• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    玉米大斑病菌StTOXE蛋白的原核表達(dá)及分析

    2020-02-25 08:27:50張運(yùn)峰
    關(guān)鍵詞:大斑條帶病菌

    張運(yùn)峰

    (唐山師范學(xué)院生命科學(xué)系,河北 唐山 063000)

    【研究意義】植物病原真菌中TOXE蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子在真菌寄主選擇性毒素的合成方面具有重要的作用,通過(guò)建立玉米大斑病菌StTOXE蛋白原核表達(dá)體系,為進(jìn)一步開(kāi)展StTOXE蛋白抗體制備、結(jié)構(gòu)解析和StTOXE蛋白功能研究奠定基礎(chǔ)?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】玉米大斑病(Setosphaeriaturcica)是玉米上的重要葉部病害之一,在世界各地的玉米產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生,流行的年份會(huì)造成高達(dá)50 %的玉米減產(chǎn)[1-3]。近年來(lái),關(guān)于玉米大斑病菌的研究主要集中于對(duì)病原菌的Ras[4]、MAPK[1,5]、cAMP及Ca2+途徑等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的結(jié)構(gòu)及功能分析,尤其以對(duì)MAPK信號(hào)途徑的研究最為深入[6]。由于不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間存在著廣泛的交互調(diào)控(Cross Talk)[7],造成一個(gè)信號(hào)途徑產(chǎn)生變化時(shí),其它信號(hào)途徑會(huì)產(chǎn)生補(bǔ)充效應(yīng)。因此,利用這些基因作為靶位點(diǎn)防治玉米大斑病菌的技術(shù)面臨很大的挑戰(zhàn)。在中國(guó)玉米產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)了超過(guò)15個(gè)玉米大斑病菌致病小種,包括0、1、3、N、12、13、1N、23、2N、3N、123、12N、13N、23N和123N[8]。玉米大斑病菌是否能夠?qū)闹饔衩桩a(chǎn)生侵染并形成病害,主要取決于玉米Ht基因的類型[9]。例如:1號(hào)小種會(huì)使基因型為Ht1的玉米品種感病,而對(duì)于Ht2和Ht3、HtN等基因型的玉米植株不能形成侵染。許多植物病原真菌都是通過(guò)分泌真菌毒素侵染寄主植物并使植物產(chǎn)生病理反應(yīng)[10],真菌毒素分為兩類,一類為非寄主選擇性毒素,具有廣泛的寄主侵染活性,一類為寄主選擇性毒素(Host-Selective Toxins,HSTs),它是由病原真菌分泌的一類低分子量次級(jí)代謝產(chǎn)物[11],這一類毒素僅會(huì)對(duì)特異基因型的植物產(chǎn)生病理反應(yīng),決定了病原真菌的寄主范圍和致病性[12]。Ahn Joong-Hoon等[10]首先在玉米圓斑病菌(Cochlioboluscarbonum)研究了HSTs毒素合成的機(jī)制,后相繼在Alternariajesenskae[13]、Burkholderiaglumae[14]等少數(shù)真菌中開(kāi)展研究。研究發(fā)現(xiàn)HSTs合成需要Tox2基因簇,并發(fā)現(xiàn)基因簇中的ToxE基因起著重要作用,TOXE蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控Tox2基因簇多個(gè)基因的協(xié)同表達(dá),進(jìn)而調(diào)控毒素的合成,ToxE基因突變以后,突變體的致病力會(huì)喪失[12]。目前,HSTs合成的機(jī)制在其它植物病原真菌中報(bào)道還較少。【本研究切入點(diǎn)】玉米大斑病菌侵染玉米過(guò)程中存在明顯的小種?;F(xiàn)象,推測(cè)玉米大斑病菌病菌也具有玉米圓斑病菌類似的寄主選擇性毒素合成機(jī)制,因此,開(kāi)展玉米大斑病菌中StToxE基因和其蛋白的研究對(duì)證明和研究玉米大斑病菌寄主選擇性毒素合成機(jī)制具有重要作用?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究將克隆StToxE基因,構(gòu)建StTOXE融合蛋白原核表達(dá)載體,并確定StTOXE融合蛋白最優(yōu)表達(dá)條件及其可溶性特征。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株與質(zhì)粒 原核表達(dá)載體pET-28a(+)由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。玉米大斑病菌野生型Wt01-23和大腸桿菌菌株BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。

    1.1.2 試劑 磁珠法 DNA 膠回收試劑盒、SanPrep 柱式質(zhì)粒 DNA 小量抽提試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒和異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(ITPG)等試劑均購(gòu)自生工(上海)生物工程有限公司;TaqTMDNA 聚合酶、EcoR I和Hind III購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;細(xì)菌蛋白提取試劑盒、Western Blot Marker(PR1800)和Pfu DNA Polymerase購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。Anti-His Tag Antibody (Monoclonal, 9C11)一抗和Goat Anti-Mouse IgG(H+L)Secondary Antibody(HRP Conjugate)二抗均購(gòu)自博士德生物工程有限公司(Boster Biological Technology co.ltd)。氯化鈉、蛋白胨和酵母提取物等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

    1.2 方法

    1.2.1StToxE基因的克隆和凝膠回收 參照張運(yùn)峰[15]的方法提取玉米大斑病菌Wt01-23的RNA,反轉(zhuǎn)成cDNA。以StToxE-F(5’-GCGAATTCATGGCCGATGTCAACGAG-3’)和StToxE-R(5’-GCAA GCTTGGGCACAGCCTAGATTTACATTC-3’)特異引物進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增。 PCR擴(kuò)增體系為:Pfu DNA Polymerase 1.0 μl,10×Pfu buffer 2.5 μl,上下游引物各0.5 μl,cDNA 0.25 μl, 雙蒸水(ddH2O)補(bǔ)足至25 μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸3 min,30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),用磁珠法 DNA 膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

    1.2.2 玉米大斑病菌StToxE基因表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 將1.2.1回收獲得的PCR產(chǎn)物與載體pET28a(+)質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoR I進(jìn)行37 ℃酶切過(guò)夜反應(yīng),用DNA回收試劑盒回收目的基因及載體片段,隨后將載體和PCR產(chǎn)物按1∶5進(jìn)行連接反應(yīng)后,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,用StToxE基因特異引物進(jìn)行篩選陽(yáng)性克隆菌落。使用SanPrep 柱式質(zhì)粒 DNA 小量抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒,并進(jìn)行雙酶切鑒定,最后將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒交生工(上海)生物工程股份有限公司測(cè)序。

    1.2.3 ITPG最適誘導(dǎo)濃度摸索 將含有pET28a-StToxE質(zhì)粒的BL21(DE3)菌株在LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),挑取單菌落接入3 mL LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過(guò)夜,按照1∶100將菌液接種入50 mL LB液體培養(yǎng)基中37 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng),待OD600≈0.8時(shí),加入終濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG,繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h,離心收集菌體沉淀。

    1.2.4 StTOXE蛋白的SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè) 參考宋楊等[16]將收集菌體沉淀并用PBS(磷酸緩沖液pH7.4)懸浮,加入2×聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液,100 ℃煮沸10 min,冰浴5 min后4 ℃、12 000 r/min 離心10 min。使用12 %的SDS-PAGE凝膠對(duì)上清液進(jìn)行電泳,考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)蛋白表達(dá)。

    將目的上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳后,將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,然后進(jìn)行Anti-His Tag Antibody (Monoclonal, 9C11)一抗孵育1.5 h,TBST洗滌5次,再進(jìn)行Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Secondary Antibody(HRP Conjugate)孵育1.5 h,經(jīng)TBST洗膜后用ECL顯色,最后置于化學(xué)發(fā)光成像儀(上海嘉鵬科技有限公司,ZF-670)中檢測(cè);另外,利用Image J軟件對(duì)不同ITPG濃度條件下StTOXE融合蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行灰度分析,定量分析蛋白表達(dá)量的差異。

    1.2.5 StTOXE蛋白的可溶性分析 將經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌液12 000 r/min離心2 min,用PBS(pH 8.0)緩沖液洗滌2次后,沉淀用1 mL PBS緩沖液重懸。細(xì)胞超聲破碎儀功率為200 W,超聲3 s,冷卻5 s進(jìn)行循環(huán)破碎40 min。裂解完成后4 ℃、10 000 r/min離心10 min,分別收集破碎后的上清和沉淀,SDS-PAGE電泳和Western Blot檢測(cè)分析重組蛋白的可溶性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 pET28a-StToxE原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其鑒定

    以玉米大斑病菌的cDNA為模板、StToxE的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在1500 bp的位置擴(kuò)增出一條的清晰、明亮、單一的條帶,與1470 bp理論值 的相同(圖1-A)。將StToxE基因與pET28a載體的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α并獲得轉(zhuǎn)化子,以DH5α、DH5α-pET28a和DH5α-pET28a-StToxE菌體為模板進(jìn)行的PCR篩選,在隨機(jī)挑取的菌落中均擴(kuò)增出了1470 bp的條帶,而對(duì)照組DH5α、DH5α-pET28a均沒(méi)有擴(kuò)增出條帶(圖1-B),證明隨機(jī)挑選的轉(zhuǎn)化菌落均為DH5α-pET28a-StToxE轉(zhuǎn)化子。提取DH5α-pET28a-StToxE轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒后,HindIII和EcoR I雙酶切鑒定,發(fā)現(xiàn)5400和1470 bp的2個(gè)條帶,分別與載體pET28a和StToxE基因大小相同。經(jīng)過(guò)華大基因測(cè)序,堿基序列正確。

    1~4:StToxE基因的擴(kuò)增結(jié)果;5~11:DH5α-pET28a-StToxE;12:pET28a-StToxE重組質(zhì)粒Hind III和EcoR I雙酶切;M:DL2000;M1:1Kb Marker

    2.2 pET28-StToxE表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)及Western Blot檢測(cè)

    通過(guò)高溫煮沸裂解細(xì)菌菌體獲得的上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色,發(fā)現(xiàn)條帶數(shù)目沒(méi)有明顯差異,但在72 kD區(qū)域條帶存在明顯加粗(圖2-A),初步確定StTOXE蛋白已經(jīng)表達(dá)。由于表達(dá)蛋白攜帶His標(biāo)簽,我們利用Western Blot試驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了StTOXE融合蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BL21-pET28a上清液中未檢測(cè)到任何條帶,而B(niǎo)L21-pET28a-StToxE轉(zhuǎn)化子中檢測(cè)到72 kD的條帶(圖2B)。綜合考馬斯亮藍(lán)染色和Western Blot試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步確定StTOXE蛋白在BL21細(xì)胞中表達(dá),且StTOXE蛋白約為72 kD。

    1:BL21-pET28a表達(dá)蛋白; 2: BL21-pET28a-StToxE表達(dá)蛋白

    2.3 不同濃度ITPG對(duì)StTOXE融合蛋白表達(dá)的影響

    BL23-pET28-StToxE轉(zhuǎn)化子在不同濃度ITPG誘導(dǎo)4 h后,Western Blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著ITPG濃度的增加蛋白表達(dá)量逐漸增加,ITPG濃度在0.2 mmol/L時(shí)有明顯的條帶形成,0.4~0.6 mmol/L時(shí)達(dá)到最大;隨后雜交條帶逐漸變淺,表明融合蛋白表達(dá)量逐漸減少(圖3);灰度分析顯示:以0.2 mmol/L為對(duì)照,ITPG濃度達(dá)到0.4和0.6 mmol/L時(shí)顯著高于對(duì)照,表明蛋白表達(dá)量較高,而其它ITPG濃度條件下蛋白表達(dá)量均降低,ITPG濃度達(dá)到0.1 mmol/L,蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(圖4)。

    圖4 StTOXE融合蛋白Western blot的灰度分析結(jié)果Fig.4 Gray analysis results of StTOXE fusion protein Western blot

    2.4 StTOXE表達(dá)蛋白的可溶性檢測(cè)

    離心收集誘導(dǎo)表達(dá)后的含有pET28a-StToxE表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3),取上清及沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色、Western blot檢測(cè),結(jié)果顯示沉淀中在72 kD發(fā)現(xiàn)一條清晰條帶,在上清中沒(méi)有出現(xiàn)同等大小的條帶(圖3-A);Western blot結(jié)果也僅在72 kD位置檢測(cè)到一條清晰的條帶,而上清中為檢測(cè)出StTOXE蛋白(圖3-B)。因此,StTOXE融合蛋白僅存在于沉淀中,在上清中無(wú)明顯表達(dá),表明重組蛋白以包涵體的形式存在,且重組蛋白單體為可溶性蛋白(圖5)。

    1:裂解上清;2:裂解沉淀;M:PageRulerTM prestained protein lader;M1:Western blot marker(PR1800)

    圖3 不同ITPG濃度條件下StTOXE融合蛋白的Western blot檢測(cè)(M:Western blot marker)Fig.3 Western blot detection of StTOXE fusion protein under different concentrations of ITPG

    3 討 論

    毒素是植物病原真菌重要的致病因子,也是植物病原真菌的研究熱點(diǎn)。董金皋等[17]的研究發(fā)現(xiàn)玉米大斑病菌可以產(chǎn)生致病毒素,且該毒素具有寄主專化性活性;張利輝等[18]在研究玉米大斑病菌2號(hào)小種毒素成份時(shí)指出玉米大斑病毒素中含有寄主選擇性毒素組份。本研究從玉米大斑病菌野生型菌種Wt01-23中克隆獲得了StToxE基因,構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a-StToxE,并在大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行了原核表達(dá),通過(guò)分別收集破碎細(xì)胞的上清和沉淀,分析了表達(dá)蛋白的形式和可溶性。

    由于構(gòu)建的pET-28a (+)載體的StToxE無(wú)終止子,且StTOXE融合蛋白在N端和C端分別各含有1個(gè)His-Tag,在N端還有1個(gè)T7-Tag,結(jié)合前期利用生物信息學(xué)工具分析StToxE融合蛋白獲得數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)另行發(fā)表)理論分子量約為55 kD。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示StTOXE融合蛋白的大小約為72 kD,比理論值大30.9 %。在前人研究結(jié)果中顯示表達(dá)蛋白分子量與預(yù)測(cè)值存在差異的情況并不少見(jiàn)[19-22],甚至有文獻(xiàn)報(bào)道SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果超過(guò)預(yù)測(cè)值的70 %~100 %[23-24],這個(gè)結(jié)果產(chǎn)生的原因His是堿性氨基酸帶有正電荷,而6個(gè)His的標(biāo)簽所帶的正電荷就更多,從而降低了泳動(dòng)速率,導(dǎo)致表觀分子質(zhì)量變大;另外,具有結(jié)合DNA的活性的蛋白,也會(huì)進(jìn)一步增加蛋白的分子質(zhì)量[24],從而導(dǎo)致電泳結(jié)果和預(yù)測(cè)值有較大差異。

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低濃度時(shí)StTOXE外源蛋白的表達(dá)量隨IPTG 濃度增加而逐漸升高,在IPTG 濃度為0.4~0.6 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值,此后隨著IPTG 濃度的增加表達(dá)量反而下降,可能是因?yàn)楦邼舛鹊腎PTG 會(huì)對(duì)細(xì)菌菌體的生長(zhǎng)造成毒害作用,同時(shí)為了節(jié)約研究成本,選擇0.5 mmol/L為最適誘導(dǎo)濃度。另外,在37 ℃條件下,StTOXE融合蛋白全部以包涵體形式存在于宿主菌中。包涵體的形成是外源蛋白高效表達(dá)時(shí)的普遍現(xiàn)象[25],較高的溫度可以提高翻譯起始效率,增加蛋白表達(dá)量[26],但是外源蛋白表達(dá)過(guò)快時(shí)往往造成蛋白不能自發(fā)折疊卷曲生成有一定空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì),從而形成包涵體,影響蛋白活性。減少包涵體的形成比率可以通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基、降低誘導(dǎo)溫度[27-28]、使用增溶標(biāo)簽[29]、使用突變菌株[30]等方法,其中,降低誘導(dǎo)溫度是常用的增強(qiáng)蛋白可溶性[31]的有效方法,后期試驗(yàn)中可開(kāi)展通過(guò)降低誘導(dǎo)溫度增加StTOXE融合蛋白溶解性的研究。

    4 結(jié) 論

    本研究通過(guò)RT-PCR克隆了玉米大斑病菌StToxE基因;將StToxE基因插入PET28原核表達(dá)載體中成功構(gòu)建了StTOXE融合蛋白表達(dá)載體pET28a-StToxE,并將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21菌株中獲得BL21-pET28a-StToxE轉(zhuǎn)化子;通過(guò)ITPG誘導(dǎo)、Western Blot檢測(cè)確認(rèn)了StTOXE融合蛋白在BL21菌株中表達(dá),并發(fā)現(xiàn)ITPG濃度為0.4~0.6 mmol/L時(shí)融合蛋白表達(dá)效率最高;當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37 ℃時(shí)StTOXE融合蛋白基本以包涵體形式存在細(xì)胞內(nèi),且融合蛋白單體為可溶性蛋白。

    猜你喜歡
    大斑條帶病菌
    大斑啄木鳥(niǎo)敲呀敲呀敲呀
    大斑啄木鳥(niǎo)和它的寶寶
    幼兒100(2023年18期)2023-05-29 08:34:36
    遇見(jiàn)啄木鳥(niǎo)
    大斑啄木鳥(niǎo)
    孩子(2019年8期)2019-08-26 05:43:32
    小病菌影響鴉片戰(zhàn)爭(zhēng)
    特別健康(2018年3期)2018-07-04 00:40:24
    頭狀莖點(diǎn)霉病菌的新寄主高粱及病菌的檢疫鑒定(內(nèi)文第98~101頁(yè))圖版
    油茶炭疽病菌拮抗木霉菌的分離與篩選
    病菌來(lái)了 快穿好防菌衣
    基于條帶模式GEOSAR-TOPS模式UAVSAR的雙基成像算法
    基于 Savitzky-Golay 加權(quán)擬合的紅外圖像非均勻性條帶校正方法
    亚洲精品自拍成人| 青青草视频在线视频观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 人成视频在线观看免费观看| 欧美日韩综合久久久久久| 免费人成在线观看视频色| 日韩制服骚丝袜av| 在线播放无遮挡| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲国产精品专区欧美| 日本与韩国留学比较| 在线看a的网站| 久久人妻熟女aⅴ| 新久久久久国产一级毛片| 久久久久精品久久久久真实原创| 欧美最新免费一区二区三区| 国产免费现黄频在线看| 亚洲欧美精品自产自拍| xxx大片免费视频| 成人无遮挡网站| 亚洲国产成人一精品久久久| 精品久久久久久久久av| 亚洲精品456在线播放app| 中文欧美无线码| 国产欧美亚洲国产| 亚洲欧美色中文字幕在线| 久久久国产欧美日韩av| 国产爽快片一区二区三区| 欧美精品高潮呻吟av久久| 黄色一级大片看看| 99热国产这里只有精品6| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 狂野欧美激情性bbbbbb| 蜜桃在线观看..| 精品人妻偷拍中文字幕| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 精品视频人人做人人爽| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲综合精品二区| 在线观看一区二区三区激情| 99国产综合亚洲精品| 成人国产麻豆网| 久久青草综合色| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产欧美亚洲国产| 少妇人妻 视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 91精品国产九色| 高清视频免费观看一区二区| 欧美日韩在线观看h| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 你懂的网址亚洲精品在线观看| 桃花免费在线播放| 在现免费观看毛片| 另类亚洲欧美激情| 精品少妇内射三级| 色哟哟·www| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 欧美最新免费一区二区三区| 久久久久视频综合| a 毛片基地| 日韩一区二区视频免费看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲成人一二三区av| 欧美人与善性xxx| 大香蕉久久成人网| 在线观看国产h片| 99热全是精品| 亚洲精品一二三| av在线观看视频网站免费| 久久ye,这里只有精品| 国产日韩欧美视频二区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 色婷婷av一区二区三区视频| 成年人午夜在线观看视频| 男人添女人高潮全过程视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲精品国产色婷婷电影| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 日韩成人伦理影院| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 777米奇影视久久| 老司机影院成人| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产片内射在线| 午夜激情福利司机影院| 欧美+日韩+精品| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精品一区二区在线观看99| 视频区图区小说| 最新的欧美精品一区二区| 国产男人的电影天堂91| 亚洲成人一二三区av| 欧美日本中文国产一区发布| 国产国语露脸激情在线看| 国产精品久久久久久av不卡| 日韩视频在线欧美| 在线观看免费日韩欧美大片 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 七月丁香在线播放| 国产黄色视频一区二区在线观看| 99re6热这里在线精品视频| av免费观看日本| 中文字幕av电影在线播放| 日日啪夜夜爽| 母亲3免费完整高清在线观看 | 最新的欧美精品一区二区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲成人一二三区av| 国产探花极品一区二区| 99国产综合亚洲精品| 最近中文字幕2019免费版| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 涩涩av久久男人的天堂| 黄色欧美视频在线观看| 午夜福利,免费看| 日本-黄色视频高清免费观看| 欧美日韩在线观看h| 久久久国产一区二区| 嫩草影院入口| 久久久久国产精品人妻一区二区| 一级黄片播放器| 亚洲国产精品999| 欧美日韩精品成人综合77777| 精品卡一卡二卡四卡免费| videos熟女内射| 久久人妻熟女aⅴ| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产精品一二三区在线看| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 女性生殖器流出的白浆| 五月伊人婷婷丁香| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 日韩电影二区| 另类亚洲欧美激情| 在线天堂最新版资源| 日本与韩国留学比较| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲成人手机| 青春草国产在线视频| 午夜免费观看性视频| 最新的欧美精品一区二区| 久久97久久精品| 亚洲图色成人| 2022亚洲国产成人精品| 性色avwww在线观看| av专区在线播放| 亚洲av中文av极速乱| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲第一av免费看| 在线观看免费日韩欧美大片 | 午夜福利,免费看| 日本wwww免费看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲av二区三区四区| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 熟女人妻精品中文字幕| 伊人久久精品亚洲午夜| 大码成人一级视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 男女高潮啪啪啪动态图| 9色porny在线观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产爽快片一区二区三区| a级片在线免费高清观看视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产免费一级a男人的天堂| 日本wwww免费看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲精品中文字幕在线视频| 热99久久久久精品小说推荐| 日本与韩国留学比较| 免费大片18禁| 久久99热6这里只有精品| 国产欧美亚洲国产| 久久ye,这里只有精品| 亚洲图色成人| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 久久韩国三级中文字幕| 国产色爽女视频免费观看| 男女边摸边吃奶| 久久精品久久精品一区二区三区| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 欧美bdsm另类| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品.久久久| 高清av免费在线| 久久久久久久大尺度免费视频| 免费观看av网站的网址| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲图色成人| 国产 一区精品| 美女cb高潮喷水在线观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 九草在线视频观看| 久久ye,这里只有精品| 伊人久久国产一区二区| 黄片无遮挡物在线观看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲国产精品999| 成人国产av品久久久| 大香蕉久久成人网| 男人爽女人下面视频在线观看| 欧美+日韩+精品| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 色婷婷av一区二区三区视频| 秋霞在线观看毛片| 免费观看av网站的网址| 大片免费播放器 马上看| 久久久精品免费免费高清| 日本wwww免费看| 最近的中文字幕免费完整| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美性感艳星| 亚洲三级黄色毛片| 久久久久久伊人网av| 国产日韩欧美视频二区| 中文天堂在线官网| 免费观看的影片在线观看| 午夜福利,免费看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 99久久综合免费| 久久亚洲国产成人精品v| 色吧在线观看| 亚洲人成网站在线播| 久久久久久久久久久久大奶| 日本av手机在线免费观看| 内地一区二区视频在线| 国产一区有黄有色的免费视频| 大片免费播放器 马上看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产一级毛片在线| 大片免费播放器 马上看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 99国产综合亚洲精品| 三级国产精品片| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 精品一区在线观看国产| 久久精品夜色国产| 另类亚洲欧美激情| 成人手机av| 国产成人av激情在线播放 | 新久久久久国产一级毛片| 中文天堂在线官网| 国产精品熟女久久久久浪| 不卡视频在线观看欧美| 国产高清国产精品国产三级| 人妻 亚洲 视频| 精品一区二区免费观看| 特大巨黑吊av在线直播| 在线天堂最新版资源| 国产精品欧美亚洲77777| 黑人猛操日本美女一级片| 欧美精品一区二区大全| 成人国产av品久久久| 亚洲美女视频黄频| 精品国产国语对白av| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 熟女电影av网| 国产精品人妻久久久影院| 美女国产高潮福利片在线看| 成年女人在线观看亚洲视频| 美女大奶头黄色视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 欧美xxxx性猛交bbbb| 色5月婷婷丁香| 最黄视频免费看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 丁香六月天网| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲五月色婷婷综合| 在线天堂最新版资源| 久久 成人 亚洲| 久久av网站| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| av在线app专区| 精品久久久久久久久亚洲| 一级黄片播放器| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 男男h啪啪无遮挡| 欧美激情国产日韩精品一区| 黄片播放在线免费| 午夜日本视频在线| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产精品久久久久久久久免| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 久久久久久久久久久丰满| 亚洲天堂av无毛| 久久久久国产精品人妻一区二区| 久久免费观看电影| av女优亚洲男人天堂| 插逼视频在线观看| 插阴视频在线观看视频| 免费av不卡在线播放| 亚洲色图综合在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 欧美国产精品一级二级三级| 午夜免费观看性视频| 777米奇影视久久| av在线app专区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 自线自在国产av| 69精品国产乱码久久久| 18禁动态无遮挡网站| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 老司机影院成人| 全区人妻精品视频| 亚洲国产最新在线播放| 大陆偷拍与自拍| 毛片一级片免费看久久久久| 国产精品一区二区在线观看99| 中文字幕av电影在线播放| 国产精品99久久久久久久久| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲精品一二三| 一级毛片电影观看| 少妇的逼水好多| 国产精品免费大片| 一级毛片aaaaaa免费看小| 中国三级夫妇交换| 国产一区有黄有色的免费视频| 99热网站在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日本vs欧美在线观看视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 男人操女人黄网站| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 一区在线观看完整版| 免费看av在线观看网站| 69精品国产乱码久久久| 国产爽快片一区二区三区| 最黄视频免费看| 91精品国产九色| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 亚洲国产精品国产精品| 亚洲国产精品999| 午夜激情久久久久久久| 国产色婷婷99| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 精品一区二区三卡| 国产男女内射视频| 国产精品国产av在线观看| 一级毛片电影观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 黄色怎么调成土黄色| 五月开心婷婷网| 久久97久久精品| www.av在线官网国产| 观看美女的网站| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 午夜视频国产福利| 男女高潮啪啪啪动态图| 午夜福利,免费看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 黄色配什么色好看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 少妇高潮的动态图| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲成人av在线免费| 精品国产国语对白av| 欧美日韩综合久久久久久| 日韩欧美精品免费久久| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 99久国产av精品国产电影| 男女免费视频国产| 简卡轻食公司| 久久99精品国语久久久| 妹子高潮喷水视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 三上悠亚av全集在线观看| 人人妻人人澡人人看| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 精品久久久噜噜| 一本色道久久久久久精品综合| 久久精品久久久久久久性| 亚洲国产精品国产精品| 欧美成人精品欧美一级黄| 不卡视频在线观看欧美| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久免费观看电影| 最近中文字幕高清免费大全6| 丁香六月天网| 欧美精品一区二区免费开放| 一本大道久久a久久精品| 人妻 亚洲 视频| av免费观看日本| 精品一区二区三区视频在线| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 成人国语在线视频| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 好男人视频免费观看在线| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 男女边摸边吃奶| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 久久久久久久久久成人| 各种免费的搞黄视频| 亚洲精品一区蜜桃| 777米奇影视久久| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 高清av免费在线| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产黄片视频在线免费观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 一区二区三区免费毛片| 精品人妻在线不人妻| 精品午夜福利在线看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日韩中字成人| 久久精品久久久久久久性| 这个男人来自地球电影免费观看 | 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 一级毛片电影观看| 午夜免费观看性视频| 国产男女内射视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 日本黄色片子视频| 久久久亚洲精品成人影院| 大片免费播放器 马上看| 人妻一区二区av| 精品久久久久久久久av| 99热这里只有精品一区| 男女边摸边吃奶| 人妻人人澡人人爽人人| 免费观看性生交大片5| 亚洲欧美清纯卡通| 人成视频在线观看免费观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 69精品国产乱码久久久| 老女人水多毛片| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 精品一品国产午夜福利视频| av一本久久久久| 一个人看视频在线观看www免费| 99久久综合免费| 亚洲欧美精品自产自拍| 日韩一区二区三区影片| 精品国产乱码久久久久久小说| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 啦啦啦在线观看免费高清www| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产片内射在线| 亚洲精品美女久久av网站| 丰满少妇做爰视频| 人成视频在线观看免费观看| 国产一级毛片在线| av免费观看日本| 国产一级毛片在线| 男人操女人黄网站| 日本黄色片子视频| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 日韩亚洲欧美综合| 色网站视频免费| 日韩欧美精品免费久久| 大香蕉久久网| 黄片播放在线免费| 在线播放无遮挡| 亚洲少妇的诱惑av| 日韩精品有码人妻一区| 高清在线视频一区二区三区| 日韩大片免费观看网站| 97超碰精品成人国产| 国产高清有码在线观看视频| 九九在线视频观看精品| 尾随美女入室| 亚洲高清免费不卡视频| 国产精品 国内视频| 欧美3d第一页| 中国三级夫妇交换| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲高清免费不卡视频| 国产精品 国内视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 一本色道久久久久久精品综合| 国产又色又爽无遮挡免| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久99一区二区三区| 久久精品国产亚洲网站| 精品久久久久久电影网| 久久狼人影院| 国产黄片视频在线免费观看| 天堂中文最新版在线下载| a级毛色黄片| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 黄色欧美视频在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产免费现黄频在线看| 在线 av 中文字幕| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产乱人偷精品视频| 丰满乱子伦码专区| 亚洲成色77777| 九色亚洲精品在线播放| 日韩精品有码人妻一区| 秋霞伦理黄片| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲高清免费不卡视频| 免费观看在线日韩| 国产片特级美女逼逼视频| 永久免费av网站大全| 老司机亚洲免费影院| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 老司机影院成人| 寂寞人妻少妇视频99o| 欧美日韩av久久| 亚洲精品自拍成人| 少妇 在线观看| 2022亚洲国产成人精品| 丰满饥渴人妻一区二区三| 免费高清在线观看视频在线观看| 蜜桃国产av成人99| 人人妻人人澡人人看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 夫妻午夜视频| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 一级a做视频免费观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品久久国产蜜桃| 赤兔流量卡办理| 亚洲情色 制服丝袜| a级片在线免费高清观看视频| 天堂8中文在线网| 亚洲,欧美,日韩| 国产视频内射| 午夜激情av网站| 91久久精品电影网| 美女国产高潮福利片在线看| 久久久久久久久久久久大奶| 99热全是精品| 日本av免费视频播放| 内地一区二区视频在线| 男女高潮啪啪啪动态图| 99国产综合亚洲精品| 久久久精品区二区三区| 日韩三级伦理在线观看| 国产成人一区二区在线| 亚洲精品国产av成人精品| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产免费一级a男人的天堂| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 欧美+日韩+精品| 色婷婷久久久亚洲欧美| 男人操女人黄网站| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲内射少妇av| 色5月婷婷丁香| 亚洲欧美精品自产自拍| 日日摸夜夜添夜夜爱| 最近中文字幕2019免费版| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 久久久久久久久久久久大奶| 国产片特级美女逼逼视频| 男的添女的下面高潮视频| 午夜激情av网站| 男女啪啪激烈高潮av片| 简卡轻食公司| 免费人妻精品一区二区三区视频| 免费看av在线观看网站| 精品久久久久久久久亚洲| 十八禁高潮呻吟视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| av视频免费观看在线观看| 9色porny在线观看| 国产成人精品福利久久| 国产成人a∨麻豆精品| 免费高清在线观看日韩| 免费观看的影片在线观看| 国产精品 国内视频| 乱人伦中国视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 午夜福利网站1000一区二区三区| 老熟女久久久| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 边亲边吃奶的免费视频| av黄色大香蕉| 国产综合精华液| 成人毛片60女人毛片免费| 午夜精品国产一区二区电影| 久久ye,这里只有精品| 永久网站在线| 内地一区二区视频在线| 9色porny在线观看| 边亲边吃奶的免费视频| av在线app专区| av在线播放精品| 久久免费观看电影| av在线老鸭窝| 毛片一级片免费看久久久久| 国产精品成人在线| 欧美97在线视频| 亚洲国产最新在线播放| av免费观看日本|