參附益心方對(duì)缺氧原代心肌細(xì)胞脂肪酸利用的影響

喬利杰 李彬# 王新陸 謝世陽(yáng) 高原 朱明軍 王永霞

中圖分類號(hào)R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào) 1001-0408（2020）02-0149-05

DOI l0.6039/j.issn.1001-0408.2020.02.05

摘要 目的：探討參附益心方對(duì)缺氧原代心肌細(xì)胞脂肪酸利用的影響及其可能機(jī)制。方法：取新生l-3d的SD大鼠心尖部組織，進(jìn)行原代心肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定，并將細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、模型組、輔酶Q.。組（陽(yáng)性對(duì)照，1X10^-4mol/L）和參附益心方低、高劑量組（0.25、0.5 mg/mL）。除正常組外，其余各組細(xì)胞均于5%02、5qoCO2、90%N2條件下培養(yǎng)6h以復(fù)制缺氧損傷模型。缺氧6h后，采用熒光素酶發(fā)光法檢測(cè)各組細(xì)胞中三磷酸腺苷（ATP）的含量，采用Westem blotting法檢測(cè)其脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（FAT/CD36）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPARa、PPARp/8）的表達(dá)情況。結(jié)果：與正常組比較，模型組細(xì)胞中ATP含量以及FAT/CD36蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，輔酶Q10組和參附益心方高劑量組細(xì)胞中ATP含量均顯著升高，而輔酶010組細(xì)胞中FAT/CD36、PPARa蛋白，參附益心方高劑量組細(xì)胞中FAT/CD36蛋白以及參附益心方各劑量組細(xì)胞中PPARa、PPARp/8蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。結(jié)論：參附益心方可通過(guò)抑制FAT/CD36、PPARa、PPARp/8蛋白的表達(dá)來(lái)抑制缺氧原代心肌細(xì)胞的脂肪酸利用，改善其能量代謝。

關(guān)鍵詞 缺氧;原代心肌細(xì)胞;脂肪酸;代謝;參附益心方

心力衰竭（以下簡(jiǎn)稱“心衰”）是由于心臟收縮或舒張功能異常，導(dǎo)致排血量不能滿足機(jī)體正常需求而引發(fā)的以氣喘、乏力、水腫為主要表現(xiàn)的一系列臨床綜合征，為多種心臟疾病發(fā)展的最終階段。有學(xué)者認(rèn)為，心肌維持正常生理活動(dòng)所需的能量得不到滿足或代謝失于平衡，可引起心臟結(jié)構(gòu)與功能受損從而導(dǎo)致超負(fù)荷心肌損害，進(jìn)一步引發(fā)心衰[1]。由此可見(jiàn)，改善心肌能量代謝對(duì)緩解心衰患者的癥狀至關(guān)重要。脂肪酸是心肌細(xì)胞產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP）的主要底物，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究證實(shí)，抑制脂肪酸利用可改善心肌能量代謝，延緩心衰病程進(jìn)展[2-3]。

參附益心方為治療心衰的經(jīng)驗(yàn)方。有不少研究證明，該方可改善慢性心衰模型大鼠的心功能，降低其血清心房鈉尿肽（ANP）、B型腦鈉肽（BNP）和心肌血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）水平，下調(diào)心肌細(xì)胞及其線粒體中活性氧（ROS）的表達(dá)，并上調(diào)ATP、肌酸激酶（CK）的含量，提高心肌細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性，從而達(dá)到緩解心衰癥狀的目的[4-6]。但目前有關(guān)該方對(duì)脂肪酸利用的影響尚未明確。為此，本研究擬建立缺氧原代心肌細(xì)胞模型，觀察參附益心方對(duì)其脂肪酸利用的影響，并初步探討可能的作用機(jī)制，以期為該方治療慢性心衰提供更有力的理論依據(jù)。

l 材料

1.1 儀器

BCM-IOOOA型生物超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;RC0-3000TVBB型C02培養(yǎng)箱（美國(guó)Revco公司）;JA203型電子分析天平（上海海康電子儀器廠）;TDL-50B型低速臺(tái)式大容量離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）;CK40型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;DMI3006型熒光倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司）;MK3型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;ChemiDoc XRS+型化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

參附益心方浸膏干粉（山東步長(zhǎng)制藥股份有限公司，批號(hào)：131101，規(guī)格：1g干粉相當(dāng)于生藥總量9.5 g）;輔酶Q10片[衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H10930021，規(guī)格：10 mg];心肌細(xì)胞消化液（含胰蛋白酶0.16 g、氯化鈉1.6 g、碳酸氫鈉0.070 6 g、葡萄糖0.198 2g、氯化鉀0.059 6 g、羥乙基哌嗪乙磺酸0.4 g.ddH20 200mL，批號(hào)：T1320）、DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)：12100）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，批號(hào)：P1020）、RIPA蛋白裂解液（批號(hào)：ROOIO）、蛋白上樣緩沖液（批號(hào)：P1015）、CCK-8試劑（批號(hào)：CA1210）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：PC0020）、ECL發(fā)光液（批號(hào)：PEOOIO）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;溴脫氧尿核苷（Brdu，批號(hào)：B9285）、4 ，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，批號(hào)：D9542）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;YOYO-I染料（批號(hào)：Y3601）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：11752050）、擴(kuò)增試劑盒（批號(hào)：11744500）均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;Opti-MEM培養(yǎng)基（批號(hào)：31985088）、胰蛋白酶（批號(hào)：27250018）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;兔源心肌肌鈣蛋白I（cTn I）多克隆抗體（批號(hào)：BM1765）、SABC-FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)：SA1064）均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液（華美生物工程有限公司，批號(hào)：C0040）;ATP檢測(cè)試劑盒（瑞士Roche公司，批號(hào)：11699695001）;兔抗大鼠脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（FATICD36）多克隆抗體（批號(hào)：ab64014）、兔抗大鼠過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARa）多克隆抗體（批號(hào)：ab24509）、兔抗大鼠PPARβ/δ多克隆抗體（批號(hào)：ab23673）均購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司;兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體（批號(hào)：10494-1-AP）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG=抗（批號(hào)：SA00001-2）均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;胎牛血清（FBS，以色列Biological Industries公司，批號(hào)：04-OO1-1A）;其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，新生1～3 d，雌雄不限，體質(zhì)量約5～6 g，由河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（豫）2015-0005。

2 方法

2.1 藥液制備

2.1.1參附益心方藥液參考本課題組已發(fā)表文獻(xiàn)[6]，稱取參附益心方浸膏干粉0.25 g，用DMEM高糖培養(yǎng)基10 mL稀釋，經(jīng)0.2 μm濾膜濾過(guò)后，制得質(zhì)量濃度為25mg/mL（以浸膏干粉質(zhì)量計(jì)）的藥液。需現(xiàn)用現(xiàn)配。2.1.2輔酶Q.。藥液稱取輔酶Q10片50 mg，用DMEM高糖培養(yǎng)基5.8 mL稀釋，經(jīng)0.2 μm濾膜濾過(guò)后，制得濃度為1X10^-2mol/L的藥液，備用。

2.2 原代心肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)與鑒定

于無(wú)菌條件下取出乳鼠的心尖部，以4℃的PBS清洗3次，隨后將其剪成約1 mm3大小的組織塊，經(jīng)含0.08%胰蛋白酶的心肌細(xì)胞消化液吹打混勻后，轉(zhuǎn)移至玻璃瓶?jī)?nèi)，于37℃水浴中孵育6 min，自然沉淀，棄去上清液;再同法反復(fù)消化約7～8次，直到組織塊變成白色透亮狀。取各次自然沉淀后的上清液與等體積含20%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基混勻，以1 000 r/min離心5min，棄去上清液，沉淀與含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱“完全培養(yǎng)基”）1 mL混合，用200目篩網(wǎng)濾過(guò)，去除未完全消化的組織塊，得細(xì)胞懸液。取上述細(xì)胞懸液適量，于37℃、5%C02培養(yǎng)箱（下同）中差速貼壁培養(yǎng)90 min后，吸取細(xì)胞懸液，以1 000 r/min離心5min，棄去上清液，沉淀與完全培養(yǎng)基充分混合，制成細(xì)胞懸液。取少量該細(xì)胞懸液，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液染色，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)以計(jì)算活細(xì)胞比率（染色后，死細(xì)胞呈藍(lán)色）：活細(xì)胞比率=活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）XlOO%。用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為4x10⁵個(gè)/mL，加入濃度為0.1 mmol/L的Brdu溶液中以抑制成纖維細(xì)胞增殖，培養(yǎng)48h后，棄去上清液，細(xì)胞用不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基同步培養(yǎng)24 h;棄去上清液，用PBS清洗3遍，置于4%多聚甲醛溶液中固定10 min，加入cTnI多克隆抗體（稀釋度為1：50），4℃孵育過(guò)夜;加入SABC-FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（稀釋度為1：100），避光孵育2h;加入DAPI避光染色5min，用水溶性封片劑封孔，于熒光倒置顯微鏡下觀察、拍照。隨機(jī)選取6個(gè)視野，記錄視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)目（N1）和心肌細(xì)胞數(shù)（n1，即熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)），計(jì)算心肌細(xì)胞比例：心肌細(xì)胞比例=n1/N1×1OO%。當(dāng)該比例超過(guò)85%，表明原代心肌細(xì)胞純度達(dá)到試驗(yàn)要求，可用以進(jìn)行后續(xù)研究[6]。

2.3 分組、造模與給藥

取“2.2”項(xiàng)下原代心肌細(xì)胞適量接種于96孔板中，將其隨機(jī)分成正常組、模型組、輔酶Q.。組（陽(yáng)性對(duì)照，IX10^-4 mol/L，劑量參考本課題組前期CCK-8試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）和參附益心方低、高劑量組（0.25、0.5 mg/mL，以浸膏干粉質(zhì)量計(jì)，劑量參考本課題組前期CCK-8試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。正常組和模型組加入完全培養(yǎng)基2 mL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基2 mL。除正常組外，其余各組細(xì)胞均于5% 02、5%C02、90%N2條件下培養(yǎng)6h（缺氧時(shí)間根據(jù)本課題組前期YOYO-1染色試驗(yàn)結(jié)果確定），復(fù)制缺氧損傷模型;正常組細(xì)胞則于37℃、5%C02條件下培養(yǎng)6h。

2.4 缺氧原代心肌細(xì)胞中ATP含量檢測(cè)

按“2.2”項(xiàng)下方法分離、培養(yǎng)、鑒定原代心肌細(xì)胞后，再按“2.3”項(xiàng)下方法分組、給藥、造模。缺氧6h后，吸棄各孔上清液，用常溫PBS清洗2～3次，每次1min，然后采用熒光素酶發(fā)光法以酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞中ATP的含量，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)重復(fù)操作3次。

2.5 缺氧原代心肌細(xì)胞中FAT/CD36、PPARα、PPARβ/δ蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

按“2.2”項(xiàng)下方法分離、培養(yǎng)、鑒定原代心肌細(xì)胞后，再按“2.3”項(xiàng)下方法分組、給藥、造模。缺氧6h后，采用Western blotting法檢測(cè)心肌細(xì)胞中FAT/CD36、PPARa、PPARp/8蛋白的表達(dá)情況。用RIPA蛋白裂解液300 μL反復(fù)吹打破碎細(xì)胞，于4℃、12 000 r/min離心10 min后，取上清液。采用BCA法測(cè)定各組細(xì)胞的蛋白濃度后，加入4x蛋白上樣緩沖液適量，于100℃煮沸變性5min。取變性后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳（先于80 V下電泳20 min，再于120V下電泳lh），濕法轉(zhuǎn)膜（恒流：250 mA，時(shí)間：2h），以5%脫脂奶粉室溫下封閉2h后，加入相應(yīng)一抗（ FATICD36、PPARa、PPARp/8、GAPDH，稀釋度分別為1：1 000、1：1 000、1：1 000、1：4 000），4 cC孵育過(guò)夜;然后加入相應(yīng)二抗（稀釋度為1：5 000），室溫孵育2h后，經(jīng)ECL發(fā)光液孵育后于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上顯影并拍照。采用Image Pro Plus 6.O軟件分析各蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值比值來(lái)表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.O軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析或f檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 原代心肌細(xì)胞的鑒定

顯微鏡下可見(jiàn)，原代心肌細(xì)胞呈星形或者梭形生長(zhǎng)，相互接觸交織成網(wǎng)，且呈現(xiàn)同步搏動(dòng)，搏動(dòng)頻率、節(jié)律、強(qiáng)度穩(wěn)定，頻率為70～130次/min。原代心肌鑒定結(jié)果見(jiàn)本課題組已發(fā)表文獻(xiàn)[6]。

3.2 參附益心方對(duì)缺氧原代心肌細(xì)胞ATP含量的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞ATP含量顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，輔酶Q10組和參附益心方高劑量組細(xì)胞ATP含量均顯著升高（P<0.05），詳見(jiàn)表1。

3.3 參附益心方對(duì)缺氧原代心肌細(xì)胞中FAT/CD36、PPARα、PPARβ/δ蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞中FAT/CD36蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P<0.05）;而PPARa、PPARβ/δ蛋白的相對(duì)表達(dá)量與正常組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，輔酶Q.。組細(xì)胞中FAT/CD36、PPARa蛋白，參附益心方高劑量組細(xì)胞中FAT/CD36蛋白以及參附益心方各劑量組細(xì)胞中PPARα、PPARβ/δ蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.05），詳見(jiàn)圖1、表2。

4 討論

正常生理?xiàng)l件下，心臟運(yùn)動(dòng)所需的ATP約有60%～80%來(lái)自于脂肪酸代謝，20%～40%來(lái)自于碳水化合物（葡萄糖、乳酸、酮體）代謝;在消耗等量氧氣的情況下，脂肪酸代謝途徑比碳水化合物（葡萄糖）代謝途徑產(chǎn)生的ATP少[7]。可見(jiàn)，在心衰發(fā)生時(shí)，心肌細(xì)胞缺血缺氧能量生成不足，而抑制脂肪酸代謝、增加葡萄糖氧化供能將更有助于心肌獲益。

ATP是心臟可直接利用的能量形式，對(duì)維持心肌細(xì)胞正常代謝和功能具有重要意義;若ATP生產(chǎn)不足，將導(dǎo)致心肌收縮和舒張功能減弱[8]。輔酶Q.。是線粒體氧化磷酸化的輔酶之一，對(duì)線粒體氧化磷酸化和細(xì)胞ATP的形成具有重要作用;同時(shí)，其可增加心輸出量，降低外周阻力，是治療心衰的常用藥物[9]。因此，本研究選擇輔酶Q10作為陽(yáng)性對(duì)照。

FAT/CD36作為脂肪酸轉(zhuǎn)位酶，存在于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜上，參與脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，并影響機(jī)體對(duì)脂肪酸的利用[10]。有研究證實(shí)，F(xiàn)AT/CD36編碼基因缺失大鼠的脂肪酸攝取率明顯降低，而葡萄糖利用度明顯升高[11]。由此可見(jiàn)，可通過(guò)抑制心衰模型大鼠FAT/CD36蛋白的表達(dá)來(lái)抑制心肌細(xì)胞對(duì)脂肪酸的利用。PPAR家族為過(guò)氧化氫酶增殖物激動(dòng)受體，其生理功能主要涉及脂肪酸代謝、糖代謝、細(xì)胞增殖與分化等[12]。其中，PPARa為機(jī)體調(diào)控脂肪酸代謝的重要因子，可參與脂肪酸B氧化過(guò)程，活化的PPARa可提高肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I（CPT-I）編碼基因的表達(dá)，后者可促使脂肪酸通過(guò)線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)移至線粒體基質(zhì)內(nèi)，然后被機(jī)體代謝[13]。Morgan EE等[14]研究發(fā)現(xiàn)，心衰患者心肌組織脂肪酸氧化率下調(diào)與PPARa蛋白表達(dá)減少有關(guān)。PPARβ/δ可通過(guò)調(diào)控CPT-I、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體y輔助活化因子la（PGC-1a）等編碼基因的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)脂肪酸B氧化過(guò)程，其反應(yīng)強(qiáng)度與機(jī)體脂肪酸利用呈正比[15]。有研究證實(shí)，心衰患者心肌PPARβ/δ蛋白表達(dá)下降，脂肪酸氧化將受到抑制，而葡萄糖有氧代謝則會(huì)增加[16]。由此可見(jiàn)，抑制PPARa、PPARβ/δ蛋白及其編碼基因的表達(dá)對(duì)延緩心衰患者的疾病進(jìn)展至關(guān)重要。

中醫(yī)認(rèn)為，心衰多因外感風(fēng)寒、內(nèi)傷飲食、情志失暢、溫?zé)嵋叨救站脤?dǎo)致氣血虧虛、心脈失養(yǎng)而引起，病位在心，涉及肺、脾、腎三臟，病機(jī)總屬本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜，本虛為氣虛、陽(yáng)虛，標(biāo)實(shí)為痰飲、血瘀、水停，治法宜益氣溫陽(yáng)、活血利水[17]。河南中醫(yī)藥大學(xué)孫建芝教授以此法立方，得參附益心方。方中以人參大補(bǔ)元?dú)鉃榫?，使氣旺血行，水飲痰濕無(wú)以停聚;附子、桂枝為臣，溫腎陽(yáng)、通心脈，使元陽(yáng)充盛正氣存內(nèi);丹參、赤芍、益母草活血化瘀利水，豬苓、澤瀉、車前子利水滲濕，諸藥配伍使瘀祛水行;葶藶子瀉肺平喘、利水消腫，砂仁、大棗溫補(bǔ)中焦，保護(hù)胃氣，為佐使之藥。全方補(bǔ)瀉兼施，標(biāo)本兼治，扶正不滯邪，利水不傷陰[18]。

本研究選用缺氧細(xì)胞模型，模擬心衰時(shí)心肌細(xì)胞的缺氧狀態(tài)，從ATP含量、脂肪酸利用相關(guān)因子FAT/CD36以及PPARa、PPARp/8蛋白表達(dá)等方面來(lái)探討參附益心方對(duì)缺氧原代心肌細(xì)胞脂肪酸利用的影響及可能機(jī)制。結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞中ATP含量及FAT/CD36蛋白的表達(dá)均較正常組顯著降低;PPARa、PPARβ/δ蛋白的表達(dá)雖有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示心衰發(fā)生時(shí)，心肌細(xì)胞的能量代謝底物發(fā)生了變化，由優(yōu)先利用脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)先利用葡萄糖[7]，脂肪酸氧化率降低，產(chǎn)能總體減少。與模型組比較，輔酶Q10組和參附益心方高劑量組細(xì)胞中ATP含量均顯著升高，輔酶Q10組細(xì)胞中FAT/CD36、PPARa蛋白，參附益心方高劑量組細(xì)胞中FAT/CD36蛋白以及參附益心方各劑量組細(xì)胞中PPARα、PPARβ/δ蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低。這提示參附益心方可進(jìn)一步抑制缺氧條件下原代心肌細(xì)胞的脂肪酸利用，改善其能量供應(yīng)。

綜上所述，參附益心方可通過(guò)抑制FAT/CD36及PPARa、PPARβ/δ蛋白的表達(dá)來(lái)抑制缺氧原代心肌細(xì)胞的脂肪酸利用，改善其能量代謝，延緩心衰過(guò)程。由于本研究的缺氧時(shí)間設(shè)定為6h，處于缺氧早期，而參附益心方對(duì)缺氧中晚期原代心肌細(xì)胞脂肪酸利用的抑制作用尚未可知，故本課題組后續(xù)將延長(zhǎng)缺氧時(shí)間來(lái)檢測(cè)FAT/CD36蛋白、PPARa、PPARβ/δ蛋白及其mRNA的表達(dá)，對(duì)上述結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證;此外，參附益心方對(duì)脂肪酸利用其他相關(guān)因子的調(diào)控作用及機(jī)制，以及對(duì)葡萄糖利用的調(diào)控作用尚未明確，仍有待進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2019-05-08修回日期：2019-09-02）

（編輯：張?jiān)拢?/p>

△基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（ No.81503419，No.813 73853， No.81603466， No.81603432）

*碩士研究生。研究方向：中醫(yī)藥防治心血管疾病。E-mail：qlj000826@163.com

#通信作者：主治醫(yī)師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療心血管疾病的基礎(chǔ)及臨床。電話：0371-66264771。E-mail：libinnvhai@163.com