骨髓間充質(zhì)細胞在聚醚醚酮片和純鈦片表面的體外生物相容性比較

連克乾， 張昕， 周捷宇， 廖燕芬， 司姍姍

1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科，廣東 廣州（510080）； 2.南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院番禺院區(qū)種植修復(fù)科，廣東 廣州（511400）； 3.南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院綜合急診科，廣東廣州（510280）

目前純鈦（titanium，Ti）被普遍應(yīng)用于臨床的牙種植體材料，但在種植失敗的病例中，其逐漸展露出因應(yīng)力遮擋效應(yīng)導(dǎo)致的植體周圍骨吸收、基臺折裂、種植體周圍炎、本體感受器缺乏、骨整合時間長及遠期存活率不確切等缺點［1?2］。聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）已被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各個領(lǐng)域，包括骨、關(guān)節(jié)、脊柱和顱骨頜面部的骨缺損修復(fù)和植入物更換，以及心臟瓣膜及整形外科。PEEK具有良好的機械性能，其彈性模量為3～4 GPa，接近骨松質(zhì)，彎曲強度大于140 MPa，拉伸強度大于93 MPa［3］，在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也引起國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。但對于PEEK作為牙種植體原材料在生物相容性方面與純鈦相比較的效果尚不確切。本實驗比較了骨髓間充質(zhì)細胞在PEEK和Ti表面的體外生物相容性，旨在探究PEEK是否具有優(yōu)于Ti的體外生物相容性，為PEEK應(yīng)用于牙種植體原材料方面提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

聚醚醚酮棒（深圳大藍塑業(yè)有限公司），鈦棒（日本住友集團），熱場發(fā)射掃描電鏡JSM?6330F（日本電子株式會社），Alamarblue（Sigma?Aldrich公司，美國），全自動酶標(biāo)儀Infinite200（Tecan公司，瑞士），堿性磷酸酶AKP測試盒（南京建成生物工程研究所），BCA蛋白定量試劑盒（康為世紀公司，中國），茜素紅（天津市天新精細化工公司），十六烷基吡啶（Sigma?Aldrich公司，美國）。

1.2 細胞培養(yǎng)

骨髓間充質(zhì)細胞來源自出生3～4 d的SD乳鼠［SD乳鼠來源于中山大學(xué)動物實驗中心，實驗動物質(zhì)量許可證號SCXK（粵）2011?0029］，實驗中對動物處置符合動物倫理學(xué)要求，于體外分離提取原代細胞，并傳代培養(yǎng)至第3代或第4代細胞用于各組實驗（圖1），細胞接種于各個試件表面的接種密度為1× 105個/mL。

1.3 茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)情況

為研究SD乳鼠骨髓間充質(zhì)細胞在體外成骨誘導(dǎo)環(huán)境下分化為成骨細胞的能力，采用1%茜素紅染色，倒置顯微鏡下觀察，骨髓間充質(zhì)細胞在加入成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)7 d、14 d后，形成礦化結(jié)節(jié)的情況如圖2所示。

Figure 1 Morphology of the bone marrow mesenchymal cells observed by inverted microscopy圖1 倒置顯微鏡下骨髓間充質(zhì)細胞形態(tài)

Figure 2 Alizarin red staining mineralization nodules圖2 茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色

1.4 試件制備

將直徑為10 mm的PEEK棒和Ti棒切割成厚度為1 mm、直徑為10 mm的圓片狀PEEK片（PEEK組）和Ti片（Ti組），用200#、500#、1200#的碳化硅砂紙逐級打磨拋光。依次用丙酮、無水乙醇、超純水超聲清洗10 min，高溫高壓（103.4 kPa，121.3℃，30 min）消毒滅菌后干燥備用（圖3）。

Figure 3 PEEK and Ti images圖3 PEEK片和Ti片實物圖

1.5 掃描電鏡觀察細胞的黏附形態(tài)

PEEK組和Ti組各組內(nèi)隨機選取試件，每個時間點每組設(shè)置5個平行試件。將骨髓間充質(zhì)細胞按照相同密度（1×105個/mL），相同接種量（600 μL）接種于各試件表面，分別于1、4、24 h終止培養(yǎng)，掃描電鏡觀察試件表面細胞形態(tài)。

1.6 Alamarblue方法檢測細胞的黏附和增殖能力

PEEK組和Ti組各組內(nèi)隨機選取試件，每個時間點每組設(shè)置5個平行試件，且每個時間點設(shè)置空白孔和背景孔。將骨髓間充質(zhì)細胞按照相同密度（1× 105個/mL）、相同接種量（600 μL）接種于各試件表面，分別于1 h、3 h、1 d、3 d終止培養(yǎng)，將各試件置于等量Alamarblue溶液中，孵育24 h，全自動酶標(biāo)儀檢測570 nm和600 nm波長下樣本的吸光度值。各試件吸光度值計算公式：OD＝OD570nm?OD600nm。

1.7 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性檢測

PEEK組和Ti組各組內(nèi)隨機選取試件，每個時間點每組設(shè)置5個平行試件。將骨髓間充質(zhì)細胞按照相同密度（1× 105個/mL）、相同接種量（600 μL）接種于各試件表面，于接種24 h后成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的第7、14天終止培養(yǎng)，按照堿性磷酸酶試劑盒說明書操作，全自動酶標(biāo)儀測定520 nm波長下，各組吸光度OD值。同時按照BCA蛋白定量試劑盒說明書操作測定蛋白濃度，全自動酶標(biāo)儀測定560 nm波長下各組吸光度，繪制標(biāo)準曲線，計算樣品中的蛋白濃度。通過BCA蛋白定量分析公式和ALP試劑盒計算公式，得到各個時間點PEEK組和Ti組的細胞ALP活力值（金氏單位/gprot）。

1.8 茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)半定量檢測

PEEK組和Ti組各組內(nèi)隨機選取試件，每個時間點每組設(shè)置5個平行試件，且每個時間點設(shè)置背景孔和空白孔各1個。將骨髓間充質(zhì)細胞按照相同密度（1× 105個/mL）、相同接種量（600 μL）接種于各試件表面，于接種24 h后成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的第7、14天終止培養(yǎng)，加入1%茜素紅溶液及10%十六烷基吡啶水溶物，于562 nm波長全自動酶標(biāo)儀處檢測處吸光度，去除背景值后的OD值與礦化結(jié)節(jié)的礦化程度成正比。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。本研究數(shù)據(jù)類型為計量資料，數(shù)據(jù)用均數(shù) ±標(biāo)準差表示。對于兩組獨立樣本數(shù)據(jù)，若滿足正態(tài)性和方差齊性采用兩獨立樣本的t檢驗進行統(tǒng)計推斷；若兩樣本所屬總體均符合正態(tài)性，但方差不齊，則采用校正的t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡下細胞黏附形態(tài)觀察

為比較骨髓間充質(zhì)細胞在PEEK片和Ti片試件表面的黏附形態(tài)，掃描電鏡下觀察骨髓間充質(zhì)細胞的形態(tài)如圖4所示。復(fù)合培養(yǎng)1 h后，細胞在PEEK片和Ti片表面均呈圓球狀突起，未完全鋪開伸展，邊緣部分鋪展于試件表面；復(fù)合培養(yǎng)4 h后，試圖在各試件表面伸展，形態(tài)不規(guī)則，可見明顯的板狀偽足；復(fù)合培養(yǎng)24 h后，細胞在各試件表面完全伸展鋪平，偽足明顯，呈典型成骨細胞形態(tài)，大多數(shù)為梭形、多角形。表明骨髓間充質(zhì)細胞在PEEK片和Ti片試件表面均可黏附、增殖生長，且形態(tài)無明顯差異。

Figure 4 SEM showing the morphology of bone marrow mesenchymal cells cultured on PEEK and Ti substrates after 1,4 and 24 hours圖4 掃描電鏡下PEEK與Ti試件表面骨髓間充質(zhì)細胞接種1 h、4 h、24 h的形態(tài)

2.2 Alamarblue方法檢測細胞的黏附和增殖能力

Alamarblue法檢測顯示（表1），PEEK組與Ti組1 h的 OD值為0.321±0.010與0.285±0.008，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝5.354，P＝0.001）；PEEK組與Ti組3 h的 OD值為0.323±0.008與0.296±0.012，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝4.018，P＝0.004）。uPEEK?uTi的95%置信區(qū)間也表明PEEK組的OD值高，即骨髓間充質(zhì)細胞在PEEK組表面培養(yǎng)1 h、3 h時的活細胞數(shù)均高于Ti組。

比較骨髓間充質(zhì)細胞在各組試件表面的增殖能力（表1），結(jié)果表明：PEEK組與Ti組1 d的 OD值為0.233±0.020與0.220±0.007，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝3.690，P＝0.015）；PEEK組與Ti組3 d的OD值為0.182±0.007與0.127±0.011，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝9.071，P<0.001）。 uPEEK?uTi的95%置信區(qū)間也表明PEEK組的OD值高，即骨髓間充質(zhì)細胞在PEEK組表面培養(yǎng)1 d、3 d時的活細胞數(shù)均高于Ti組。

表1 骨髓間充質(zhì)細胞在各組試件表面培養(yǎng)的黏附與增殖情況Table 1 The adhesion and proliferation of the bone marrow mesenchymal cells on all substrates x±s

2.3 ALP活力測定

測定成骨誘導(dǎo)下骨髓間充質(zhì)細胞在各組試件表面的ALP活性（表2），在PEEK組與Ti組培養(yǎng)7 d后，活力值為（10.849±0.949）gprot與（4.888±0.784）gprot，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝10.831，P<0.001）；在PEEK組與Ti組培養(yǎng)14 d后，活力值為（7.050 ± 1.001）gprot與（4.938 ± 0.712）gprot，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝4.385，P＝0.001）。uPEEK?uTi的95%置信區(qū)間也表明，培養(yǎng)7 d、14 d時PEEK組的細胞ALP活性高于Ti組。

表2 成骨誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)細胞在各組試件表面培養(yǎng)7 d、14 d后的堿性磷酸酶活性Table 2 ALP activity of the osteogenesis induced bone marrow mesenchymal cells cultured on all substrates for 7 and 14 days x±s，gprot

2.4 茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)半定量測定

成骨誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)細胞在各組試件表面接種培養(yǎng)7 d、14 d后，經(jīng)茜素紅染色，十六烷基吡啶礦化結(jié)節(jié)半定量分析（表3），在PEEK組與Ti組培養(yǎng)7 d后，OD值為0.552±0.181與0.296±0.055，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝3.026，P＝0.031）；在PEEK組與Ti組培養(yǎng)14 d后，OD值為1.034±0.233與0.583± 0.080，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝4.100，P＝0.010）。uPEEK?uTi的95%置信區(qū)間也表明PEEK組的OD值高，即PEEK組的礦化程度高于Ti組。

3 討論

牙種植體材料是否具有良好的細胞黏附增殖性能，是評價其生物學(xué)性能的重要指標(biāo)之一。當(dāng)牙種植體植入頜骨內(nèi)，周圍血液及組織液中的蛋白便迅速吸附至種植體表面，以此誘發(fā)之后的細胞與種植體直接或間接的黏附作用［4］。細胞黏附是細胞增殖分化等后續(xù)細胞行為的首要步驟，也是細胞與牙種植體最早發(fā)生的反應(yīng)。在1～4 h細胞黏附行為最為旺盛，24 h后定植于種植體表面的細胞，便開始增殖行為。理想的牙種植體材料應(yīng)有利于細胞的早期黏附，能促進細胞的增殖并為細胞生長提供合適的微環(huán)境［5］。ALP是成骨分化的早期生化指標(biāo)［6］。ALP活性的高低可反映成骨分化的程度及功能狀態(tài)，其活性越高，說明成骨方向分化越明顯，成熟度越高，細胞活力旺盛。因此分化早期可用ALP活性判斷細胞的成骨分化能力，后期的成骨指標(biāo)主要采用形成礦化結(jié)節(jié)的能力來判斷。

表3 成骨誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)細胞在各組試件表面培養(yǎng)7 d、14 d的礦化程度Table 3 The mineralization of the osteogenesis induced bone marrow mesenchymal cells cultured on all substrates for 7 and 14 days x±s

本實驗對PEEK與Ti進行了體外細胞生物相容性的比較，通過骨髓間充質(zhì)細胞在PEEK材料表面的黏附、增殖和成骨能力評價PEEK的細胞生物相容性，探討PEEK作為牙種植體新材料的可能性。掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，骨髓間充質(zhì)細胞在PEEK片和Ti片試樣表面均可黏附，并無明顯差異，說明PEEK和Ti均有細胞黏附能力；但在Alamarblue檢測實驗中觀察到不同時間點，PEEK組的活細胞數(shù)均高于Ti組，說明PEEK組的黏附及增殖情況均優(yōu)于Ti組。堿性磷酸酶試劑盒和茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)半定量分析，結(jié)果表明PEEK組的ALP活性和礦化程度均高于Ti組。

國內(nèi)外學(xué)者在PEEK及其復(fù)合物的生物相容性方面已有很多探索，PEEK及其復(fù)合材料被認為是一種先進的生物材料，用于治療創(chuàng)傷、關(guān)節(jié)成形術(shù)或組織丟失損傷［7］。近年來有關(guān)PEEK性能的報道，揭示了其機械性能優(yōu)于現(xiàn)有的牙科金屬材料［8］。PEEK的彈性模量為3～4 GPa，加入碳纖維后可以將彈性模量提高到18 GPa，接近骨皮質(zhì)的彈性模量（15 GPa）。在生物相容性方面，PEEK對人體器官既沒有誘變作用，也沒有細胞毒性的證據(jù)，這說明其具有良好的生物相容性。PEEK在納米水平進行修飾后，可以提高其生物活性和骨傳導(dǎo)性能。納米粒子（如TiO2、HAF、HAp等）可與PEEK結(jié)合形成具有生物活性的納米復(fù)合材料［9］。另外，Nakahara等［10］在動物體內(nèi)研究中將涂層和未涂層的碳纖維增強PEEK及鈦合金種植體分別進行兔股骨拔出試驗，結(jié)果顯示涂層的碳纖維增強PEEK種植體于植入的第6周界面剪切應(yīng)力消失，而涂層的鈦合金種植體于植入的第12周界面剪切應(yīng)力才消失；于之后2周再對未涂層碳纖維增強PEEK和鈦合金樣品進行評估，得出了與人類成骨細胞相似的反應(yīng)，在該研究中未涂層的碳纖維增強PEEK植體的剪切強度顯著低于涂層的植體剪切強度。此結(jié)果表明PEEK及其復(fù)合材料能夠比Ti更早達到骨結(jié)合，這與本文的體外細胞生物相容性實驗中得到的結(jié)果相呼應(yīng)，即PEEK的細胞生物相容性優(yōu)于Ti。

盡管PEEK具有良好的生物相容性、射線可穿透性、彈性模量與骨組織接近，但它是一種生物惰性材料，無法形成良好骨結(jié)合。目前已有大量研究通過PEEK及其復(fù)合物表面改性的方法來提高生物活性［11］。比如使用地塞米松加負載米諾環(huán)素的脂質(zhì)體（Dex/Mino脂質(zhì)體）修飾的PEEK表面具有良好的穩(wěn)定性和細胞相容性，并具有增強抗菌、抗炎和骨整合能力［12］。還有通過快速環(huán)境溫度磺化處理PEEK表面，以提高其親水性和骨傳導(dǎo)性，用于骨植入［13］。也有利用加速中性原子束處理技術(shù)，增強了PEEK的體內(nèi)外生物活性，提高植入性醫(yī)療器械的生物活性等［14］。由此可見PEEK表面修飾可增強其作為牙種植體植入材料的細胞黏附、增殖、生物相容性和成骨性能；PEEK還能影響生物膜結(jié)構(gòu)，減少種植體周圍炎癥的發(fā)生［15］。將來需要對PEEK種植體進一步研究和更多的臨床對照試驗，使它可以取代Ti成為牙種植體材料。