雙歧桿菌對(duì)壞死性小腸結(jié)腸炎新生小鼠腸組織的保護(hù)作用

鄧沁，郭春寶

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院肝膽外科/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際合作基地/兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(neonatal necrotizing enterocolitis，NEC)是新生兒期常見的嚴(yán)重消化道疾病，主要發(fā)生于早產(chǎn)兒。近年來(lái)，隨著早產(chǎn)兒存活率的增高，NEC發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，體重<1500 g的極低出生體重(very low birth weight，VLBW)兒的NEC發(fā)病率為7%，病死率為20%～30%[1-4]。NEC是多因素綜合作用的結(jié)果，其中缺血缺氧、異常細(xì)菌定植、配方奶喂養(yǎng)等被認(rèn)為是其主要危險(xiǎn)因素[5-6]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群與NEC發(fā)病密切相關(guān)，而無(wú)菌動(dòng)物模型不會(huì)發(fā)生NEC[7]，母乳喂養(yǎng)可降低NEC的發(fā)生率[8]，抗菌藥物的長(zhǎng)時(shí)間使用可增高NEC的發(fā)生率[9]，表明腸道菌群在NEC發(fā)生發(fā)展中起重要作用。雙歧桿菌是人類腸道共生菌中一類重要的菌群。早產(chǎn)兒腸道中無(wú)雙歧桿菌，在出生數(shù)周甚至數(shù)月后，才會(huì)逐漸出現(xiàn)。大量研究表明，雙歧桿菌在NEC的防治中發(fā)揮著重要作用，其作用機(jī)制主要包括降低炎癥反應(yīng)及腸道通透性，保持腸道上皮完整性等[10-11]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，在NEC動(dòng)物模型中，雙歧桿菌數(shù)量明顯減少，經(jīng)糞菌移植(fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)后，其數(shù)量明顯增加，且FMT能夠通過(guò)影響內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的活性減輕NEC[12]。由此推測(cè)，雙歧桿菌可能在調(diào)節(jié)eNOS活性、減輕腸道氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。本研究建立NEC小鼠模型并給予雙歧桿菌干預(yù)，檢測(cè)腸組織eNOS活性及蛋白表達(dá)，超氧陰離子(superoxide，)、一氧化氮(nitric oxide，NO)含量，以及IL-6、IL-1β的mRNA和蛋白表達(dá)情況，探討雙歧桿菌對(duì)NEC的保護(hù)作用，以期為益生菌在NEC防治中的應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑Similac配方奶(Abbott Laboratories，美國(guó))；貝克幼犬奶粉(Pet-Ag，美國(guó))，嬰兒雙歧桿菌(北納生物科技有限公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PMSF蛋白酶抑制劑混合物、IP裂解液、NO檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；eNOS抗體(Abcam，英國(guó))；β-actin抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋生物有限公司)；eNOS活性檢測(cè)試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)；MRS培養(yǎng)基、L-半胱氨酸、PVDF膜、檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；組織RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green series(TaKaRa，日本)；IL-6、IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組及處理 SPF級(jí)8日齡C57BL/6新生小鼠(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，中國(guó))60只，雌雄不限，體重2.5～4.5 g，隨機(jī)分為對(duì)照組、壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)組、雙歧桿菌干預(yù)(NEC+BIF)組，每組20只。對(duì)照組小鼠出生后母乳喂養(yǎng)；NEC組小鼠置于保育箱(溫度36±1 ℃，濕度45%～60%)中，參照文獻(xiàn)[13]的方法配制代乳品，灌胃喂養(yǎng)，每次0.03～0.04 ml/g，1次/4 h，將小鼠置于100%氮?dú)?N2)缺氧箱中，缺氧30 s，隨后置于4 ℃冰箱中，冷刺激10 min，每日10:00、14:00、22:00分別行1次缺氧冷刺激，連續(xù)3d；NEC+BIF組小鼠在NEC模型建立前2 h，給予1×107cfu/0.1 ml嬰兒雙歧桿菌菌液灌胃，1次/d，共3 d。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合國(guó)家和單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和使用規(guī)定。

1.3 方法

1.3.1 一般情況觀察 觀察新生小鼠的活動(dòng)、腹脹、腹瀉等情況，記錄建模前后小鼠的體重。

1.3.2 標(biāo)本收集及小鼠腸組織病理形態(tài)學(xué)觀察建模后，禁食12 h，斷頭處死小鼠，留取回盲部腸組織，部分行eNOS活性、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，其余-80 ℃凍存行其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。取十二指腸至直腸，肉眼觀察腸組織病理形態(tài)學(xué)變化；取1～2 cm近回盲部腸組織，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片、HE染色、封片，光學(xué)顯微鏡觀察腸組織病理形態(tài)學(xué)變化。參照Liu等[14]采用的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，雙盲法行腸組織病理學(xué)評(píng)分，評(píng)分≥2分確認(rèn)為NEC，每例標(biāo)本選取3個(gè)視野，取平均值作為每例標(biāo)本的評(píng)分值。

1.3.3 腸組織eNOS蛋白表達(dá)及活性檢測(cè)

1.3.3.1 Western blotting檢測(cè)eNOS蛋白表達(dá)取-80 ℃凍存腸組織，每20 mg組織加入100 ml含蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(濃度為1 mmol/L)的裂解液，組織勻漿，4 ℃下14 000×g離心5 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白含量，取20 μg總蛋白樣品進(jìn)行凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5% BSA室溫封閉1 h，加入一抗(抗eNOS抗體，1:1000；抗β-actin抗體，1:4000)4 ℃孵育過(guò)夜，加入羊抗兔IgG二抗(1:3000)室溫?fù)u床震蕩孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，用Image J軟件分析，以目的條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度值比值表示eNOS蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3.2 eNOS活性檢測(cè) 取新鮮腸組織，每100 mg組織加入1 ml裂解液，組織勻漿，4 ℃下16 000×g離心10 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白含量，取50 μg總蛋白樣本，按照eNOS活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作。

1.3.4.2 NO含量檢測(cè) 取-80 ℃凍存腸組織，每20 mg組織加入100 μl IP裂解液，組織勻漿，充分裂解，14 000×g離心5 min，取上清，按照NO檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作。

1.3.5 腸組織IL-6、IL-1β的mRNA和蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

1.3.5.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-6、IL-1β的mRNA表達(dá)水平 取新鮮腸組織，按照RNA提取試劑盒步驟提取總RNA，NanoDrop 2000測(cè)定每例樣本的RNA濃度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA，得到cDNA，采用Bio-Rad CFX90 Real-time PCR儀，以cDNA為模板，分別對(duì)IL-6、IL-1β進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30s；95 ℃變性5s，55 ℃退火5 s，65 ℃延伸5s，共39個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法分析IL-6、IL-1β的mRNA表達(dá)水平。引物序列如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer of real-time PCR

1.3.5.2 ELISA法檢測(cè)IL-6、IL-1β蛋白的表達(dá)水平 取-80 ℃凍存腸組織，每20 mg組織加入100 μl含苯甲基磺酰氟(1 mmol/L)的PBS，勻漿，4 ℃下14 000×g離心10 min，取上清，采用ELISA法檢測(cè)IL-6、IL-1β的蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布及方差齊性的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)性或方差齊性的計(jì)量資料以中位數(shù)(M)表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物一般情況 對(duì)照組小鼠皮下脂肪豐滿，無(wú)腹瀉、腹脹，活動(dòng)度好。NEC組小鼠建模第2天開始出現(xiàn)腹脹、腹瀉，活動(dòng)減少，外觀變瘦；NEC+BIF組小鼠以上表現(xiàn)出現(xiàn)較晚且輕。3組小鼠建模前后體重變化如表2所示。

表2 3組新生小鼠建模前后的體重變化(n=20, ±s)Tab.2 Variation of body weight after modeling in mice of three groups (n=20,±s)

表2 3組新生小鼠建模前后的體重變化(n=20, ±s)Tab.2 Variation of body weight after modeling in mice of three groups (n=20,±s)

與對(duì)照組比較，(1)P<0.05；與NEC組比較，(2)P<0.05。

組別 建模前(g) 建模后(g)對(duì)照組 4.11±0.13 4.68±0.17 NEC組 4.24±0.11 3.77±0.13(1)NEC+BIF組 4.22±0.11 3.98±0.14(1)(2)

2.2 腸組織病理形態(tài)學(xué)變化情況 大體觀察可見，對(duì)照組小鼠腸組織呈淡黃色，無(wú)積氣、出血樣改變，彈性佳；NEC組小鼠腸組織積氣明顯，易破損，部分小鼠回腸末端及結(jié)腸有出血、發(fā)黑等改變；NEC+BIF組小鼠腸組織大部分呈淡黃色，部分可見回結(jié)腸充氣及串珠樣改變。光鏡觀察見對(duì)照組小鼠腸組織結(jié)構(gòu)連續(xù)完整，腺體排列整齊，絨毛高聳，黏膜、黏膜下及固有層緊密連接無(wú)分離；NEC組小鼠腸組織形態(tài)紊亂，絨毛變性水腫，部分壞死脫落，肌層變薄、斷裂，散亂排布；NEC+BIF組小鼠腸組織絨毛及部分黏膜及黏膜下層水腫，黏膜及黏膜下層與固有層未見明顯分離(圖1)。雙盲法病理學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NEC組小鼠腸組織評(píng)分值(3.14±0.38vs.0.43±0.25)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與NEC組相比，NEC+BIF組小鼠腸組織評(píng)分值(1.29±0.36vs.3.14±0.38)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 腸組織eNOS蛋白表達(dá)及活性比較 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，各組小鼠腸組織eNOS蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2A)。與對(duì)照組相比，NEC組小鼠腸組織eNOS活性[(22.25±4.69) nmol/(mg.h)vs.(44.86±9.40) nmol/(mg.h)]明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與NEC組相比，NEC+BIF組小鼠腸組織活性[(33.33±4.96) nmol/(mg.h)vs.(22.25±4.69) nmol/(mg.h)]明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2B)。

圖1 新生小鼠腸組織大體及鏡下觀察Fig.1 Visual and histopathological observation of intestinal tissue among the three groups

圖2 新生小鼠腸組織eNOS蛋白表達(dá)及活性比較(n=20)Fig.2 Protein expression and activity of eNOS among the three groups (n=20)

2.5 腸組織IL-6、IL-1β的mRNA、蛋白表達(dá)水平比較 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NEC組小鼠腸組織中IL-6、IL-1β的mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與NEC組比較，NEC+BIF組小鼠腸組織中IL-1β的mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IL-6的mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖4A)。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NEC組小鼠腸組織IL-6[(135.51±37.41) pg/mlvs.(60.34±9.51) pg/ml]、IL-1β[(638.38±55.26) pg/mlvs.(370.88±157.25) pg/ml]蛋白表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0 5)；與N EC組比較，N EC+B I F組 小鼠腸組織IL-6[(78.24±16.60) pg/ml]、IL-1β[(473.84±52.06) pg/ml]蛋白表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4B)。

圖3 新生小鼠腸組織NO、含量比較Fig.3 Comparison of NO, contents among the three groups

圖4 新生小鼠腸組織IL-1β、IL-6的mRNA(A)及蛋白(B)表達(dá)水平比較Fig.4 mRNA (A) and protein (B) expression of IL-1β and IL-6 in the three groups

3 討 論

NEC是由多種因素導(dǎo)致的腸道屏障弱化、細(xì)菌移位、炎癥反應(yīng)加劇、上皮損傷并形成惡性循環(huán)的一種獲得性疾病[3]。目前，缺血缺氧仍被認(rèn)為是引起NEC的重要因素之一，其可導(dǎo)致氧化應(yīng)激，影響控制微血管張力相關(guān)因子的產(chǎn)生[15]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，eNOS與NEC發(fā)病密切相關(guān)。Yazji等[16]的研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞Toll樣受體4(Toll like receptor，TLR4)信號(hào)通路激活后通過(guò)下調(diào)eNOS降低腸道微循環(huán)灌注，加重NEC。Drucker等[17]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，敲除eNOS基因的小鼠腸道損傷更嚴(yán)重。在正常生理狀態(tài)下，eNOS作用于左旋精氨酸(L-arginine，L-Arg)及O2，產(chǎn)生相對(duì)較低水平的NO，維持血管張力及黏膜血供。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MT可通過(guò)增強(qiáng)eNOS活性，減輕腸道損傷，且FMT前后變化最明顯的菌群是雙歧桿菌，提示雙歧桿菌在調(diào)節(jié)eNOS活性的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，3組新生小鼠腸組織eNOS蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但NEC組腸組織eNOS活性明顯降低，表明腸組織中表達(dá)的部分eNOS蛋白不具有酶活性，原因可能為eNOS蛋白翻譯后修飾導(dǎo)致eNOS失活；經(jīng)雙歧桿菌干預(yù)的NEC小鼠腸組織eNOS活性明顯升高，提示雙歧桿菌在NEC模型中可改善eNOS活性。

在缺乏底物L(fēng)-Arg、輔助因子四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)或機(jī)體處于炎癥狀態(tài)等情況下[18-19]，eNOS催化L-Arg和O2產(chǎn)生(代替NO)，造成NO生物利用度降低，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，導(dǎo)致或加重內(nèi)皮功能障礙，進(jìn)而引起腸組織損傷。Kliegman[20]、Nadler等[21]研究發(fā)現(xiàn)，NEC模型中NO含量增加，并認(rèn)為該變化是由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)上調(diào)引起的。本研究發(fā)現(xiàn)，NEC模型中NO含量降低，結(jié)果與之相反，原因主要考慮以下幾個(gè)方面：①多種相關(guān)因素導(dǎo)致eNOS脫偶聯(lián)，原本催化產(chǎn)生的NO轉(zhuǎn)化為；②在氧化應(yīng)激及eNOS脫偶聯(lián)的情況下，產(chǎn)生，NO與其快速結(jié)合淬滅，產(chǎn)生毒性更強(qiáng)的氧化中間體過(guò)氧亞硝基(peroxynitrite，ONOO-)，進(jìn)一步導(dǎo)致eNOS脫偶聯(lián)，形成惡性循環(huán)；③本研究中新生小鼠建模時(shí)間為3 d，處于NEC發(fā)病早期，iNOS尚未明顯上調(diào)，無(wú)大量NO產(chǎn)生。另外，在NEC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，究竟是eNOS還是iNOS及其在哪個(gè)階段起主要作用，目前尚未明確。有學(xué)者認(rèn)為，在NEC發(fā)病早期，eNOS可能在NO產(chǎn)生的初始階段發(fā)揮較大作用，隨后eNOS脫偶聯(lián)和iNOS活性增強(qiáng)的雙重結(jié)合替代eNOS催化的NO產(chǎn)生，反而產(chǎn)生大量的[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)雙歧桿菌干預(yù)后，NEC新生小鼠腸組織NO含量呈上升趨勢(shì)，含量明顯下降，原因可能為雙歧桿菌通過(guò)增強(qiáng)eNOS活性，一方面促進(jìn)NO的產(chǎn)生，維持腸道血流灌注平衡，另一方面減少由eNOS脫偶聯(lián)產(chǎn)生的，以及與NO結(jié)合產(chǎn)生的ONOO-，從而減輕腸組織損傷。

NO除以自由基的方式直接作用于相關(guān)組織外，還與NEC炎癥信號(hào)密切相關(guān)，基于Siednienko等[23]、Sprague[24]的前期研究，本研究檢測(cè)了IL-6和IL-1β的mRNA和蛋白表達(dá)水平，探討腸道炎癥應(yīng)答及與NO相互作用的關(guān)系。IL-6作為促炎因子，在急慢性炎癥中起重要作用，相對(duì)較高濃度的NO能夠通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB的活性，抑制IL-6表達(dá)[21]。IL-1β具有活化內(nèi)皮細(xì)胞、刺激NO產(chǎn)生的功能，若NO產(chǎn)生減少，則會(huì)反饋性地刺激IL-1β的產(chǎn)生，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)[24]。本研究結(jié)果顯示，NEC新生小鼠腸組織IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯升高，而經(jīng)雙歧桿菌干預(yù)后其表達(dá)水平明顯降低，提示雙歧桿菌可減少IL-6、IL-1β等促炎因子的產(chǎn)生，且可能與NO含量增加有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，雙歧桿菌能夠通過(guò)增強(qiáng)eNOS活性，增加NO的產(chǎn)生，從而降低IL-6、IL-1β等促炎因子的表達(dá)，減輕腸組織損傷。目前，eNOS蛋白翻譯后常見的修飾方式為乙?；⒘姿峄?、谷胱甘肽化等，本研究中雙歧桿菌作用于eNOS，影響其活性的具體作用機(jī)制尚未明確，仍待進(jìn)一步研究。