肽鋅螯合物研究進(jìn)展

李晨，陳復(fù)生，布冠好

河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院（鄭州 450001）

鋅被稱為“生命元素”，對于維持人體正常的生命活動和生理狀態(tài)起著不可替代的作用。缺鋅會使人體健康受損，兒童缺鋅會延緩其生長發(fā)育，成人缺鋅會損傷機(jī)體的性腺機(jī)能，同時會導(dǎo)致神經(jīng)機(jī)能障礙以及免疫功能失調(diào)[1]。補(bǔ)鋅主要通過2種途徑：一是利用富鋅食物進(jìn)行補(bǔ)鋅；二是通過服用補(bǔ)鋅劑進(jìn)行補(bǔ)鋅。補(bǔ)鋅劑主要有4種形式：以無機(jī)鋅鹽作配體合成的補(bǔ)鋅劑、以有機(jī)弱酸作配體合成的補(bǔ)鋅劑、以氨基酸作配體合成的補(bǔ)鋅劑和以肽作配體合成的補(bǔ)鋅劑[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，食物衍生肽由于其鋅螯合能力可以作為膳食鋅載體[4]。一些肽結(jié)構(gòu)中含有金屬配體，如His、Cys、Asp、Glu和Ser，它們可以形成可溶性鋅螯合物，從而增強(qiáng)礦物質(zhì)的吸收性并防止其與植酸鹽的絡(luò)合。許多食物蛋白中可以提取出鋅螯合肽，例如芝麻蛋白[1]、乳蛋白[5]、牦牛酪蛋白[6]和牡蠣蛋白[7]。并且相對于無機(jī)鋅鹽而言，肽鋅螯合物中的鋅能被胃腸更好地吸收[8]。

肽鋅螯合物通過肽的C端羧基、N端氨基、氨基酸側(cè)鏈以及肽鏈中的亞氨基和羰基與鋅離子配位形成。它不僅提高了鋅離子的生物利用率，同時還具有高生物活性、高安全性和高溶解性，具有非常廣闊的研究前景。因此，主要對肽鋅螯合物的研究現(xiàn)狀予以概述，以期為肽鋅螯合物的未來應(yīng)用和進(jìn)一步深入研究提供參考。

1 肽鋅螯合物及其制備

1.1 肽鋅螯合物的制備

肽鋅螯合物以共價化學(xué)鍵作用肽和二價金屬鋅離子，生成化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定的多元環(huán)狀螯合物[9]。肽中α-氨基酸羧基端的碳原子、氨基端的氮原子及側(cè)鏈中含有諸如硫基、咪唑基和酚基等基團(tuán)，在適當(dāng)條件下可以作為配位體與二價金屬鋅離子發(fā)生共價作用，形成十分穩(wěn)定的肽鋅螯合鹽。

鋅螯合肽的初步制備主要是通過物理、化學(xué)等方法將蛋白分解成多肽。由于酶解法具有成本低、安全性高、條件溫和、水解過程易控制等優(yōu)點，逐漸發(fā)展為鋅螯合肽初期制備的主要方法[10]。周亮[11]以草魚鱗為原料，利用堿性蛋白酶酶解膠原蛋白，采用水相法進(jìn)行膠原小肽與鋅離子的螯合反應(yīng)，并確定最佳提取工藝：時間75 min、溫度70 ℃、pH 6.5、肽鋅摩爾比2∶1.2，此條件下鋅肽螯合比率（質(zhì)量比）為5.79%。牟雪姣等[12]以木瓜蛋白酶結(jié)合中性蛋白酶法制備玉米蛋白水解物，并在pH 8.0，玉米蛋白水解物與鋅質(zhì)量比3∶1的最佳條件下進(jìn)行肽鋅螯合，該條件下螯合物得率和螯合率分別為77.8%和97.7%。李庭[13]確定復(fù)合胰蛋白酶米渣限制性酶解最佳工藝條件后，由單因素試驗和正交試驗確定螯合最佳工藝條件：米蛋白肽與二價鋅質(zhì)量比4.56∶1，pH 5.0、螯合溫度60℃、螯合時間90 min，此條件下米蛋白肽螯合鋅的鋅含量為15.33%。高紅梅等[14]、侯利霞等[15]、張亞茹[16]分別從谷朊粉蛋白、芝麻蛋白、榛子蛋白中提取鋅螯合肽，并制備相應(yīng)肽鋅螯合物。

影響肽與鋅離子螯合反應(yīng)的因素有反應(yīng)時間、pH、溫度和物料的質(zhì)量比等，不同的螯合工藝所得的螯合產(chǎn)物的理化性質(zhì)和螯合率都有所差異[17]。高素蘊(yùn)[18]通過對大豆源肽鋅螯合物制備工藝條件的研究表明pH對螯合反應(yīng)影響最大，其后依次是酸度調(diào)節(jié)劑、肽鋅質(zhì)量比、多肽反應(yīng)液濃度、鋅鹽種類、反應(yīng)時間和溫度，它們對鋅的螯合率及螯合物得率有較顯著影響。除了常規(guī)的螯合反應(yīng)外，有學(xué)者借助超聲波手段輔助反應(yīng)。閆偉[19]在超聲輔助條件下將真鯛魚皮膠原蛋白多肽與硫酸鋅進(jìn)行螯合反應(yīng)，同常規(guī)螯合反應(yīng)相比，超聲波明顯加快螯合反應(yīng)的進(jìn)行，減短螯合反應(yīng)的時間，并且提高螯合率，螯合率達(dá)96.07%。

1.2 鋅螯合肽的分離與純化

肽鋅螯合機(jī)理是近年來的一大研究熱點，研究螯合肽螯合機(jī)理首先需要將鋅螯合肽進(jìn)行分離純化。螯合肽的分離純化方法有凝膠柱層析、固定化金屬親和層析、離子柱層析和超濾等。電噴霧電離質(zhì)譜和反相高效液相色譜也已被廣泛應(yīng)用于獲得單個肽分子及其肽序列[20]。

張亞茹[16]將榛子蛋白水解產(chǎn)物超濾處理后，5～10 kDa肽段的螯合率和螯合物得率分別為47.89%±0.27%和16.90%±0.20%。將其經(jīng)離子交換層析分離獲得F1和F2這2個組分，經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱層析分離獲得F3和F4這2個組分，其中F2組分對鋅的螯合能力最強(qiáng)，螯合率為59.855%±0.45%。

Chen等[7]通過固定化金屬離子親和色譜（IMACZn2+）分級分離牡蠣蛋白水解產(chǎn)物。通過反相高壓液相色譜鑒定并通過液相色譜質(zhì)譜法測序的牡蠣鋅螯合肽（從N至C末端的序列）具有1 882.0 Da的分子量。肽（HLRQEEKEEVTVGSLK）的鋅結(jié)合能力為6.56 μg/mg，并且在體外模擬消化時保持其原始水平的85.98%。UV-vis和FTIR光譜表明，屬于羧酸鹽基團(tuán)的氨基氮原子和氧原子是Zn2+的主要結(jié)合位點。

黃晶晶等[21]用堿性蛋白酶水解菜籽蛋白制備水解物，運(yùn)用固定金屬親和層析（IMAC-Zn2+）和葡聚糖凝膠G-25（Sephadex G-25）層析分離純化鋅螯合肽，利用反相高效液相色譜和電噴霧電離質(zhì)譜鑒定序列。研究發(fā)現(xiàn)，其中Asn-Ser-Met鋅螯合率最高，它來源于菜籽蛋白NADH-enoyl-ACP reductase Chain A序列中的296～298氨基酸殘基。

Zhu等[22]以小麥胚芽蛋白為原料，使用固定化金屬離子親和層析（IMAC-Zn2+）和大孔吸附樹脂DA201-C，從小麥胚芽水解產(chǎn)物中分離和純化鋅螯合肽。通過MALDI TOF/TOF鑒定的2種主要鋅螯合肽是NAPLPPPLKH和HNAPNPGLPYAA。其中，HNAPNPGLPYAA具有91.67%±0.81%的高鋅螯合能力，并且在Caco-2細(xì)胞中具有比ZnSO4更高的鋅生物利用度（p＜0.05）。

Wang等[1]使用固定化金屬親和層析（IMAC-Zn2+）從胰蛋白酶處理的芝麻蛋白水解產(chǎn)物中分離金屬螯合肽。此外，用反相高效液相色譜和質(zhì)譜鑒定6種鋅螯合肽。合成這些金屬螯合肽中的3種（Ser-Met、Leu-Ala-Asn和Asn-Cys-Ser），并檢測肽的金屬螯合能力。Asn-Cys-Ser肽顯示出最高的鋅和鐵螯合能力，甚至高于還原型谷胱甘肽。

2 肽鋅螯合物的主要特性

2.1 肽鋅螯合物的功能特性

肽鋅螯合物可以通過削弱不溶性鋅化合物的形成來改善消化道中的礦物質(zhì)吸收，促進(jìn)鋅通過腸道吸收膜的轉(zhuǎn)運(yùn)[23-24]。Wang等[25]報道，牦牛乳酪蛋白水解物（YCH）可與鋅離子結(jié)合形成復(fù)合物，使鋅在模擬腸道條件下比醋酸鋅更易溶解。Zhu等[22]發(fā)現(xiàn)，與來自小麥胚芽蛋白的肽螯合鋅在Caco-2細(xì)胞中具有比ZnSO4更高的鋅生物利用度。馬婷等[26]研究表明珍珠貝外套膜膠原蛋白肽鋅螯合物（POMCP-Zn）可以提高骨鈣素蛋白的分泌量，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化階段Ⅰ型膠原蛋白，同時有利于成骨細(xì)胞礦化階段骨結(jié)節(jié)的形成。10 μg/mL的POMCP-Zn將成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性提高到1.48倍，有望成為預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的潛在功能性食品。有研究表明，牡蠣肽鋅螯合物具有改善抗氧化劑生物活性和鋅生物可接近性的潛在功能成分[27]。除了促進(jìn)礦物質(zhì)生物利用度之外，還觀察到肽-金屬絡(luò)合物的抗微生物活性[28]。

由于世界對化學(xué)防腐劑的認(rèn)識，食品行業(yè)正在關(guān)注天然GRAS（通常認(rèn)為安全）防腐劑及消費(fèi)者對更安全添加劑的看法[29]?？咕模ˋMPs）作為化學(xué)防腐劑的抗菌替代品受到關(guān)注。AMP是各種生物體中非特異性宿主防御或先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分。當(dāng)這些肽與二價金屬離子如鋅復(fù)合時，抗微生物肽的活性增加[30-31]。研究表明由風(fēng)味酶水解產(chǎn)物制備的肽-鋅復(fù)合物（PZCs）表現(xiàn)出最高的抗菌活性。其中5種PZCs均具有較強(qiáng)的抗菌活性，但無抗真菌活性。在序列中具有更多酸性氨基酸殘基的肽可以比具有更少酸性氨基酸殘基的肽結(jié)合更多鋅離子，富含酸性氨基酸的肽的鋅配合物顯示出更強(qiáng)的抗菌活性[32]。除此之外，有學(xué)者表征了由桿菌肽-鋅對金黃色葡萄球菌的抗菌活性的機(jī)制[31]。

有研究表明，鰱魚源多肽鋅螯合物對冷藏過程中的草魚有明顯的防腐保鮮作用，能減緩草魚感官品質(zhì)的下降，有效抑制草魚TBA值、TVB-N值、pH升高及細(xì)菌生長，與未添加多肽鋅的涂膜處理組草魚相比，多肽鋅處理后草魚的保鮮期可延長4 d[33]。

研究表明肽鋅螯合物還具有一定的抗氧化能力和促進(jìn)乳酸菌增殖的能力。在試驗濃度范圍內(nèi)，肽鋅螯合物的濃度與羥自由清除能力、總還原力和ABTS陽離子自由基清除能力均呈正相關(guān)。在MRS培養(yǎng)基中，肽鋅螯合物部分替代MRS培養(yǎng)基中的有機(jī)氮源時，肽鋅螯合物會在一定程度上促進(jìn)乳酸菌的生長；肽鋅螯合物完全替代MRS培養(yǎng)基中的有機(jī)氮源時，反而會抑制乳酸菌的產(chǎn)酸活力和人乳酸菌的生長繁殖。在脫脂乳培養(yǎng)基中，乳酸菌的產(chǎn)酸活力和乳酸菌的生長繁殖會隨著添加肽鋅螯合物量的增加更增強(qiáng)[34]。

除此之外，通過使用高通量表面等離子體共振（SPR）分析研究，發(fā)現(xiàn)新型鋅結(jié)合肽已顯示出在確保遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的試驗條件下具有mcDNA結(jié)合和回收的合適性質(zhì)。更重要的是，采用簡單的仿生配體進(jìn)行mcDNA捕獲的直接方法有助于開發(fā)純化DNA生物制藥的新技術(shù)[35]。

2.2 肽鋅螯合物的穩(wěn)定性

肽鋅螯合物在胃相中的穩(wěn)定性是礦物質(zhì)輸送的重要因素。在胃消化期間從肽鋅螯合物中釋放的鋅在進(jìn)入十二指腸時可被肌醇六磷酸競爭性結(jié)合，從而降低生物可接近性[36]。肽鋅螯合物的穩(wěn)定性受到pH的影響，這是因為大多數(shù)肽配體（包括末端氨基和羧酸根陰離子、Asp、Glu和His）響應(yīng)pH變化，導(dǎo)致其金屬配合物的締合或解離。這些配體在中性堿性pH下去質(zhì)子化，然后增加與金屬離子的靜電吸引力從而加強(qiáng)復(fù)合體[37]。相反，酸性環(huán)境會導(dǎo)致這些殘留物的質(zhì)子化，并且往往會削弱吸引力。因此，肽鋅螯合物很可能在胃的酸性pH下解離，如果最終形成不溶性復(fù)合物，最終會導(dǎo)致金屬難以接近。如之前的一項研究報導(dǎo)牦牛酪蛋白肽鋅螯合物在pH 2.0下比在微酸性或堿性pH下釋放更多鋅離子[6]。肽的結(jié)構(gòu)性質(zhì)可以影響其金屬絡(luò)合物的穩(wěn)定性。肽與金屬離子相互作用的能力可取決于它們的凈表面電荷，使得高負(fù)電荷可增強(qiáng)金屬離子親和力并增強(qiáng)金屬絡(luò)合物[38]。Wang等[39]使用兩階段體外消化模型研究3種肽（Ser-Met、Asn-Cys-Ser、谷胱甘肽）及其鋅-肽復(fù)合物的降解特征。在該研究中檢測酶抗性肽和鋅-肽螯合物、抗氧化活性和消化酶釋放的游離氨基酸。結(jié)果顯示，這3種肽及其鋅-肽復(fù)合物對胃蛋白酶具有抗性，但對胰酶不具有抗性。胰酶可部分水解肽和鋅-肽復(fù)合物，但其中1/2以上在胃腸道消化后保持其原始形式。由于螯合物的溶解度較低并且影響胃蛋白酶和胰酶的水解位點，鋅的配位改善肽的酶抗性。鋅-Asn-Cys-Ser對酶水解具有高度抗性并且以可溶形式保持鋅離子，可能具有提高鋅的生物利用度的潛力。

3 結(jié)語與展望

天然蛋白源制得的肽鋅螯合物除了可以作為補(bǔ)鋅劑外，還能以抗氧化劑、抑菌劑、有機(jī)肥料、動物飼料等產(chǎn)品應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)，較一些無機(jī)抗氧化劑、抑菌劑或鋅離子補(bǔ)充劑而言，具有更優(yōu)良的生物學(xué)效價，幾乎無不良毒副作用，具有很高的商業(yè)價值[40]。關(guān)于鋅螯合肽的分離純化及構(gòu)效關(guān)系的分析國內(nèi)外已有諸多報道，但仍有部分問題尚待解決，如鋅離子與肽的螯合率、鋅螯合肽在人體內(nèi)的生物利用度等的提高問題，以及鋅螯合肽與鋅離子作用的具體構(gòu)效關(guān)系等仍需要進(jìn)一步揭示。另外，尋找和鑒定其他天然的新型鋅螯合肽也將會是一個十分有意義的挑戰(zhàn)。肽鋅螯合物作為一種新型鋅離子螯合物，因其特殊的生物活性屬性和在食用藥用等方面的優(yōu)勢使其有十分廣闊的研究和應(yīng)用前景。

對肽鋅螯合物近年來的研究發(fā)展進(jìn)行了總結(jié)，肽鋅螯合物作為一種新型鋅離子螯合物，其特殊的生物活性屬性和在食用藥用等方面的優(yōu)勢使其有十分廣闊的研究和應(yīng)用前景。