、At05g24140、At05g24150、At05g24160：擬南芥Arabidopsis thaliana；Cr17g734644v5：衣藻Chlamydomonas reinhardtii；YGR175C：酵母Saccharomyces cerevisiae；Q14534、E7EVQ6：人Homo_sapiens

A：蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)，C-score：原始剪切位點(diǎn)的分值；S-score：信號(hào)肽的分值；Y-score：綜合剪切位點(diǎn)的分值；mean S：信號(hào)肽分值的平均值；D：識(shí)別分值；B：跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；C：二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

a—c：35::GFP轉(zhuǎn)化洋蔥表皮綠色熒光蛋白分布情況；d—f：35S::MsSQE1-GFP轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞綠色熒光蛋白分布情況；g—i：轉(zhuǎn)化了35S::MsSQE1-GFP的洋蔥表皮細(xì)胞在細(xì)胞失水（0.3 g·ml-1蔗糖）條件下綠色熒光蛋白的分布。Bar=100 μm

2.3 原核表達(dá)分析

對(duì)不同植物的SQE結(jié)構(gòu)分析表明，SQE蛋白具有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，分別位于N末端（1個(gè)）和C末端（2個(gè)），暗示SQE蛋白是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜與質(zhì)膜上的膜蛋白[19]。為了解MsSQE1的催化功能，需要獲得一定量的可溶性蛋白，前人研究證實(shí)截掉跨膜結(jié)構(gòu)域可以增加可溶性蛋白的表達(dá)量。因此，構(gòu)建MsSQE1全長(zhǎng)編碼區(qū)和N末端截短（N-terminal truncated）25個(gè)氨基酸的MsSQE1原核表達(dá)重組子。同時(shí)，構(gòu)建了在pEASY-E2表達(dá)載體內(nèi)插入一段對(duì)照基因序列，作為空白對(duì)照，命名為pEASY-E2- Control。將3種重組子轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transetta（DE3）中，在T7啟動(dòng)子作用下，用1.0 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白在大腸肝菌中大量表達(dá)，分別提取菌液蛋白，離心后分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果（圖6）顯示，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后pEASY-E2-MsSQE1上清液總蛋白和沉淀物總蛋白中均在55—60 kD檢測(cè)到目標(biāo)重組蛋白條帶，而轉(zhuǎn)化了pEASY-E2-MsSQE1ΔN25大腸桿菌只能在其沉淀總蛋白中檢測(cè)到分子量大約55 kD的目標(biāo)重組蛋白條帶。因此，MsSQE1蛋白可在大腸桿菌中大量表達(dá)，且可檢測(cè)到可溶性蛋白。而N末端截短25個(gè)氨基酸后，MsSQE1蛋白依然可在大腸桿菌中表達(dá)，但均為包涵體蛋白。

M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：轉(zhuǎn)化了pEASY-E2-Control的大腸桿菌總蛋白（經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5 h）；2：轉(zhuǎn)化了pEASY-E2-MsSQE1ΔN25的大腸桿菌總蛋白（未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)）；3：轉(zhuǎn)化了pEASY-E2-MsSQE1ΔN25大腸桿菌上清蛋白（經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5 h）；4：轉(zhuǎn)化了pEASY-E2-MsSQE1ΔN25大腸桿菌沉淀蛋白（經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5 h）；5：轉(zhuǎn)化了pEASY-E2-MsSQE1的大腸桿菌總蛋白（未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)）；6：轉(zhuǎn)化了pEASY-E2- MsSQE1大腸桿菌上清蛋白（經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5 h）；7：轉(zhuǎn)化了pEASY-E2-MsSQE1大腸桿菌沉淀蛋白（經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5 h）；箭頭表示MsSQE1蛋白的表達(dá)

2.4 MsSQE1組織差異性表達(dá)及在不同誘導(dǎo)條件下的表達(dá)分析

不同植物中的組織差異性表達(dá)存在較大差異。為了解紫花苜蓿不同組織中的表達(dá)模式，以4周齡苜蓿葉、莖、根各組織樣品的反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR分析，檢測(cè)在紫花苜蓿不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，在葉中表達(dá)量最高，其次是莖，根中表達(dá)量最低，葉中的表達(dá)量是根中的8.99倍，莖中的表達(dá)量是根中的3.63倍（圖7-A）。

利用qRT-PCR檢測(cè)UV輻射和外源激素誘導(dǎo)下紫花苜蓿葉中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，在15 w紫外燈照射20 min后，不同時(shí)間點(diǎn)在葉中的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，在時(shí)間點(diǎn)24 h時(shí)表達(dá)量最大是對(duì)照的6.28倍（圖7-B）；GA3（50 μmol·L-1）誘導(dǎo)處理24 h，葉中的轉(zhuǎn)錄水平受到誘導(dǎo)，表達(dá)量上調(diào)，8 h時(shí)表達(dá)量最大，是對(duì)照的4.8倍（圖7-B）；在ABA (100 μmol·L-1）誘導(dǎo)下，在葉中的表達(dá)水平先下降再升高又下降，8 h時(shí)表達(dá)量最高是對(duì)照的2.1倍（圖7-B），12 h時(shí)表達(dá)量最低是對(duì)照的0.53倍，暗示受ABA誘導(dǎo)表達(dá)模式比較復(fù)雜。

2.5 MeJA處理下MsSQE1在苜蓿中的表達(dá)及對(duì)皂甙含量的影響

為驗(yàn)證在MeJA誘導(dǎo)下的表達(dá)模式。用MeJA（200 μmol·L-1）處理4周齡紫花苜蓿144 h，結(jié)果顯示，不同時(shí)間點(diǎn)在紫花苜蓿葉中的表達(dá)量變化差異較大（圖8-A）。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，葉中表達(dá)量先升高后降低，呈現(xiàn)出2個(gè)表達(dá)高峰值，第一個(gè)峰值是8 h時(shí)表達(dá)量是對(duì)照的9.19倍，24 h時(shí)表達(dá)量下降到最低是對(duì)照的2.60倍，隨后表達(dá)量又不斷提高，144 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值是對(duì)照的18.39倍。同時(shí)，測(cè)定了在MeJA誘導(dǎo)下紫花苜蓿葉中的總皂苷含量，結(jié)果表明總皂甙含量也呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)（圖8-B），與對(duì)照相比皂甙含量增加了15.7%—66.9%，其中4和24 h達(dá)到顯著水平（<0.5），48、96和144 h達(dá)到極顯著水平（<0.1）。

A：MsSQE1在紫花苜蓿不同組織中的表達(dá)分析；B、C、D：在UV、GA3和ABA誘導(dǎo)下MsSQE1在紫花苜蓿葉中的表達(dá)水平，*和**分別代表p<0.05 和p<0.01（t檢驗(yàn)）。下同

圖8 紫花苜蓿在MeJA誘導(dǎo)下MsSQE1的相對(duì)表達(dá)量（A）和總皂苷含量的變化（B）

2.6 苜蓿中過表達(dá)MsSQE1對(duì)皂甙含量的影響

為了驗(yàn)證在苜蓿皂苷合成途徑中的功能，構(gòu)建了植物高效表達(dá)載體pBI-121-，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化了紫花苜蓿，通過卡那霉素篩選獲得66株抗性植株。經(jīng)陽性鑒定結(jié)果顯示，已成功轉(zhuǎn)入紫花苜蓿基因組中（圖9-A）。隨機(jī)挑選3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，提取總RNA，利用qRT-PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)取地上部分進(jìn)行總皂苷含量的測(cè)定。結(jié)果表明，過表達(dá)苜蓿與對(duì)照植株相比的表達(dá)水平顯著上調(diào)，分別是對(duì)照的3.11、4.67和9.45倍（圖9-B）。轉(zhuǎn)基因株系中總皂苷含量也相應(yīng)的增加，分別比對(duì)照提高了14.26%、23.24%和28.05%（圖9-C）。表明過表達(dá)對(duì)苜蓿總皂甙含量的積累有重要的作用。

A：陽性轉(zhuǎn)基因植株鑒定；B：qRT-PCR測(cè)定MsSQE1的相對(duì)表達(dá)量；C：轉(zhuǎn)基因植株總皂甙含量測(cè)定；CK+：pBI-121-MsSQE1質(zhì)粒（陽性對(duì)照）；CK-：轉(zhuǎn)空載體pBI-121苜蓿植株（陰性對(duì)照）；1—10：抗性轉(zhuǎn)化植株；1、9、10：過表達(dá)MsSQE1的轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿

3 討論

皂甙是一種天然的表面活性糖苷，包括三萜苷類和類固醇物質(zhì)，許多植物中都存在這類物質(zhì)。由于三萜皂苷在保健食品和生物制藥等方面具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。因此，在許多植物尤其是藥用植物（人參、三七等）中得到了廣泛研究。本研究重點(diǎn)對(duì)苜蓿皂甙生物合成途徑中的鯊烯環(huán)氧酶進(jìn)行功能分析。鯊烯環(huán)氧酶（SQE）是三萜類和甾醇類物質(zhì)生物合成途徑中的一種關(guān)鍵限速酶，能夠在分子氧和還原輔酶Ⅱ（NADPH）參與下，催化角鯊烯轉(zhuǎn)變成環(huán)氧化鯊烯，而環(huán)氧化鯊烯又是三萜類皂甙的重要中間產(chǎn)物。本研究首次從紫花苜蓿中克隆了，該基因編碼蛋白氨基酸序列與其他物種SQE序列的保守性分析表明，6個(gè)不同物種均具有2個(gè)保守的FAD綁定結(jié)構(gòu)域，而且不同物種2個(gè)結(jié)構(gòu)域高度保守，表明這兩個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域是SQE的活性中心，是合成甾醇和三萜類物質(zhì)特有的結(jié)構(gòu)。序列結(jié)構(gòu)分析顯示，其編碼的蛋白序列前25個(gè)氨基酸可能組成一段引導(dǎo)蛋白跨膜轉(zhuǎn)移（定位）的N-末端疏水性氨基酸序列，同時(shí)C端有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，暗示鯊烯環(huán)氧酶是一種膜結(jié)合蛋白，屬于高度保守的SQE家族，而且具有酶特有的結(jié)構(gòu)。有研究報(bào)道，截掉酶蛋白氨基酸序列末端的跨膜結(jié)構(gòu)域，可以增加可溶性蛋白的表達(dá)量[20,25,28]，從而增加酶的活性。本研究截短了N末端的25個(gè)氨基酸序列，研究結(jié)果表明，去掉N末端的跨膜結(jié)構(gòu)域，沒有增加可溶性蛋白的表達(dá)量反而降低了其表達(dá)，那么去掉C末端的跨膜結(jié)構(gòu)域是否會(huì)增加可溶性蛋白的表達(dá)，有待進(jìn)一步研究。

為了驗(yàn)證MsSQE1的亞細(xì)胞定位，通過綠色熒光蛋白的洋蔥表皮瞬時(shí)表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)只有非核部分有微弱的熒光信號(hào)，同時(shí)經(jīng)過細(xì)胞失水發(fā)生質(zhì)壁分離時(shí)觀測(cè)熒光信號(hào)，同樣融合蛋白只在細(xì)胞膜上有微弱的表達(dá)。由于試驗(yàn)條件的局限性觀測(cè)不到細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)，所以無法確定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和高爾基體膜上是否能表達(dá)。擬南芥AtSQE1亞細(xì)胞定位分析表明，AtSQE1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[12]。結(jié)合軟件預(yù)測(cè)分析推斷，MsSQE1可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或質(zhì)膜。不同組織特異性表達(dá)分析表明，在葉中的表達(dá)水平優(yōu)于在莖和根中的表達(dá)。這個(gè)研究結(jié)果與睡茄、三七和白樺的組織差異性表達(dá)的結(jié)果相一致[17,19,24]。由此推測(cè)，紫花苜蓿葉片可能是甾醇、三萜類物質(zhì)生物合成的場(chǎng)所。人參中在所有器官中都大量積累，而僅在葉柄和花芽中弱表達(dá)并優(yōu)先表達(dá)。原位雜交分析表明，和的mRNAs均優(yōu)先聚集在葉柄的維管束組織和樹脂管中[14-15]。

在高等植物中，普遍認(rèn)為GA3、ABA與MeJA等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)作為信號(hào)因子，在防御反應(yīng)、開花、衰老以及次生代謝等方面具有重要的調(diào)節(jié)作用。因此，通常采用這些信號(hào)調(diào)節(jié)因子誘導(dǎo)處理來分析次生代謝物生物合成的作用機(jī)制。已有文獻(xiàn)報(bào)道，受GA3、ABA等外界條件的誘導(dǎo)表達(dá)[24]。本研究用GA3（50 μmol·L-1）誘導(dǎo)處理24 h，苜蓿地上部分的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升，8 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高；在ABA （100 μmol·L-1）誘導(dǎo)下，同樣是8 h時(shí)地上部分表達(dá)量最高，但其他時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量低于對(duì)照，其作用的分子機(jī)制有待深入探討。MeJA是一種常用的誘導(dǎo)劑，在擬南芥[12]、人參[15]、三七[16-17]、雷公藤[20]、白樺[24]和柴胡[32]等植物均證實(shí)在MeJA誘導(dǎo)下，的表達(dá)水平顯著上調(diào)。本研究紫花苜蓿在MeJA誘導(dǎo)下，的表達(dá)水平也顯著上升，同時(shí)測(cè)定了苜?？傇磉暗暮?，有趣的是總皂苷含量隨著表達(dá)水平的提高同樣呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，總皂苷含量與對(duì)照比增加了15.7%—66.9%。在人參根中發(fā)現(xiàn)SQE與人參皂苷合成量高度相關(guān)，MeJA可誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，同時(shí)增加三萜類化合物的合成量[15]。藥用植物雷公藤的與同樣受到MeJA的誘導(dǎo)表達(dá)，MeJA誘導(dǎo)后，的表達(dá)水平顯著提高，而表達(dá)水平增幅較小[20-21]。樺樹也受ABA與MeJA的誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)MeJA與ABA通過促進(jìn)的表達(dá)對(duì)次生代謝的生物合成進(jìn)行調(diào)節(jié)[24]。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證對(duì)苜蓿皂甙生物合成的功能，將在苜蓿中過表達(dá)。通過分析過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿與轉(zhuǎn)空載體植株中的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量比對(duì)照顯著提高，而且轉(zhuǎn)基因苜?？傇碥蘸恳蚕鄳?yīng)的增加，與對(duì)照相比，提高了14.26%—28.05%，結(jié)果暗示轉(zhuǎn)基因苜蓿中總皂甙含量與的轉(zhuǎn)錄水平具有顯著的相關(guān)性。綜上所述，編碼一種特定的鯊烯環(huán)氧酶，該酶是苜蓿皂甙合成的關(guān)鍵酶，對(duì)苜?？傇磉暗暮铣删哂兄匾恼{(diào)節(jié)作用。

4 結(jié)論

從紫花苜蓿中克隆了皂甙生物合成中的關(guān)鍵限速酶基因鯊烯環(huán)氧酶基因（）。不同物種的MsSQE1均具有2個(gè)高度保守結(jié)構(gòu)域，并且還具有酶特有的結(jié)構(gòu)。對(duì)苜蓿皂甙的合成具有正向調(diào)控作用葉片可能是紫花苜蓿甾醇、三萜類物質(zhì)生物合成的場(chǎng)所。

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Cloningfrom Alfalfa and Functional Analysis in Saponin Synthesis

KANG JunMei, ZHANG QiaoYan, JIANG Xu, WANG Zhen, ZHANG TieJun, LONG RuiCai, CUI HuiTing, YANG QingChuan

(Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100193)

【】Squalene epoxidase (SQE) is a rate-limiting enzyme in sterols and triterpenoids biosynthesis pathway, which is closely related to the synthesis of saponins. This study focused on the regulatory function ofon saponin biosynthesis in alfalfa,【】was isolated from alfalfa based onsequence of model plant. MEGA software was used for bioinformatic analysis of MsSQE1. Subcellular localization of MsSQE1 protein was examined by micro projectile bombardment. qRT-PCR was used to examine tissue-specific expression and the expression patterns ofunder UV radiation, MeJA, ABA and GA3treatments. Theoverexpressing transgenic alfalfa was obtained by-mediated transformation, and the saponins content of the transgenic plants was determined by spectrophotometer【】The cDNA sequence ofwas cloned, which contained an ORF of 1 578 bp encoding a protein of 525 amino acids with an isoelectric point of 8.59. Bioinformatic analysis showed that the deduced of MsSQE1 shared high sequence homology with SQE1 from(98.6%) and(80%). Subcellular localization indicated that MsSQE1 may be located in the cell membrane of onion epidermis. The expression level ofwas highest in leaves compared with stems and roots.was enhanced by the simulation of UV radiation, ABA and GA3. The expression level ofMsSQE1 in leaves was highest in 24 h treated by UV, and in 8 h treated of GA (50 μmol·L-1) and ABA(100 μmol·L-1). Moreover,was upregulated by MeJA, and the enhanced expression ofresulted in theincrease of total saponins. Overexpression ofexpression level was correlated with the contents of saponins. The expression level ofencodes epoxidase and it contributes to the synthesis of saponins inalfalfa.【】This study reported the cloning and functional characterization of squalene epoxidase (SQE) encoding gene from legume forage alfalfa (). Overexpressionaffects the saponin biosynthesis.

L.(alfalfa); squalene epoxidase(); saponins; qRT-PCR

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.02.003

2019-07-02；

2019-09-24

國(guó)家科技部中歐政府間科技合作重點(diǎn)專項(xiàng)（2017YFE0111000）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2017ywf-2d-3）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS14）

康俊梅，tel：010-62816357；E-mail：kangjunmei@caas.cn。通信作者楊青川，E-mail：qchyang66@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）