基于高密度遺傳圖譜定位水稻籽粒大小相關(guān)性狀QTL

張健，楊靖，王豪，李冬秀，楊瑰麗，黃翠紅，周丹華，郭濤，陳志強，王慧

基于高密度遺傳圖譜定位水稻籽粒大小相關(guān)性狀QTL

張健，楊靖，王豪，李冬秀，楊瑰麗，黃翠紅，周丹華，郭濤，陳志強，王慧

（華南農(nóng)業(yè)大學/國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣州 510642）

【】通過對水稻籽粒大小相關(guān)性狀進行QTL定位及候選基因的篩選，為水稻籽粒大小相關(guān)基因的精細定位、克隆及基因功能等研究奠定基礎(chǔ)。以秈稻品種特華占搭載高空氣球空間誘變后產(chǎn)生的特異矮稈突變體CHA-1為母本，以秈稻品種航恢7號搭載“神州八號”飛船經(jīng)空間誘變后篩選出的突變體H335為父本雜交衍生出的275個RIL群體作為供試材料，利用GBS測序技術(shù)構(gòu)建高密度遺傳圖譜，RIL群體及親本分別于2017年早季和2017年晚季在華南農(nóng)業(yè)大學實驗教學基地種植。成熟收獲后通過掃描儀獲取水稻籽粒圖像，利用SmartGrain軟件獲取籽粒大小相關(guān)性狀表型數(shù)據(jù)。采用QTL IciMapping v 4.0軟件基于完備復合區(qū)間作圖法，對水稻籽粒大小相關(guān)性狀進行QTL定位。構(gòu)建的高密度遺傳圖譜包含2 498個Bin標記，總圖距2 371.84 cM，標記間平均遺傳圖距為0.95 cM。兩季共檢測到26個籽粒大小相關(guān)QTL，分布于第1、2、3、4、7和9染色體上，單一QTL貢獻率為0.16%—14.41%。在第1、2、3、7染色體上檢測到5個QTL簇（、、、和）。其中、和與前人報道相似，和是新發(fā)現(xiàn)的籽粒大小相關(guān)QTL，在2個季別的不同性狀中被檢測在同一標記區(qū)間附近，LOD值介于4.00—8.08，貢獻率為6.67%—11.38%。在2個季別下均檢測到與籽粒厚度相關(guān)，LOD值介于2.94—8.59，貢獻率為4.69%—14.41%。使用的高密度遺傳圖譜定位區(qū)間較小，結(jié)合功能注釋和CREP數(shù)據(jù)庫表達譜，在位點篩選到4個潛在的與籽粒大小相關(guān)的注釋基因、、和。其中編碼一個絲氨酸羧肽酶編碼一個泛素E2結(jié)合酶；編碼一個類受體蛋白激酶；編碼一個TCP轉(zhuǎn)錄因子。在位點篩選到3個潛在的與籽粒大小相關(guān)的注釋基因、和。其中編碼一個驅(qū)動蛋白結(jié)構(gòu)域；編碼一個蛋白激酶結(jié)構(gòu)域；編碼一個具有去蛋白質(zhì)泛素化功能的OTU-like半胱氨酸肽酶。其中編碼泛素E2結(jié)合酶的和編碼驅(qū)動蛋白結(jié)構(gòu)域的在幼穗和授粉后的胚乳中表達量較高，推測其為最可能的調(diào)控籽粒大小的候選基因。共檢測到26個水稻籽粒大小相關(guān)QTL。在第1、2、3和7染色體上檢測到5個QTL簇（、、、和），其中和為新發(fā)現(xiàn)的控制籽粒大小QTL，并在該位點篩選到2個可能調(diào)控水稻籽粒大小相關(guān)的候選基因。

水稻；RIL群體；高密度遺傳圖譜；籽粒大??；QTL定位；候選基因

0 引言

【研究意義】水稻是世界上最主要的糧食作物之一，水稻產(chǎn)量相關(guān)的研究是作物科學領(lǐng)域的熱門方向。千粒重是水稻產(chǎn)量的一個重要指標，而水稻籽粒大小是決定千粒重的主要因素之一。對水稻籽粒大小性狀進行精確遺傳解析，對于水稻高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)分子育種具有重要的理論研究價值?！厩叭搜芯窟M展】水稻籽粒大小主要包括粒長、粒寬、粒厚等性狀，前人研究表明，水稻籽粒大小由少量主效QTL和多個微效QTL所控制[1-2]。研究者已經(jīng)通過不同的作圖群體來定位控制水稻籽粒大小的相關(guān)QTL，如F2群體和重組自交系（RIL）群體已被廣泛用于發(fā)掘水稻全基因組中的QTL。此外，與籽粒大小相關(guān)的突變體也是研究水稻器官形態(tài)發(fā)生和發(fā)育的有用材料。國家水稻數(shù)據(jù)中心顯示，目前克隆的影響水稻籽粒大小的基因已經(jīng)超過100多個（http://www.ricedata.cn/ontology/ontology. aspx?ta=TO:0000397）。如控制粒長的基因[3][4][5]；控制粒寬的基因[6]、[7]、[8]、[9]；控制粒厚的基因[10]、[11]、[12]、[13]；控制千粒重的基因[14]、[15]、[16]、[17]等。是第一個被克隆的控制籽粒大小的主效QTL，其編碼的蛋白對粒重起負調(diào)控作用，由于功能的缺失導致水稻籽粒變長。位點上17.1 kb的串聯(lián)重復，會引起表達水平的上調(diào)，并下調(diào)鄰近負調(diào)因子表達，從而增加谷粒的縱向細胞分裂，并減少橫向細胞分裂，導致谷粒變得細長[4]。近年來，雖然在水稻籽粒大小的調(diào)控機制上取得了一些進展，但水稻籽粒大小的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)依然不夠清晰。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，測序成本不斷降低，利用高通量測序技術(shù)可在短時間內(nèi)獲取大量多態(tài)性標記，根據(jù)多態(tài)性標記構(gòu)建高密度遺傳圖譜，為重要農(nóng)藝性狀QTL的挖掘和鑒定提供了有效手段。彭強等[18]借助SLAF-seq技術(shù)開發(fā)的多態(tài)性SLAF標簽構(gòu)建高密度遺傳圖譜，共檢測到22個稻米外觀品質(zhì)QTL。董驥馳等[19]基于包含2 711個Bin標記的高密度遺傳圖譜，在4個環(huán)境下共定位到14個影響水稻抽穗期的QTL。秦偉偉等[20]基于GBS技術(shù)獲得了高密度的SNP位點，構(gòu)建了包含1 262個Bin標記的高密度遺傳圖譜，共檢測到30個玉米籽粒性狀QTL?！颈狙芯壳腥朦c】前人主要使用RFLP、SSR等分子標記連鎖的原理定位QTL，但由于此類分子標記在全基因組的覆蓋率較低，導致定位區(qū)間較大，不能有效地篩選到目標基因。高密度遺傳圖譜相比傳統(tǒng)分子標記構(gòu)建的遺傳圖譜，具有高通量、省時省力、定位區(qū)間小等優(yōu)勢，有利于進一步精確定位和篩選候選基因?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究用秈稻品種特華占空間誘變特異矮稈突變體CHA-1和秈稻品種航恢7號空間突變體H335為親本，雜交并連續(xù)自交6代構(gòu)建含有275個株系的重組自交系為作圖群體，基于GBS技術(shù)構(gòu)建包含2 498個Bin標記的高密度遺傳圖譜，在2個季別下對水稻籽粒大小相關(guān)性狀進行QTL定位分析，并結(jié)合表達譜預測候選基因，為后續(xù)籽粒大小相關(guān)基因的精細定位、克隆及基因功能等研究提供有效基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

CHA-1是由秈稻品種特華占搭載高空氣球誘變后選育出的特異矮稈突變體，H335是由秈稻品種航恢7號搭載“神州八號”飛船經(jīng)空間誘變返回地面后種植篩選出的突變體。以CHA-1為母本，以H335為父本雜交產(chǎn)生F1，F(xiàn)1自交獲得F2，通過單粒傳法，構(gòu)建CHA-1/H335的重組自交系（RIL）群體，連續(xù)自交直至第6代，最終獲得包含275個株系的RIL群體。RIL群體與2個親本于2017年早季和2017年晚季重復種植于華南農(nóng)業(yè)大學實驗教學基地（23.17°N，113.37°E）。早季于2017年2月28日播種育秧，3月31日移栽。晚季于2017年7月22日播種育秧，8月7日移栽。每個株系種6行，每行6株，行株距為20 cm×20 cm，均單本種植，田間管理按當?shù)卮筇锍Ｒ?guī)栽培要求實施。

1.2 表型調(diào)查及數(shù)據(jù)分析

成熟時單株收獲，自然晾干保存，并去除空粒，對每個供試材料表型數(shù)據(jù)測定如下：每個株系隨機選取約50粒飽滿種子置于培養(yǎng)皿中，使用掃描儀（Canon CanoScan 5600F）在300 dpi下獲取種子圖像，利用SmartGrain[21]軟件（http://phenotyping.image. coocan.jp/），參照程序說明，設(shè)置合適的精確度和芒剔除閾值，選擇批量分析模式，可獲得谷粒長（grain length，GL）、谷粒寬（grain width，GW）、圓度（circularity，CS）、長寬比（length-to-width ratio of grain，GLWR）、谷粒周長（perimeter length of grain，PL）和谷粒截面積（area size of grain，AS）等指標。使用電子游標卡尺隨機測量10粒飽滿谷粒的厚度，重復3次，取平均值，計算粒厚（grain thickness，GT）。使用全自動數(shù)粒儀隨機數(shù)取1 000粒飽滿種子，并用電子天平稱重，重復3次，取其平均值，計算千粒重（1000-grain-weight，TGW）。利用Excel 2019對籽粒大小相關(guān)數(shù)據(jù)進行處理，使用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，采用Origin 2017繪制籽粒大小相關(guān)性狀頻數(shù)分布圖。

1.3 DNA提取及高密度遺傳圖譜的構(gòu)建

采用國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心自主開發(fā)的高通量磁珠法提取樣品DNA，具體方法參考陳立凱等[22]方法。基于GBS測序，對275個RIL進行簡化基因組測序，每個株系獲得約0.34 Gb的數(shù)據(jù)。對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控過濾，共獲得770 428 068雙末端reads。其中96.79%可比對到日本晴參考基因組。經(jīng)過序列比對和SNP標記開發(fā)，獲得100 307雙等位純合的SNP位點用于Bin的劃分。將連續(xù)多個SNP標記且具有相同的基因型概括為一個區(qū)塊（Bin），利用其構(gòu)建RIL群體的重組區(qū)塊圖譜（recombination bin map）。以每個重組區(qū)塊作為一個標記，利用HighMap軟件構(gòu)建其高密度遺傳圖譜。

1.4 QTL定位

利用QTL IciMapping V4.0軟件中的完備區(qū)間作圖法對RIL群體的籽粒大小相關(guān)性狀進行QTL作圖及遺傳效應分析，作圖步長為1.00 cM，PIN設(shè)置為0.001，LOD閾值設(shè)置為2.50。并計算每個QTL對水稻籽粒大小相關(guān)性狀的貢獻率和加性效應，QTL命名遵循McCouch等[23]的原則。

1.5 候選基因的篩選

通過群體標記物理位置定位到水稻基因組上，基于水稻參考基因組序列，對標記區(qū)間內(nèi)的候選基因進行分析，根據(jù)水稻基因組注釋網(wǎng)站Rice Genome Annotation Project（http://rice.plantbiology.msu.edu/）對候選基因進行功能注釋和分析，使用擬南芥TAIR（https://www.arabidopsis.org/）中的blast功能查找與候選基因相似的同源序列的基因功能，借助CREP[24]、RiceXPro[25]等公共數(shù)據(jù)庫表達譜分析注釋基因的表達特性，使用R的熱圖函數(shù)pheatmap繪制注釋基因表達譜熱圖。

2 結(jié)果

2.1 親本及重組自交系的籽粒表型分析

對RIL群體及親本CHA-1和H335在2個季別下的8個籽粒相關(guān)性狀表型值進行統(tǒng)計分析（表1），發(fā)現(xiàn)在2017年早季和晚季2個季別下，CHA-1的籽粒大小相關(guān)性狀都要低于H335，而晚季下兩親本的粒長、粒寬、籽粒周長、籽粒截面積和千粒重均比早季有一定程度的增加，粒厚則變化不明顯。親本籽粒大?。▓D1-a）和方差分析表明，兩親本籽粒大小相關(guān)性狀間存在顯著或極顯著的差異（表1）。在CHA-1/H335重組自交系中，籽粒大小表現(xiàn)為廣泛的變異（圖1-b），同時根據(jù)所考察的籽粒大小相關(guān)性狀的頻率分布及偏度、峰度檢驗結(jié)果，可以看出，2個季別下各籽粒大小相關(guān)性狀表型頻率分布均表現(xiàn)為正態(tài)或近似正態(tài)的連續(xù)分布（表1和圖2），呈現(xiàn)出數(shù)量性狀的特征，且存在雙向超親分離現(xiàn)象，符合QTL區(qū)間作圖的要求。

表1 親本CHA-1和H335及重組自交系2個季別下的籽粒大小性狀表現(xiàn)

GL：粒長；GW：粒寬；GT：粒厚；GLWR：長寬比；CS：谷粒圓度；PL：籽粒周長；AS：籽粒截面積；TGW：千粒重。*表示在0.05水平差異顯著；**表示在0.01水平差異顯著。下同

GL: grain length; GW: grain width; GT: grain thickness; GLWR: length-to-width ratio of grain; CS: circularity; PL: perimeter length of grain; AS: area size of grain; TGW: 1000-grain-weight. *: significant at<0.05; **: significant at<0.01. The same as below

2.2 籽粒相關(guān)性狀之間的相關(guān)性

對2個季別下RIL群體籽粒大小相關(guān)性狀的相關(guān)性分析（表2），表明粒長與粒厚、谷粒截面積、谷粒周長、長寬比、千粒重呈極顯著正相關(guān)，其中，由于粒長為谷粒截面積、谷粒周長、長寬比、千粒重的構(gòu)成因素，谷粒周長與粒長的相關(guān)性最高（≥0.987），而谷粒圓度則與粒長呈極顯著負相關(guān)。對于簡單性狀（粒長、粒寬、粒厚）的分析，表明粒寬與粒長無明顯相關(guān)性（=0.062，早季），說明粒長和粒寬有著不同的遺傳基礎(chǔ)，但是粒寬與粒厚具有較高的正相關(guān)性系數(shù)（=0.555，晚季），這與前人研究結(jié)果相符[26-27]。除長寬比和谷粒圓度外，所有籽粒大小相關(guān)性狀都與千粒重呈極顯著正相關(guān)，其中，粒厚與千粒重的相關(guān)性最高（≥0.666）。結(jié)果表明，粒厚是決定千粒重最關(guān)鍵的性狀，而粒長和粒寬對谷粒周長、谷粒截面積、谷粒長寬比和谷粒圓度及千粒重等復合性狀具有不同程度的影響。

a：親本粒型籽粒大小差異（10粒寬）；b：部分重組自交系籽粒大小差異

表2 CHA-1/H335重組自交系群體籽粒大小性狀間相關(guān)性分析

左下：早季；右上：晚季 bottom left: Early season; top right: late season

2.3 CHA-1×H335重組自交系高密度遺傳圖譜

以水稻空間突變體CHA-1/H335組合衍生出的275份重組自交系為作圖群體，利用HighMap通過最大似然法進行遺傳圖譜構(gòu)建，共構(gòu)建12個連鎖群（表3），包含2 498個Bin標記，平均每條染色體上的標記數(shù)為208.17個?？倛D距2 371.84 cM，平均每條染色體覆蓋長度為197.65 cM。相鄰2個Bin標記間的平均遺傳圖距為0.95 cM。第2、3和4號染色體上Bin標記較多，分別達316、313和309個。而第5、7和12染色體上Bin標記較少，分別為138、156和145個。第10染色體的平均圖距最大，達1.77 cM，第2染色體的平均圖距最小，為0.62 cM。連鎖群中最大的Gap位于第10染色體上，為25.61 cM。12條染色體中Gap長度小于5 cM的比例都高于98%，表示圖譜比較均勻，構(gòu)建的高密度遺傳圖譜適合用于水稻相關(guān)農(nóng)藝性狀的QTL定位。

2.4 籽粒大小相關(guān)性狀的QTL定位

利用構(gòu)建的高密度遺傳圖譜，在2個季別下，結(jié)合親本及重組自交系共277個株系的8個籽粒大小相關(guān)性狀的表型數(shù)據(jù)，采用QTL IciMapping V4.0軟件中的完備區(qū)間作圖法對RIL群體的籽粒大小相關(guān)性狀進行QTL作圖及分析。在早季和晚季中共檢測到26個籽粒大小相關(guān) QTL（表4和圖3），分布于第1、2、3、4、7、9染色體的不同位置，LOD值介于2.53—96.99，貢獻率介于0.16%—14.41%。大部分檢測到的QTL都位于同一區(qū)間或相近位置。

E：早季；L：晚季

表3 連鎖圖譜基本信息統(tǒng)計

GL：粒長；GW：粒寬；GT：粒厚；GLWR：長寬比；CS：谷粒圓度；AS：籽粒截面積；PL：籽粒周長；TGW：千粒重；E：早季；L：晚季

PVE：貢獻率；Add.：加性效應。下同 PVE: percentage of variance explained; Add.: additive effect. The same as below

各籽粒大小相關(guān)QTL定位結(jié)果具體如下：

粒長：2個季別下共檢測到5個粒長QTL，分布于第1、2和9染色體，貢獻率介于0.16%—11.07%。其中，在2017年早季被檢測到位于第2染色體上Block3789—Block3802區(qū)間內(nèi)，貢獻率為10.37%。2017年晚季定位到2個貢獻率較高的QTL，分別是和，貢獻率分別為11.07%和8.87%。

粒寬：2個季別下共檢測到2個粒寬QTL。在2017年晚季被檢測到位于第3染色體Block5332—Block5419區(qū)間內(nèi)，貢獻率為5.29%在2017年早季被檢測到位于第3染色體Block6009—Block6012區(qū)間內(nèi)，貢獻率為6.50%。

粒厚：2個季別下共檢測到6個粒厚QTL。分布于第3、4和7染色體，貢獻率介于4.69%—14.41%。其中在2個季別下都被重復檢測到，在2017年早季和2017晚季中，貢獻率分別為4.69%和14.41%。

長寬比：2個季別下共檢測到2個長寬比QTL。分別位于第3和第7染色體上，位于第3染色體Block6004—Block6012區(qū)間內(nèi)，貢獻率為4.22%。位于第7染色體Block12538—Block12681區(qū)間內(nèi)，貢獻率為4.81%。

谷粒圓度：2017年晚季檢測到1個谷粒圓度QTL，位于第7染色體Block12538—Block12681區(qū)間內(nèi)，其貢獻率為4.58%。

谷粒截面積：2個季別下共檢測到3個谷粒截面積QTL，分布于第2和第3染色體上，貢獻率介于4.87%—11.36%。其中和分別位于第2染色體上Block3794—Block3802和Block3789—Block3802區(qū)間內(nèi)，貢獻率分別為7.08%和11.36%。

谷粒周長：2個季別下共檢測到4個谷粒周長QTL，分布于第1、2和9染色體上，貢獻率介于4.50%—11.38%。

千粒重：2個季別下共檢測到3個千粒重QTL，分布于第2和第4染色體上，貢獻率介于4.62%—9.92%。在2017年晚季被檢測到位于第2染色體Block3805—Block3823區(qū)間內(nèi)，貢獻率為9.92%。在2017年早季被檢測到位于第2染色體Block3892—Block3931區(qū)間內(nèi)，貢獻率為6.75%。在2017年晚季被檢測到位于第4染色體Block6738—Block6765區(qū)間內(nèi)，貢獻率為4.62%。

2.5 注釋基因預測分析

共定位到26個籽粒大小相關(guān)QTL，其中有14個QTL存在共定位，成簇的分布在第1、2、3和7染色體的5個區(qū)間，對共定位的QTL重新命名為、、、和（表5）。通過與前人報道QTL及已克隆籽粒大小相關(guān)基因物理位置比對，發(fā)現(xiàn)和為本研究新發(fā)現(xiàn)的籽粒大小相關(guān)QTL?；谒緟⒖蓟蚪M序列及基因組注釋信息，對定位區(qū)間內(nèi)的注釋基因進行分析，通過群體標記物理位置定位到水稻基因組上，所在區(qū)間為Block3794—Block3802，對應物理位置為Chr.2：25 435 879—25 530 071 bp，該區(qū)間包含18個注釋基因。根據(jù)基因組注釋（圖4），在該位點篩選到4個可能影響籽粒大小的相關(guān)基因，分別為、、和，其中編碼一個絲氨酸羧肽酶；編碼一個類受體蛋白激酶；編碼一個TCP轉(zhuǎn)錄因子；而編碼一個泛素E2結(jié)合酶。所在區(qū)間為Block5421—Block5424，對應物理位置為Chr.3：21 695 710—21 786 126 bp。該區(qū)間包含了12個注釋基因，在位點篩選到3個可能影響籽粒大小的相關(guān)基因，分別為、和，其中編碼一個驅(qū)動蛋白結(jié)構(gòu)域，編碼一個蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，編碼一個OTU-like半胱氨酸肽酶。將和兩區(qū)間內(nèi)共30個注釋基因提交到CREP表達譜數(shù)據(jù)庫（http://crep.ncpgr.cn/crep-cgi/home.pl），獲得其中23個注釋基因在明恢63和珍汕97中多個器官/組織和發(fā)育階段表達譜數(shù)據(jù)，并使用R的熱圖函數(shù)pheatmap構(gòu)建了注釋基因的表達譜熱圖（圖4）。表達譜分析表明，在水稻的根、莖、葉、幼穗及授粉后的胚乳中均有表達，但在幼穗和授粉后7 d的胚乳中表達量最高。在水稻幼穗中的表達量最高，為其他組織器官的5—200倍。和則在授粉后14 d的胚乳中的表達量較高。

表5 本研究檢測到的籽粒大小相關(guān)QTL簇

圖中藍色越深代表其表達量越低，紅色越深則表達量越高，基因名稱后面為其基因注釋信息

3 討論

3.1 與前人QTL定位比較

近年來，隨著高通量測序技術(shù)和功能基因組學的飛速發(fā)展，大量的籽粒大小相關(guān)基因被克隆報道，并通過基因編輯等技術(shù)得到了驗證。已報道的水稻籽粒大小基因涉及的調(diào)控途徑主要有泛素-蛋白酶體、G蛋白信號、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號、植物激素感知和穩(wěn)態(tài)、表觀遺傳修飾以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等調(diào)控通路。前人研究結(jié)果表明控制相關(guān)性狀的QTL并不是均勻分布在染色體上的，而是成簇分布在染色體上某個區(qū)域[29-30]，形成一個QTL富集區(qū)域。目前報道克隆的籽粒大小相關(guān)QTL主要集中在第2、3、5和7染色體上。本研究定位到的與前人報道的一個控制粒長的QTL位置一致[31]，同時該區(qū)間也發(fā)現(xiàn)了一個已經(jīng)克隆的影響水稻千粒重的基因[28]。第2染色體上定位到的與劉進等[29]研究所定位到的第3染色體上同時控制粒厚和長寬比的QTL區(qū)間一致。在第7染色體上定位到了一個控制籽粒長寬比和圓度的QTL，分別是和，為同一QTL位點，命名為，在該區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)了已經(jīng)克隆的控制粒長和粒寬的基因[4]。是一個控制粒厚的QTL，被重復定位于第3染色體Block5421—Block5424區(qū)間內(nèi)，物理位置Chr.3：21 695 710—21 786 126 bp。前人研究克隆的粒型主效基因位于染色體上物理位置chr.3：16 729 501—16 735 109 bp，粒長基因則位于染色體上物理位置chr.3：25 042 315—25 051 072 bp，本研究定位的與已克隆的和的物理位置表明三者不是同一基因。水稻籽粒大小作為一個數(shù)量性狀，受少數(shù)主效位點和多個微效位點所控制，且各性狀之間相互影響。本研究定位到的QTL從貢獻率上來說，大部分是一些微效QTL。與前人研究比較發(fā)現(xiàn)，部分檢測到的QTL與已經(jīng)定位或克隆的籽粒大小相關(guān)基因區(qū)間一致，表明本研究結(jié)果較為可靠，同時也檢測到了一些新的籽粒大小相關(guān)QTL。

3.2 QTL定位+表達譜預測候選基因

水稻籽粒的大小受母體植株，胚和胚乳等不同的遺傳體系所控制[32]。闡明水稻基因組中所有預測基因的功能不僅是植物分子生物學基礎(chǔ)研究的終極目標，也是基因組學應用方面的最終目標，可以加速水稻品種的改良。通過基因表達譜分析獲得有關(guān)器官/組織和發(fā)育階段基因表達特異性的信息，可以更全面地理解基因的功能。本研究通過構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜對水稻籽粒大小相關(guān)性狀進行QTL定位，并基于基因組注釋和表達譜分析篩選遺傳位點內(nèi)的候選基因。在對應的第2染色體94.19 kb物理區(qū)間內(nèi)篩選到4個潛在的籽粒大小相關(guān)基因，其中編碼一個絲氨酸羧肽酶OsSCP8。前人對SCP基因家族的研究表明，是一個參與ABA信號轉(zhuǎn)導來調(diào)控水稻灌漿和休眠過程中重要的調(diào)控基因，在發(fā)育中的種子中特異表達，其突變體表現(xiàn)為籽粒變小[33]。泛素-蛋白酶體降解途徑已被證實為水稻粒型重要調(diào)控途徑之一[32]。如水稻中編碼一個環(huán)型E3泛素連接酶，研究表明，功能的缺失將導致泛素不能轉(zhuǎn)移到靶蛋白上，從而不能特異識別本應降解的底物，進而激活穎花外殼細胞的分裂，導致穎殼寬度增加[6]。編碼一個泛素E2結(jié)合酶，表達譜分析表明，在水稻的根、莖、葉、幼穗、授粉后的胚乳中均有表達，在幼穗和授粉后7 d的胚乳中表達量最高，推測其可能參與了泛素-蛋白酶體降解途徑介導的水稻籽粒大小調(diào)控。編碼一個類受體蛋白激酶，序列比對表明，其可能存在與擬南芥相似的功能結(jié)構(gòu)域，是BR信號的受體激酶，大量研究表明，BR的生物合成和信號傳導參與了水稻粒型調(diào)控[34]。推測可能與BR介導的水稻粒型調(diào)控有關(guān)。編碼一個TCP轉(zhuǎn)錄因子，TCP家族基因是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，在植物發(fā)育中起重要作用。有研究表明，在小麥幼穗中表達量較高，其突變體較野生型具有更長的籽粒[35]。研究者通過對小麥全轉(zhuǎn)錄組分析，在小麥中鑒定了59個TCP家族轉(zhuǎn)錄因子，其中在小麥籽粒中表達的有48個，表明TCP轉(zhuǎn)錄因子可能對小麥籽粒的發(fā)育起重要作用[36]。表達譜分析證實了在水稻幼穗中的表達量要顯著高于其他組織，推測其可能與水稻幼穗的生長發(fā)育密切相關(guān)，進而影響水稻籽粒的大小。

對應第3染色體90 kb的物理區(qū)間，該區(qū)間共有12個注釋基因，篩選得到3個潛在的籽粒大小相關(guān)基因，其中編碼一個驅(qū)動蛋白結(jié)構(gòu)域，表達譜分析表明，其在水稻幼穗中的表達量最高，為其他組織器官的5—200倍。水稻中/編碼驅(qū)動蛋白，調(diào)控細胞周期和細胞壁的屬性，可導致小粒[37]；為驅(qū)動蛋白13基因家族成員，影響細胞縱向長度，突變體的種子表現(xiàn)為小粒圓形[38]。推測可能參與了小穗殼的生長發(fā)育過程，通過影響穗殼大小，進而影響水稻穎果的大小。編碼一個蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，表達譜分析表明，其在授粉后14 d的胚乳中的表達量較高。編碼一個OTU-like半胱氨酸肽酶，具有去蛋白質(zhì)泛素化功能，表達譜分析表明，其在授粉后第14天和第21天的表達量較高。泛素化和去泛素化是可逆過程，最近研究發(fā)現(xiàn)，去泛素化在調(diào)控植物器官大小中同樣起著重要作用，是近年來報道的一個粒寬和粒厚調(diào)控基因，具有去泛素化酶活性，主要是通過影響穎殼細胞的擴展從而控制水稻籽粒的大小和形狀[13]。據(jù)此推測也可能有類似的功能。

除此之外，其他定位到的QTL區(qū)間也存在一些與籽粒大小調(diào)控相關(guān)可能性較高的注釋基因，主要涉及一些泛素連接酶相關(guān)組分以及蛋白激酶相關(guān)的基因。基因注釋和表達譜分析表明，編碼泛素E2結(jié)合酶的和編碼驅(qū)動蛋白結(jié)構(gòu)域的為最有可能的調(diào)控籽粒大小的候選基因。為了進一步的確定調(diào)控籽粒大小的候選基因，下一步可對候選基因擴增后測序分析，確定其變異位點，使用實時熒光定量PCR驗證表達譜數(shù)據(jù)，分析其組織表達特性，并通過轉(zhuǎn)基因等手段驗證其功能。

4 結(jié)論

構(gòu)建了包含12條染色體的水稻高密度遺傳圖譜，該圖譜包含2 498個Bin標記，總圖距2 371.84 cM，相鄰2個Bin標記間的平均遺傳圖距為0.95 cM。在2個季別下對材料CHA-1/H335衍生的重組自交系群體共檢測到26個水稻籽粒形態(tài)大小相關(guān)QTL。在第1、2、3和7染色體上檢測到5個QTL簇（、、、和），其中和為新的控制籽粒大小QTL。定位區(qū)間共有18個注釋基因，定位區(qū)間共有12個注釋基因，基于基因注釋和表達譜分析，篩選了幾個潛在的候選基因，分別是位點的、、和；位點的、和其中編碼泛素E2結(jié)合酶的和編碼驅(qū)動蛋白結(jié)構(gòu)域的為最有可能的調(diào)控籽粒大小的候選基因。

[1] Xing Y Z, Zhang Q F. Genetic and molecular bases of rice yield., 2010, 61(1): 421-442.

[2] Huang R Y, Jiang L R, Zheng J S, Wang T S, Wang H C, Huang Y M, Hong Z L. Genetic bases of rice grain shape: so many genes, so little known., 2013, 18(4): 218-226.

[3] Fan C C, Xing Y Z, Mao H L, Lu T T, Han B, Xu C G, Li X H, Zhang Q F. GS3, a major QTL for grain length and weight and minor QTL for grain width and thickness in rice, encodes a putative transmembrane protein., 2006, 112(6): 1164-1171.

[4] Wang Y X, Xiong G S, Hu J, Jiang L, Yu H, Xu J, Fang Y X, Zeng L J, Xu E B, Xu J, Ye W J, Meng X B, Liu R F, Chen H Q, Jing Y H, Wang Y H, Zhu X D, Li J Y, Qian Q. Copy number variation at the GL7 locus contributes to grain size diversity in rice., 2015, 47: 944.

[5] Qi P, Lin Y S, Song X J, Shen J B, Huang W, Shan J X, Zhu M Z, Jiang L W, Gao J P, Lin H X. The novel quantitative trait locus GL3.1 controls rice grain size and yield by regulating Cyclin-T1;3., 2012, 22: 1666.

[6] Song X J, Huang W, Shi M, Zhu M Z, Lin H X. A QTL for rice grain width and weight encodes a previously unknown RING-type E3 ubiquitin ligase., 2007, 39: 623.

[7] Liu J F, Chen J, Zheng X M, Wu F Q, Lin Q B, Heng Y Q, Tian P, Cheng Z J, Yu X W, Zhou K N, Zhang X, Guo X P, Wang J L, Wang H Y, Wan J M. GW5 acts in the brassinosteroid signalling pathway to regulate grain width and weight in rice., 2017, 3: 17043.

[8] Xu C J, Liu Y, Li Y B, Xu X D, Xu C G, Li X H, Xiao J H, Zhang Q F. Differential expression of GS5 regulates grain size in rice., 2015, 66(9): 2611-2623.

[9] Shi C, Ren Y L, Liu L L, Wang F, Zhang H, Tian P, Pan T, Wang Y F, Jing R N, Liu T Z, Wu F Q, Lin Q B, Lei C L, Zhang X, Zhu S S, Guo X P, Wang J L, Zhao Z C, Wang J, Zhai H Q, Cheng Z J, Wan J M. Ubiquitin specific protease 15 has an important role in regulating grain width and size in rice., 2019:180 (1):381-391.

[10] She K, Kusano H, Koizumi K, Yamakawa H, Hakata M, Imamura T, Fukuda M, Naito N, Tsurumaki Y, Yaeshima M, Tsuge T, Matsumoto K, Kudoh M, Itoh E, Kikuchi S, Kishimoto N, Yazaki J, Ando T, Yano M, Aoyama T, Sasaki T, Satoh H, Shimada H. A novel factor FLOURY ENDOSPERM2 is involved in regulation of rice grain size and starch quality., 2010, 22(10): 3280-3294.

[11] Xu F, Fang J, Ou S J, Gao S P, Zhang F X, Du L, Xiao Y H, Wang H R, Sun X H, Chu J F, Wang G D, Chu C C. Variations in CYP78A13 coding region influence grain size and yield in rice., 2015, 38(4): 800-811.

[12] Chen J, Gao H, Zheng X M, Jin M N, Weng J F, Ma J, Ren Y L, Zhou K N, Wang Q, Wang J, Wang J L, Zhang X, Cheng Z J, Wu C Y, Wang H Y, Wan J M. An evolutionarily conserved gene, FUWA, plays a role in determining panicle architecture, grain shape and grain weight in rice., 2015, 83(3): 427-438.

[13] Huang K, Wang D K, Duan P G, Zhang B L, Xu R, Li N, Li Y H. WIDE AND THICK GRAIN 1, which encodes an otubain-like protease with deubiquitination activity, influences grain size and shape in rice., 2017, 91(5): 849-860.

[14] Song X J, Kuroha T, Ayano M, Furuta T, Nagai K, Komeda N, Segami S, Miura K, Ogawa D, Kamura T, Suzuki T, Higashiyama T, Yamasaki M, Mori H, Inukai Y, Wu J, Kitano H, Sakakibara H, Jacobsen S E, Ashikari M. Rare allele of a previously unidentified histone H4 acetyltransferase enhances grain weight, yield, and plant biomass in rice., 2015, 112(1): 76-81.

[15] Ishimaru K, Hirotsu N, Madoka Y, Murakami N, Hara N, Onodera H, Kashiwagi T, Ujiie K, Shimizu B, Onishi A, Miyagawa H, Katoh E. Loss of function of the IAA-glucose hydrolase gene TGW6 enhances rice grain weight and increases yield., 2013, 45: 707.

[16] Ying J Z, Ma M, Bai C, Huang X H, Liu J L, Fan Y Y, Song X J. TGW3, a major QTL that negatively modulates grain length and weight in rice., 2018, 11(5): 750-753.

[17] Lian J, Sun X J, Li Y C. GS6, a member of the GRAS gene family, negatively regulates grain size in rice., 2013, 55(10): 938-949.

[18] 彭強, 李佳麗, 張大雙, 姜雪, 鄧茹月, 吳健強, 朱速松. 不同環(huán)境基于高密度遺傳圖譜的稻米外觀品質(zhì)QTL定位. 作物學報,2018, 44(08): 1248-1255.

Peng Q, Li J L, Zhang D S, Jiang X, Deng R Y, Wu J Q, Zhu S S.QTL mapping for rice appearance quality traits based on a high-density genetic map in different environments., 2018, 44(8): 1248-1255. (in Chinese)

[19] 董驥馳, 楊靖, 郭濤, 陳立凱, 陳志強, 王慧. 基于高密度Bin圖譜的水稻抽穗期QTL定位. 作物學報, 2018, 44(6): 938-946.

Dong J C, Yang J, Guo T, Chen L K, Chen Z Q, Wang H.QTL Mapping for heading date in rice using high-density bin map., 2018, 44(6): 938-946. (in Chinese)

[20] 秦偉偉, 李永祥, 李春輝, 陳林, 吳迅, 白娜, 石云素, 宋燕春, 張登峰, 王天宇, 黎裕. 基于高密度遺傳圖譜的玉米籽粒性狀QTL定位. 作物學報,2015, 41(10): 1510-1518.

Qin W W, Li Y X, Li C H, Chen L, Wu X, Bai N, Shi Y S, Song Y C, Zhang D F, Wang T Y, Li Y.QTL Mapping for kernel related traits based on a high-density genetic map., 2015, 41(10): 1510-1518. (in Chinese)

[21] Tanabata T, Shibaya T, Hori K, Ebana K, Yano M. SmartGrain: High-Throughput phenotyping software for measuring seed shape through image analysis., 2012, 160(4): 1871-1880.

[22] Chen L K, Gao W W, Guo T, Huang C H, Huang M, Wang J F, Xiao W M, Yang G L, Liu Y Z, Wang H, Chen Z Q. A genotyping platform assembled with high-throughput DNA extraction, codominant functional markers, and automated CE system to accelerate marker-assisted improvement of rice., 2016, 36(9): 123.

[23] Mccouch S R. Gene nomenclature system for rice., 2008, 1(1): 72-84.

[24] Wang L, Xie W B, Chen Y, Tang W J, Yang J Y, Ye R J, Liu L, Lin Y J, Xu C G, Xiao J H, Zhang Q F. A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice., 2010, 61(5): 752-766.

[25] Sato Y, Takehisa H, Kamatsuki K, Minami H, Namiki N, Ikawa H, Ohyanagi H, Sugimoto K, Antonio B A, Nagamura Y. RiceXPro Version 3.0: expanding the informatics resource for rice transcriptome., 2012, 41(D1): D1206-D1213.

[26] 郭詠梅, 穆平, 劉家富, 李自超, 盧義宣. 水、旱栽培條件下稻谷粒型和粒重的相關(guān)分析及其QTL定位. 作物學報, 2007(1): 50-56.

Guo Y M, Mu P, Liu J F, Li Z C, Lu Y X. Correlation Analysis and QTL mapping of grain shape and grain weight in rice under upland and lowland environments., 2007(1): 50-56. (in Chinese)

[27] 張穎慧, 謝永楚, 董少玲, 張亞東, 陳濤, 趙慶勇, 朱鎮(zhèn), 周麗慧, 姚姝, 趙凌, 王才林. 利用水稻秈粳重組自交系群體研究粒型性狀與千粒重的相關(guān)性. 江蘇農(nóng)業(yè)學報, 2012, 28(2): 231-235.

Zhang Y H, Xie Y C, Dong S L, Zhang Y D, Chen T, Zhao Q Y, Zhu Z, Zhou L H, Yao S, Zhao L, Wang C L.Correlations between grain shape traits and 1000-grain weight usingrice recombinant inbred lines., 2012, 28(2): 231-235. (in Chinese)

[28] Kong W Y, Yu X W, Chen H Y, Liu L L, Xiao Y J, Wang Y L, Wang C L, Lin Y, Yu Y, Wang C M, Jiang L, Zhai H Q, Zhao Z G, Wan J M. The catalytic subunit of magnesium- protoporphyrin IX monomethyl ester cyclase forms a chloroplast complex to regulate chlorophyll biosynthesis in rice., 2016, 92(1): 177-191.

[29] 劉進, 姚曉云, 王棋, 李慧, 王嘉宇, 黎毛毛. 不同生態(tài)環(huán)境下籽粒大小相關(guān)性狀QTL定位. 華北農(nóng)學報, 2018, 33(2): 133-138.

Liu J, Yao X Y, Wang Q, Li H, Wang J Y, Li M M.QTL mapping of seed size traits under different environment in rice.,2018, 33(2): 133-138. (in Chinese)

[30] 逯臘虎, 楊斌, 張婷, 張偉, 袁凱, 史曉芳, 彭惠茹, 倪中福, 孫其信. 冬小麥旗葉大小及籽粒相關(guān)性狀的QTL分析. 華北農(nóng)學報, 2018, 33(5): 1-8.

Lu L H, Yang B, Zhang T, Zhang W, Yuan K, Shi X F, Peng H R, Ni Z F, Sun Q X.Quantitative trait loci analysis of flag leaf size and grain relative traits in winter wheat., 2018, 33(5): 1-8. (in Chinese)

[31] Wan X Y, Wan J M, Weng J F, Jiang L, Bi J C, Wang C M, Zhai H Q. Stability of QTLs for rice grain dimension and endosperm chalkiness characteristics across eight environments., 2005, 110(7): 1334-1346.

[32] 劉喜, 牟昌鈴, 周春雷, 程治軍, 江玲, 萬建民. 水稻粒型基因克隆和調(diào)控機制研究進展. 中國水稻科學, 2018, 32(1): 1-11.

Liu X, Mou C L, Zhou C L, Cheng Z J, Jiang L, Wan J M.Research progress on cloning and regulation mechanism of rice grain shape genes., 2018, 32(1): 1-11. (in Chinese)

[33] 李志永. 水稻種子特異表達基因SCP46的克隆及功能鑒定[D]. 杭州: 中國農(nóng)業(yè)科學院, 2017.

Li Z Y. Cloning and functional identification of A seed-specific gene SCP46 in rice[D]. Hangzhou: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2017. (in Chinese)

[34] Zhang B W, Wang X L, Zhao Z Y, Wang R J, Huang X H, Zhu Y L, Yuan L, Wang Y C, Xu X D, Burlingame A L, Gao Y J, Sun Y, Tang W Q. OsBRI1 activates BR signaling by preventing binding between the TPR and kinase domains of OsBSK3 via phosphorylation., 2016, 170(2): 1149-1161.

[35] Zhao J M, Zhai Z W, Li Y N, Geng S F, Song G Y, Guan J T, Jia M L, Wang F, Sun G L, Feng N, Kong X C, Chen L, Mao L, Li A L. Genome-wide identification and expression profiling of the TCP family genes in spike and grain development of wheat (L.)., 2018, 9: 1282.

[36] Chi Q, Guo L J, Ma M, Zhang L J, Mao H D, Wu B W, Liu X L, Ramirez-Gonzalez R H, Uauy C, Appels R, Zhao H X. Global transcriptome analysis uncovers the gene co-expression regulation network and key genes involved in grain development of wheat (L.)., 2019, 19: 853-866.

[37] Zhang M, Zhang B C, Qian Q, Yu Y C, Li R, Zhang J W, Liu X L, Zeng D L, Li J Y, Zhou Y H. Brittle?Culm?12, a dual-targeting kinesin-4 protein, controls cell-cycle progression and wall properties in rice., 2010, 63(2): 312-328.

[38] Kitagawa K, Oki K, Kurinami S, Abe Y, Iwasaki Y, Kono I, Ando T, Yano M, Kitano H. A novel kinesin 13 protein regulating rice seed length., 2010, 51(8): 1315-1329.

QTL Mapping for Grain Size Related Traits Based on a High-Density Map in Rice

Zhang Jian, Yang Jing, Wang Hao, Li DongXiu, Yang GuiLi, Huang CuiHong, Zhou DanHua, Guo Tao, Chen ZhiQiang, Wang Hui

(South China Agricultural University/National Engineering Research Center of Plant Space Breeding, Guangzhou 510642)

【】Combine QTL mapping for grain size and related traits and screening for candidate genes to lay a good foundation for dissecting genes regulating rice grain size and related traits.【】A dwarf mutant CHA-1 screened from the progeny of therice variety Tehuazhan carried by high altitude balloon was hybridized with another mutant H335 selected from the progeny of therice variety Hanghui 7 induced by “Shenzhou 8” spaceflight. A population of 275 recombinant inbred lines (RILs) was structured from CHA-1 ×H335. A high-density genetic map was constructed using genotyping by sequencing (GBS) technology. The RIL population and parents were grown in the experimental base of South China Agricultural University consecutively in the early and late season in 2017. After ripening, rice grain images were scanned, and the grain size and related traits was obtained by SmartGrain software. QTL mapping for rice grain size and related traits was done with QTL IciMapping v 4.0 software based on inclusive composite interval mapping (ICIM).【】The constructed high-density genetic map contains 2498 Bin markers ,and all the markers covers 2371.84 cM with an average genetic distance of 0.95 cM/marker. A total of 26 grain-size related QTLs were repeatedly detected on Chr.1, Chr.2, Chr.3, Chr.4, Chr.7 and Chr.9 in the two seasons with single QTL contribution rate ranged from 0.16% to 14.41%. Five QTL clusters (,,,,) were detected on Chr.1, Chr.2, Chr.3, and Chr.7. Among them,,, andhave been previously reported.andwere novel grain-size related QTLs.was repeatedly detected in the same marker interval in the two seasons, and its LOD values in the early and late season were 8.08 and 4.00 with the phenotypic contribution rate 11.38% and 6.67%, respectively.was detectedto be correlated with grain thickness in the two seasons, and its LOD values in the early and late season were 2.94 and 8.59 with the phenotypic contribution rates 4.69% and 14.41%, respectively. Combined with functional annotation and CREP database of gene expression profiles, four candidate grain-size related genes including,,andwere screened out in thelocus.encodes a serine carboxypeptidase homologue;encodes a ubiquitin-conjugating enzyme;encodes a protein kinase domain containing protein;encodes aTCP domain containing protein. Three candidate grain-size related genes including,andwere screened out in thelocus.encodes a kinesin motor domain containing protein;encodes a protein kinase domain containing protein;encodes an OTU-like cysteine protease family protein. Among the genes,andwere highly expressed in the young panicle and endosperm after pollination and recognized as the most possible candidate genes for regulating grain size.【】26 rice grain-size related QTLs were detected. Five QTL clusters (,,,,) were detected on Chr1, Chr.2, Chr.3, and Chr.7, andandwere novel QTLs for regulating grain size,and two candidate genes were screened out in this locus.

rice; RIL population; high-density genetic map; grain size; grain shape; QTL mapping; candidate gene

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.02.001

2019-05-29；

2019-07-19

國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0100104）

張健，E-mail：cheung_jane@foxmail.com。通信作者王慧，Tel：020-85283237；E-mail：wanghui@scau.edu.cn

（責任編輯 李莉）