林可霉素基因工程研究的新進(jìn)展

蔡新露 許婉蓮 許玉榮 吳杭,* 張部昌

(1 安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院，合肥 230601；2 合肥師范學(xué)院 化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，合肥 230601)

1962年，Marson等[1]從美國(guó)內(nèi)布拉斯加州林肯市附近的土壤中分離得到了第一株林可鏈霉菌NRRL2936(Streptomyces lincolnensis NRRL2936)，該菌株產(chǎn)生一種林可酰胺類抗生素—林可霉素A(lincomycin A, Lin-A)(圖1)，體內(nèi)和體外對(duì)革蘭陽(yáng)性菌作用均較強(qiáng)，對(duì)革蘭陰性菌亦有一定的抑制作用。在臨床上，林可霉素對(duì)由革蘭陽(yáng)性菌引起的疾病，如呼吸道、皮膚及軟組織感染等均有良好療效，也可用于治療慢性骨髓炎、腦膜炎、泌尿系統(tǒng)革蘭陽(yáng)性菌感染、中耳炎和眼科疾病等，是一種用途極其廣泛的抗生素藥物[2]。林可霉素A通過(guò)與敏感細(xì)菌核糖體50S亞基的23S rRNA中心環(huán)結(jié)合，降低肽基轉(zhuǎn)移酶的活力，使肽鏈的延伸受阻，從而抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成[3]。林可鏈霉菌發(fā)酵過(guò)程中除了林可霉素A，還產(chǎn)生其副產(chǎn)物林可霉素B(lincomycin,Lin-B)(圖1)。中國(guó)藥典和美國(guó)藥典規(guī)定，當(dāng)林可霉素制劑中林可霉素B含量超過(guò)5%時(shí)[4]，該產(chǎn)品不得作為藥物或有效的藥劑學(xué)成分，因此降低林可霉素B的含量是一個(gè)亟須解決的問(wèn)題。自2017年起，林可霉素野生菌以及高產(chǎn)菌株的基因組測(cè)序相繼完成[5-6]，這為林可霉素基因工程研究帶來(lái)了新的機(jī)遇?；诮陙?lái)該領(lǐng)域諸多的研究進(jìn)展，筆者簡(jiǎn)述了林可霉素生物合成及其調(diào)控機(jī)制，并結(jié)合所在實(shí)驗(yàn)室的研究工作，對(duì)利用基因工程技術(shù)進(jìn)行林可霉素高產(chǎn)工程菌構(gòu)建和新衍生物創(chuàng)制等方面的進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)和展望，為林可鏈霉菌的進(jìn)一步遺傳改良及其發(fā)酵生產(chǎn)提供參考。

1 林可霉素的生物合成

林可霉素A是由丙基脯氨酸(propyl-L-proline,PPL)和林可酰胺(lincosamide, LSM)通過(guò)酰胺鍵連接，并以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)為甲基供體對(duì)丙基脯氨酸N端和林可酰胺末端巰基甲基化修飾而成。Peschke等[7]和Koberska等[8]先后對(duì)林可鏈霉菌78-11和ATCC25466的林可霉素生物合成基因簇(lincomycin biosynthetic gene cluster, lmb cluster)進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)lmb基因簇含25個(gè)結(jié)構(gòu)基因、3個(gè)抗性基因和1個(gè)調(diào)節(jié)基因lmbU(圖2)。迄今為止，林可霉素生物合成途徑已被研究得非常清楚[9-11]。

在PPL的生物合成中，LmbB2首先與輔因子共同作用于酪氨酸[12]，使之羥基化，形成多巴[13]。LmbB1使多巴2和3位碳上的氫鍵斷裂、氧化，并內(nèi)部環(huán)化形成脯氨酸雙氫丙酮酸[14-16]。C-甲基轉(zhuǎn)移酶LmbW作用脯氨酸C4位支鏈，是造成林可霉素A和B差異的關(guān)鍵點(diǎn)[4]。LmbA將谷氨酸轉(zhuǎn)移至底物中，致使草酸鹽裂解，形成脯氨酸雙氫乙烷，隨后LmbX使雙鍵發(fā)生轉(zhuǎn)移，經(jīng)LmbY作用對(duì)含氮五元環(huán)內(nèi)和環(huán)外的兩個(gè)雙鍵依次還原，形成PPL[16]。

磷酸果糖或7-磷酸景天庚酮糖和5-磷酸-D-核糖在轉(zhuǎn)醇醛酶LmbR作用下發(fā)生縮合，異構(gòu)化后形成穩(wěn)定的8-磷酸辛糖，LmbP對(duì)其C1位的羥基磷酸化后生成二磷酸辛糖[17]，LmbK水解二磷酸辛糖的C8上的磷酸基團(tuán)，經(jīng)LmbO作用轉(zhuǎn)化為GDP-辛糖[18]，隨后LmbM、LmbZ、LmbM和LmbS依次參與C6異構(gòu)、脫水、C4異構(gòu)和轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，最終生成GDP-LSM[10]。

林可酰胺與丙基脯氨酸的縮合過(guò)程較為獨(dú)特，需要轉(zhuǎn)化為活性形式參與縮合。PPL經(jīng)LmbC活化為PPL-AMP，而LSM的活化需要一種小分子硫醇麥角硫因(ergothioneine, EGT)和轉(zhuǎn)移酶LmbT參與，生成EGTLSM，后由LmbD催化，在LmbN上縮合形成PPLLSM-EGT復(fù)合物，隨后，與另一種小分子硫醇放線硫醇(mycothiol, MSH)發(fā)生硫醇交換，生成PPL-LSMS-MSH，該反應(yīng)使得目的產(chǎn)物獲得了硫元素[19-20]。PPL-LSM-S-MSH在酰胺酶作用下發(fā)生水解反應(yīng)，釋放MSH中的氨基葡萄糖肌醇[19,21]，LmbJ修飾丙基脯氨酸中吡咯環(huán)的氮元素，使之甲基化[22-23]，LmbF斷裂S-C鍵，生成去甲基林可霉素[24]，LmbG對(duì)巰基甲基化，最終形成林可霉素A[24-25]。

2 林可霉素生物合成的分子調(diào)控

近年來(lái)，林可霉素生物合成的分子調(diào)控有了很大進(jìn)展。侯兵兵等[26]發(fā)現(xiàn)LmbU不僅可以直接激活PPL相關(guān)基因lmbA、lmbC、lmbJ和lmbW的轉(zhuǎn)錄，還間接抑制LSM相關(guān)基因lmbK及其自身的轉(zhuǎn)錄；通過(guò)蛋白截短等實(shí)驗(yàn)證實(shí)LmbU的N段為自我抑制結(jié)構(gòu)域(auto-inhibitory domain, AID)，C端為一個(gè)未知結(jié)構(gòu)域，在蛋白中央還含有一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbinding domain, DBD)；經(jīng)氨基酸點(diǎn)突變確定LmbU的第12位半胱氨酸是其形成同源二聚體的關(guān)鍵位點(diǎn)[27]。林春燕等[28]基于RNA測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)LmbU激活19種林可霉素合成基因簇外基因的表達(dá)，并通過(guò)抑制羥苯丙酮酸雙加氧酶HdpA的基因轉(zhuǎn)錄加速PPL的生物合成。林可鏈霉菌中全局調(diào)控子BldA通過(guò)控制含TTA密碼子基因如結(jié)構(gòu)基因lmbB2和調(diào)控基因lmbU的翻譯，調(diào)控林可霉素生物合成和菌株形態(tài)分化[29]。另一種全局調(diào)控子AdpA既可激活簇內(nèi)結(jié)構(gòu)基因、抗性基因和調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，還能夠促進(jìn)bldA的表達(dá)，正向調(diào)控林可霉素的生物合成[30]。近期，侯兵兵等[31]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)氧化還原感應(yīng)調(diào)控因子Rexlin，在林可鏈霉菌NRRL 2936中敲除該基因，突變株的生長(zhǎng)速率提高，而產(chǎn)量卻有所降低；并證實(shí)Rexlin間接促進(jìn)簇內(nèi)結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄影響林可霉素的產(chǎn)量。

在抗生素合成過(guò)程中，添加一定量的硝酸鹽可影響抗生素產(chǎn)生菌的初級(jí)代謝，從而提高抗生素產(chǎn)量，這就是“硝酸鹽效應(yīng)”，而同樣現(xiàn)象也出現(xiàn)在林可鏈霉菌中[32]。孟思童等[5]對(duì)氮代謝全局性調(diào)控因子GlnR進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)硝酸鹽特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將硝酸鹽內(nèi)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)glnR的高效表達(dá)，GlnR進(jìn)而促進(jìn)該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，以加速菌體內(nèi)硝酸鹽濃度的進(jìn)一步提高；GlnR通過(guò)提高硝酸鹽同化途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，可提升細(xì)胞內(nèi)谷氨酸的水平，而谷氨酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨作用可形成林可霉素合成前體酪氨酸；同時(shí)，GlnR還可直接正調(diào)控抗性基因lmrA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)林可霉素的外排并提高菌株的抗性。

本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了與林可霉素生物合成相關(guān)的3種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(SLCG_2919、BldD和SLCG_Lrp)。TetR家族調(diào)控子SLCG_2919可直接抑制林可霉素合成基因簇以及鄰近基因SLCG_2920的轉(zhuǎn)錄，從而負(fù)調(diào)控林可霉素的生物合成[33]。林可鏈霉菌BldD作為一個(gè)重要的發(fā)育調(diào)控因子，直接正調(diào)控林可霉素的生物合成[34]。亮氨酸應(yīng)答調(diào)控蛋白SLCG_Lrp一方面直接促進(jìn)林可霉素合成基因簇中部分結(jié)構(gòu)基因、全部3個(gè)抗性基因和調(diào)控基因lmbU的轉(zhuǎn)錄，另一方面直接抑制自身基因并激活鄰近基因SLCG_3127的轉(zhuǎn)錄。此外，SLCG_Lrp還受到SLCG_2919直接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[35]。本文基于上述研究結(jié)果繪制了林可霉素生物合成的局部調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖3)。

3 林可霉素產(chǎn)量與純度的提高

3.1 增加胞內(nèi)硝酸鹽濃度

在林可霉素發(fā)酵過(guò)程中，添加一定濃度的硝酸鹽可以使其產(chǎn)量明顯提高。孟思童等[5]發(fā)現(xiàn)了一種硝酸鹽特異性ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABC2，它可以內(nèi)運(yùn)硝酸鹽，使胞內(nèi)硝酸鹽濃度提高，從而增加林可霉素產(chǎn)量。已有研究報(bào)道亞硝酸鹽特異性內(nèi)運(yùn)蛋白NirC在克氏桿菌DSM 10542[36](Sanguibacter keddieiiDSM 10542)、暗地嗜皮菌DSM 43160[37](Geodermatophilus obscurusDSM 43160)和地中海擬無(wú)枝酸菌U-32[38](Amycolatopsis mediteraneiU-32)等多種菌中均參與氮代謝。在林可霉素高產(chǎn)菌LC-G中共表達(dá)ABC2和nirC，胞內(nèi)硝酸鹽濃度升高，GlnR高效表達(dá)，致使林可霉素產(chǎn)量大幅提高[5]。

3.2 調(diào)控與抗性基因改造

侯兵兵等[26]在解析LmbU調(diào)控機(jī)制的基礎(chǔ)上，于野生菌NRRL2936中過(guò)表達(dá)該基因， 林可霉素產(chǎn)量提升了5倍。本實(shí)驗(yàn)室在林可霉素高產(chǎn)菌株LA219X中敲除SLCG_2919或增加SLCG_Lrp基因拷貝數(shù)，可使林可霉素A產(chǎn)量分別提高15%和14%[33,35]。另外在林可霉素高產(chǎn)菌株LC-G中過(guò)表達(dá)抗性基因lmrC，可增加菌株對(duì)林可霉素的耐受力[39]，而杜磊等[40]利用將含抗性基因lmrA、lmrB和lmrC的多拷貝質(zhì)粒和整合質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入林可霉素野生菌ATCC25466中，林可霉素A產(chǎn)量先后提高了52.9%和38.3%。

3.3 代謝前體基因及結(jié)構(gòu)基因改造

林可霉素生物合成基因簇中存在3個(gè)依賴SAM的甲基轉(zhuǎn)移酶基因(lmbW、lmbJ和lmbG)，說(shuō)明在林可霉素合成過(guò)程中甲基的供給必不可少。一般來(lái)說(shuō)，SAM是由metK編碼的多數(shù)甲基化反應(yīng)的唯一甲基供體[41]。逄愛(ài)萍等[4]根據(jù)已報(bào)道的鏈霉菌metK序列設(shè)計(jì)兼并引物，PCR擴(kuò)增得到林可鏈霉菌的metK基因，在林可鏈霉菌SyBE2901中共表達(dá)該基因和lmbW，林可霉素A產(chǎn)量達(dá)到1744.6 mg/L，較出發(fā)菌株提高了35.83%，林可霉素B含量由6.76%降至4.41%。筆者實(shí)驗(yàn)室在林可霉素高產(chǎn)菌株LC-G中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)metK同源基因metK1和metK2，并在高產(chǎn)菌株LCGL和LA219X中共表達(dá)metK1和metK2，林可霉素A產(chǎn)量分別提高了27%和17%[42]。

L-多巴既可作為雙加氧酶LmbB1的底物用于合成林可霉素，也可作為黑色素前體被酪氨酸酶作用。在林可鏈霉菌中過(guò)表達(dá)lmbB1，搖瓶發(fā)酵時(shí)林可霉素A產(chǎn)量提高不顯著，但副產(chǎn)物林可霉素B和黑色素的合成被抑制；而15L發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)林可霉素A的產(chǎn)量提高了37.6%，林可霉素B和黑色素分別降低了73.4%和29.9%[43]。

本文基于上述研究結(jié)果匯總了林可霉素高產(chǎn)菌株基因工程改造的實(shí)例(表1)。

表1 林可霉素高產(chǎn)菌的基因工程改造Tab.1 Genetic engineering of lincomycin overproducing strains

4 新型林可霉素衍生物的創(chuàng)制

林可霉素衍生物，如克林霉素具有極大的藥用價(jià)值，是少數(shù)幾個(gè)在臨床上用于治療革蘭陰性厭氧菌的藥物之一。然而，傳統(tǒng)的化學(xué)合成法提取過(guò)程繁瑣且污染嚴(yán)重。因此，亟需一些有效的方法用于合成林可霉素衍生物。目前已報(bào)道使用生物催化或微生物發(fā)酵法合成林可霉素衍生物。

天青鏈霉菌(Streptomyces azureus)磷酸吡哆醛依賴酶CcbF和林可鏈霉菌LmbF同源性高達(dá)40%，它們以不同的方式作用底物，并與下游酶共同催化，使各自的產(chǎn)物天青菌素和林可霉素A具有獨(dú)特硫功能化，CcbF行使雙功能酶的職能，既脫羧又氧化脫氨；LmbF負(fù)責(zé)β消除，斷裂C-S鍵[24]。在體外，這兩種硫功能化過(guò)程可以交叉使用，王敏等[24]以此為基礎(chǔ)，整合已知的酶功能，在體外合成了多種新的林可酰胺類抗生素。

研究發(fā)現(xiàn)對(duì)林可霉素及其衍生物中脯氨酸烷基鏈長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的修飾可能影響其抗菌活性[16]，Dana等[44]在林可鏈霉菌中敲除lmbX致使其無(wú)法產(chǎn)生林可霉素，通過(guò)回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明這是由于林可霉素前體4-丙基脯氨酸的合成被阻斷；在ΔlmbX突變株發(fā)酵液中添加前體衍生物丁基脯氨酸和戊基脯氨酸，可產(chǎn)生高濃度的4-丁基-4-去丙基林可霉素和4-戊基-4-去戊基林可霉素，它們?cè)诳蛊咸亚蚓矫姹攘挚擅顾馗佑行А?/p>

Janata等[45]基于對(duì)天青菌素生物合成中關(guān)鍵酶的機(jī)制解析，使用酶催化方法制備了數(shù)百種林可霉素衍生物，并發(fā)現(xiàn)對(duì)其結(jié)構(gòu)中MTL的C1位引入烷基水楊酸酯或PPL的C4′位引入碳長(zhǎng)為4-6的烷基，可提高林可霉素衍生物的抗菌活性。

5 總結(jié)與展望

林可霉素類藥物作為高效抗生素已被廣泛應(yīng)用于畜禽獸醫(yī)臨床方面，具有較大的市場(chǎng)份額。我國(guó)是林可霉素發(fā)酵生產(chǎn)的大國(guó)，但面臨發(fā)酵效價(jià)偏低、組分復(fù)雜等問(wèn)題。目前林可霉素生物合成途徑已經(jīng)非常清晰，其異源雙相前體凸顯了林可霉素合成代謝通路的多樣性，這為林可霉素高品質(zhì)育種奠定重要基礎(chǔ)。盡管通過(guò)林可鏈霉菌基因工程改造優(yōu)產(chǎn)林可霉素已有一些報(bào)道，但相對(duì)于其他鏈霉菌還略有不足。近年來(lái)，除了林可霉素野生菌NRRL2936，迄今有兩株林可霉素高產(chǎn)菌的全基因組被測(cè)序完成[5-6]。王瑞達(dá)等[6]基于比較基因組分析，在高產(chǎn)菌B48中初步發(fā)現(xiàn)了影響其林可霉素產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，其中基因調(diào)控對(duì)林可霉素菌種的高產(chǎn)至關(guān)重要，這為林可鏈霉菌系統(tǒng)的代謝工程改造提供理論依據(jù)?？v觀已有林可霉素生物合成調(diào)控的研究進(jìn)展，其已然呈現(xiàn)出多元的分子機(jī)制，這進(jìn)一步凸顯了林可霉素合成調(diào)控的復(fù)雜性。而功能基因組學(xué)[46-48]、指數(shù)富集的配體基因組系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)[49]、DNA親和捕獲實(shí)驗(yàn)[50-51]等系統(tǒng)生物學(xué)方法的應(yīng)用，將有助于深化對(duì)林可霉素合成代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)。在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用合成生物學(xué)的理念，通過(guò)關(guān)鍵調(diào)控元件設(shè)計(jì)與優(yōu)化及其分子網(wǎng)絡(luò)的重塑，將有助于顯著提升林可霉素的微生物制造水平。

雖然近年來(lái)林可霉素基因工程研究進(jìn)展較快，但仍有一些問(wèn)題亟待解決。通過(guò)基因工程手段改造林可霉素工業(yè)菌株，如何進(jìn)一步降低林可霉素B等副產(chǎn)物或雜質(zhì)的含量？工業(yè)菌株在多次傳代和發(fā)酵過(guò)程中如何穩(wěn)定優(yōu)產(chǎn)性能？如何定向并高效創(chuàng)制更多優(yōu)效的林可霉素衍生物？怎樣做到林可霉素基因工程菌與現(xiàn)有發(fā)酵工藝的高效匹配？解決這些問(wèn)題，將為深入理解林可霉素生物合成代謝及其調(diào)控的復(fù)雜機(jī)制，以及工業(yè)菌株的高效精準(zhǔn)與系統(tǒng)工程改造奠定基礎(chǔ)。