雙氫青蒿素對(duì)肝癌細(xì)胞氨基酸代謝的影響及機(jī)制研究

王惠國(guó) 李丹 孫穎超 李雨桐 韓鑫龍 張靜瑩 唐玲

中圖分類號(hào)R917;R96

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1001-0408（2020）02-0132-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.02.02

摘要 目的：考察雙氫青蒿素（DHA）對(duì)人肝癌細(xì)胞Huh7、BEL-7402中氨基酸類代謝產(chǎn)物的影響，為闡明DHA參與肝癌細(xì)胞代謝的調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。方法：采用CCK-8法，測(cè)定不同濃度DHA（12.5、25、50、100 μmol/L）作用24、48、72h后對(duì)兩種細(xì)胞活性的影響。將兩種細(xì)胞分別分為對(duì)照組和給藥組（DHA，25 μmol/L），加入不合藥或含藥培養(yǎng)基后培養(yǎng)24h，均平行操作3份。對(duì)各組細(xì)胞樣品進(jìn)行衍生化處理后，采用氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜（GC-MS）法檢測(cè)細(xì)胞中氨基酸代謝物含量變化，結(jié)合SIMCA-P軟件分析和化合物譜庫(kù)的比對(duì)，篩選出兩種細(xì)胞中的差異代謝物;采用Metaboanalyst 4.0軟件對(duì)差異代謝物進(jìn)行通路富集分析。結(jié)果：與對(duì)照組比較，給藥組Huh7細(xì)胞或BEL-7402細(xì)胞中谷氨酰胺、谷胱甘肽、苯丙氨酸、富馬酸、?；撬岬群烤氏陆第厔?shì)。上述兩種細(xì)胞中分別篩選獲得28、29個(gè)差異代謝物，兩者的共同差異代謝物有10個(gè)，包括谷氨酰胺、谷胱甘肽、?；撬帷⒏获R酸、苯丙氨酸等;兩者的差異代謝物分別富集到8、6條通路上，其共同富集通路為氨基酸-tRNA生物合成、天冬氨酸一丙氨酸一谷氨酸代謝、氮代謝、苯丙氨酸代謝、戊糖磷酸途徑。結(jié)論：DHA能明顯降低Huh7細(xì)胞和BEL-7402細(xì)胞的活性，并能顯著降低細(xì)胞中谷氨酰胺、谷氨酸、谷胱甘肽、苯丙氨酸等的含量;其可能通過(guò)影響天冬氨酸一丙氨酸一谷氨酸代謝通路等機(jī)制來(lái)調(diào)控兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞 雙氫青蒿素;氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù);肝癌;機(jī)制;代謝通路;氨基酸

根據(jù)2018年最新數(shù)據(jù)顯示，肝癌病死率在全球癌癥患者中已排第3位，僅次于肺癌和胃癌[1]。我國(guó)是肝癌發(fā)病大國(guó)，每年有近50萬(wàn)的新發(fā)肝癌患者，其生存率低、復(fù)發(fā)率高，藥物和手術(shù)治療的結(jié)局也不理想[2]。隨著抗腫瘤治療的深入研究和近幾年代謝組學(xué)的迅速發(fā)展，越來(lái)越多的相關(guān)研究圍繞腫瘤細(xì)胞代謝組學(xué)開(kāi)展。代謝組學(xué)又稱代謝輪廓分析，是指通過(guò)對(duì)各種生物樣品中小分子化合物（分子量<1 000）的代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性分析和定量測(cè)定，以監(jiān)測(cè)不同代謝物的水平及變化，從而全面了解不同生物系統(tǒng)復(fù)雜生理和病理狀態(tài)的一門(mén)學(xué)科[3]。氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)具有靈敏度高、效率高的優(yōu)點(diǎn)，可選擇性地分離和檢測(cè)大量代謝產(chǎn)物如氨基酸類、糖類、胺類等化合物，近年來(lái)在生命科學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[4]。通過(guò)對(duì)代謝產(chǎn)物的定性和定量分析，并基于此進(jìn)行三羧酸循環(huán)、尿素循環(huán)、糖酵解等途徑的分析，是腫瘤代謝組學(xué)研究方面的常用方法。雙氫青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）為青蒿素的衍生物，屬于倍半萜內(nèi)酯類化合物，其不僅具有抗瘧疾、抗炎的藥理活性，還具有抗腫瘤、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)等作用[5]。目前，關(guān)于DHA對(duì)肝癌細(xì)胞的作用的相關(guān)研究較少，其對(duì)肝癌細(xì)胞代謝方面影響的研究更少?；诖?，本研究以肝癌細(xì)胞Huh7和BEL-7402為研究對(duì)象，考察經(jīng)DHA干預(yù)處理后肝癌細(xì)胞活性和細(xì)胞中氨基酸類代謝產(chǎn)物的變化，旨在了解DHA對(duì)肝癌細(xì)胞代謝的影響，為闡明DHA參與肝癌細(xì)胞代謝的調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

GC-MS-P2010型GC-MS儀，配備電子轟擊離子源（EI）、AOC-20i型自動(dòng)進(jìn)樣器（日本島津公司）;CENCO型渦旋儀（荷蘭Breda公司）;Spectra Max 190型酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）;5804R型高速低溫離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）;FreeZone@型冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Labconco公司）;LS-C0150型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;AC2-4S型二級(jí)生物安全柜（新加坡Esco公司）;DMil型倒置顯微鏡（德國(guó)Lei-ca公司）;AMOAFIOOO型自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Invitro-gen公司）;CP324S型電子微量天平（德國(guó)Sartorius公司）;YM-080S型超聲波清洗儀（深圳市方奧威電子有限公司）。

1.2 藥品與試劑

DHA（美國(guó)Sigma公司，純度：≥98%）;甲氧胺（批號(hào)：BCBC344IV）、吡啶（批號(hào)：SHBG8498V）、N-甲基-N-（三甲基硅烷基）一三氟乙酰胺（MSTFA，批號(hào)：BCBV0257）均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)：8118199）、胎牛血清（FBS，批號(hào)：2010092）、0.25%胰蛋白酶一乙二胺四乙酸溶液（0.25% Tryp-sin-EDTA，批號(hào)：1951049）、pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)：8118213）、二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)：1213C0343）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

人肝癌Huh7、BEL-7402細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心（ATCC細(xì)胞庫(kù)）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取Huh7細(xì)胞和BEL-7402細(xì)胞，分別在37℃、5%C02條件下培養(yǎng)24h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 DHA對(duì)Huh7細(xì)胞和BEL-7402細(xì)胞活性的影響考察

取“2.1”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Huh7細(xì)胞和BEL-7402細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，以800 r/min離心5min，棄去上清液，加入含IO%FBS的DMEM培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱培養(yǎng)基）1 mL，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按2 000個(gè)/孔加入96孔板，輕晃至細(xì)胞均勻平鋪于板底即可。次日，待細(xì)胞貼壁后將其分為對(duì)照組和DHA不同劑量組（DHA終濃度分別為12.5、25、50、100 μmol/L），對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，DHA各劑量組加入相應(yīng)濃度的含藥培養(yǎng)基，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。加藥后繼續(xù)在37℃、5%C02條件下培養(yǎng)24、48、72 h。取出細(xì)胞，按CCK-8檢測(cè)試劑盒方法操作，每孔加入CCK-8試劑20 μL，采用酶標(biāo)儀于450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度（OD）值，用來(lái)表示細(xì)胞活性。試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2.3 GC-MS法測(cè)定Huh7細(xì)胞和BEL-7402細(xì)胞中氨基酸代謝物含量

2.3.1 色譜條件色譜柱：DB-5 MS毛細(xì)管柱（30 mx250 μm，0.25 μm）;載氣：氦氣;線性速度：40 cm/s;恒流模式：1.19 mL/min;程序升溫（起始溫度70℃，保持3mrn后，以5℃/min的速度升至300℃，保持10 min）;進(jìn)樣溫度：280℃;進(jìn)樣量：1μL;分流比：10：1。2.3.2質(zhì)譜條件EI離子源;界面溫度：300℃;離子源溫度：230℃;EI轟擊電壓：70 eV;周期：0.2 s;檢測(cè)電壓：0.92 kV;掃描范圍：質(zhì)荷比（m/z）：33～600 Da;溶劑切割時(shí)間：5.5 min。采用全掃描模式，掃描的離子為各個(gè)衍生產(chǎn)物的特征離子。

2.3.3 細(xì)胞樣品預(yù)處理取“2.1”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的Huh7細(xì)胞和BEL-7402細(xì)胞，計(jì)數(shù)后分別以2xl06個(gè)/皿接種于10 cm的平皿中，在37℃、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。每種細(xì)胞均隨機(jī)分為兩組，一組加入培養(yǎng)基10mL作為對(duì)照組，另一組加入含25 μmol/L DHA的培養(yǎng)基10 mL作為給藥組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組均平行操作3份。培養(yǎng)結(jié)束后取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)基，以預(yù)冷的PBS洗滌3次，每皿加入預(yù)冷的甲醇1 mL，用細(xì)胞刮鏟刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至5 mL EP管中，渦旋混勻5min，超聲處理20 s，再渦旋混勻1min后，靜置10 min;在4℃下以13 500 r/min離心15 min后，吸取上清液700 μL至1.5mL離心管中，凍干，備用。取所有樣本剩余上清液各20 μL混勻，作為本研究質(zhì)量控制（QC）樣品，凍干，備用。取上述凍干樣品，分別加入甲氧胺50 μL，在37℃水浴th，以14 000 r/min離心2min;加入衍生化試劑MSTFA 40 μL，在37℃水浴1h，以14 000 r/min離心10min，再按“2.3.1”“2.3.2”項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析。計(jì)算QC樣本GC-MS譜圖中各成分峰面積RSD，用來(lái)評(píng)價(jià)樣品預(yù)處理過(guò)程和儀器分析的穩(wěn)定性（RSD≤30%即可）。

2.3.4 數(shù)據(jù)處理分析建立包含保留時(shí)間和特征離子信息的定量峰表，導(dǎo)入GC-MS儀器配置的Postrun Anal-ysis 2.7工作站，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行批量積分處理，獲得包含保留時(shí)間、特征離子和峰面積的原始峰表，并以總峰面積計(jì)算相對(duì)峰面積進(jìn)行校正。

采用SPSS 17.O統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)細(xì)胞活性試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理;采用GC-MS儀器工作軟件、SIMCA-P 11.0軟件中的主成分分析（PCA）功能對(duì)代謝物含量測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度DHA作用不同時(shí)間對(duì)Huh7細(xì)胞和BEL-7402細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著DHA濃度的增加，或隨著藥物作用時(shí)間的增加，Huh7細(xì)胞和BEL-7402細(xì)胞的活性均呈下降趨勢(shì)，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明DHA具有抑制兩種肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，且呈劑量依賴和時(shí)間依賴趨勢(shì)。以對(duì)照組細(xì)胞活性為基準(zhǔn)進(jìn)行比較，經(jīng)25 μmol/L DHA作用24h時(shí)，Huh7細(xì)胞的活性降至58%，BEL-7402細(xì)胞的活性降至75%;經(jīng)該濃度DHA作用48 h時(shí)，Huh7細(xì)胞的活性降至41%，BEL-7402細(xì)胞的活性降至47%。由此表明，25 μmol/LDHA作用24 h起對(duì)兩種細(xì)胞就表現(xiàn)出明顯的活性抑制作用，故本研究選擇以25 μmol/L的DHA作用24 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，詳見(jiàn)表1。

3.2 DHA對(duì)Huh7細(xì)胞和BEL-7402細(xì)胞中氨基酸代謝物的影響

QC樣本經(jīng)GC-MS檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理后，共得到186個(gè)代謝物成分峰（大部分RSD≤30%），對(duì)上述成分峰進(jìn)行匹配并去除峰面積過(guò)小、重復(fù)性較差的峰數(shù)據(jù)，共獲得70個(gè)成分的峰數(shù)據(jù)。經(jīng)GC-MS檢測(cè)并對(duì)每組平行操作的3份樣品圖譜中各代謝物成分峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，以25 μmol/L的DHA作用于兩種細(xì)胞24h后，峰面積RSD≤10%的成分共42個(gè)，占所有成分總峰面積的比例為60.00%;峰面積RSD為>10%～30%的成分共20個(gè)，占所有成分總峰面積的比例為28.57%;峰面積RSD>30%的成分共8個(gè)，占所有成分總峰面積的比例為11.43%。其中，RSD≤30%的成分占所有成分總峰面積的比例達(dá)88.57%，表明經(jīng)藥物作用后，細(xì)胞中大部分代謝物成分的產(chǎn)生情況較為穩(wěn)定。峰面積RSD≤30%的62個(gè)代謝物詳見(jiàn)表2。

將表2中的62個(gè)代謝物的峰面積經(jīng)過(guò)SIMCA-P軟件分析，并與化合物譜庫(kù)進(jìn)行分析比對(duì)，即獲得Huh7細(xì)胞和BEL-7402細(xì)胞中的差異代謝物。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，12.5 μmol/L的DHA作用24 h后，Huh7細(xì)胞中的差異代謝物有28個(gè)，包括Glutamine（谷氨酰胺）、Glutathione（谷胱甘肽）、Alanine（丙氨酸）、Fumaric acid（富馬酸）、N- acetyl-serine （N-乙酰絲氨酸）、N-acetyl-as-partic acid（N-乙酰天冬氨酸）等化合物;BEL-7402細(xì)胞中的差異代謝物有29個(gè)，包括Pantothenic acid（泛酸）、Phenylalanine（苯丙氨酸）、谷胱甘肽、Hypotaurine（?；撬幔┑然衔?Huh7和BEL-7402的共同差異代謝物有10個(gè)，包括泛酸、N-乙酰絲氨酸、N-乙酰天冬氨酸、?；撬?、谷胱甘肽、Gluconic acid（葡糖酸）、富馬酸、Erythron-ic acid（赤糖酸）、谷氨酰胺、苯丙氨酸。兩種細(xì)胞的共有差異代謝物見(jiàn)表3;其相對(duì)峰面積見(jiàn)表4、表5。

由表4、表5可知，在有顯著性變化的差異代謝物中，DHA給藥組Huh7細(xì)胞和BEL-7402細(xì)胞中的多數(shù)代謝物平均含量呈顯著降低趨勢(shì)，表明DHA可能通過(guò)下調(diào)上述兩種肝癌細(xì)胞中氨基酸類代謝物的表達(dá)，從而影響肝癌細(xì)胞的代謝通路。 3.3 Huh7細(xì)胞和BEL-7402細(xì)胞的差異代謝物富集信號(hào)通路

采用Metaboanalyst 4.O軟件分別對(duì)Huh7細(xì)胞和BEL-7402細(xì)胞的差異代謝物進(jìn)行通路富集分析。結(jié)果顯示，Huh7細(xì)胞的差異代謝物富集到8條代謝通路，分別為氨基酸-tRNA生物合成、天冬氨酸一丙氨酸一谷氨酸代謝、氮代謝、苯丙氨酸代謝、三羧酸循環(huán)、牛磺酸一精氨酸代謝、半胱氨酸一蛋氨酸代謝、戊糖磷酸途徑;BEL-7402細(xì)胞的差異代謝物富集到6條代謝通路，分別為氨基酸-tRNA生物合成、天冬氨酸一丙氨酸一谷氨酸代謝、氮代謝、苯丙氨酸代謝、戊糖磷酸途徑、泛酸一輔酶A的生物合成，詳見(jiàn)圖1（注：圖中圓點(diǎn)的直徑越大，且距離坐標(biāo)距離越遠(yuǎn)，則說(shuō)明富集到代謝通路的差異代謝物越重要）。其中，Huh7細(xì)胞和BEL-7402細(xì)胞差異代謝物均富集到的通路為氨基酸-tRNA生物合成、天冬氨酸一丙氨酸一谷氨酸代謝、氮代謝、苯丙氨酸代謝和戊糖磷酸途徑。

4 討論

一直以來(lái)，青蒿素及其衍生物被人們熟知主要是因?yàn)槠淇汞懠沧饔?。而作為青蒿素的衍生物，DHA具有高效、安全、低毒等特點(diǎn)。近年來(lái)，越來(lái)越多研究表明其不僅具有抗瘧疾作用，還具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期等抗腫瘤作用[6-10]，但目前尚未見(jiàn)從代謝組學(xué)方面闡述DHA對(duì)肝癌細(xì)胞影響的研究報(bào)道。本課題組前期對(duì)9種肝癌細(xì)胞系（包括Huh7、SMCC-7721、HepG2、MHCC97H、Huh6、SNU389等）采用細(xì)胞活性試驗(yàn)進(jìn)行考察，選擇出對(duì)DHA較為敏感的Huh7細(xì)胞和BEL-7402細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。氨基酸是生命活動(dòng)最重要的物質(zhì)代謝基礎(chǔ)，是細(xì)胞增殖分裂過(guò)程中的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，腫瘤細(xì)胞對(duì)氨基酸的需求遠(yuǎn)大于正常細(xì)胞[11]。本課題組前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，DHA對(duì)氨基酸代謝通路的影響最為明顯，因此本研究采用GC-MS技術(shù)測(cè)定DHA作用后兩種細(xì)胞中氨基酸代謝產(chǎn)物的變化，重點(diǎn)分析DHA對(duì)腫瘤細(xì)胞氨基酸代謝途徑的影響。

GC-MS分析結(jié)果顯示，用DHA干預(yù)處理后，兩種腫瘤細(xì)胞中谷氨酰胺、富馬酸、?；撬岬劝被岽x物含量均呈明顯下降趨勢(shì)。對(duì)于正常細(xì)胞，谷氨酰胺是非必需氨基酸，但腫瘤細(xì)胞通過(guò)自身合成谷氨酰胺無(wú)法滿足其快速增殖的要求，往往需要從外界攝人大量的谷氨酰胺，這意味著谷氨酰胺是腫瘤細(xì)胞的“必需氨基酸”[12-14]，故腫瘤細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的攝取率均高于其他氨基酸。腫瘤細(xì)胞中的谷氨酰胺主要會(huì)被谷氨酰胺酶催化轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?，進(jìn)一步又被谷氨酸脫氫酶催化形成酮戊二酸，最后進(jìn)入三羧酸循環(huán)，實(shí)現(xiàn)對(duì)三羧酸循環(huán)的“回補(bǔ)”作用[15]。谷氨酰胺是血液和體內(nèi)游離氨基酸池中含量最豐富的氨基酸，可在細(xì)胞內(nèi)氧化并為其他氨基酸、蛋白質(zhì)的合成提供氮源，而且參與了機(jī)體還原劑谷胱甘肽的合成[16-18]。因此，DHA對(duì)谷氨酰胺含量的降低作用可能使腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制。富馬酸也是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵氨基酸[15]，本研究中兩種腫瘤細(xì)胞中富馬酸含量的降低表明DHA可能通過(guò)三羧酸循環(huán)抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，?；撬峋哂锌寡趸⒋龠M(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)免疫功能的作用[19-20]，本研究中兩種腫瘤細(xì)胞中?；撬岬暮拷档兔黠@，表明DHA可能通過(guò)下調(diào)該氨基酸從而抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

綜上所述，DHA能明顯降低Huh7細(xì)胞和BEL-7402細(xì)胞的活性，并能顯著降低細(xì)胞中谷氨酰胺、谷胱甘肽、苯丙氨酸等的含量;兩種腫瘤細(xì)胞的差異代謝物均富集到的通路為氨基酸-tRNA生物合成、天冬氨酸一丙氨酸一谷氨酸代謝、氮代謝、苯丙氨酸代謝、戊糖磷酸途徑，提示DHA可能通過(guò)影響天冬氨酸一丙氨酸一谷氨酸代謝通路等機(jī)制來(lái)調(diào)控兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)。然而，由于目前的研究證據(jù)不足，本研究?jī)H重點(diǎn)探討了某一條通路的相關(guān)作用機(jī)制，后續(xù)研究將根據(jù)相應(yīng)氨基酸含量的變化進(jìn)一步探索DHA對(duì)腫瘤細(xì)胞其他代謝通路的影響。

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（收稿日期：2019-03-14修回日期：2019-12-05）

（編輯：段思怡）

△基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（ No.81573661）;廣東醫(yī)科大學(xué)幫扶專項(xiàng)資金項(xiàng)目（ No.4SG19044G，No.4SG19057G）

*副教授，博士。研究方向：天然產(chǎn)物活性成分分離及藥理作用。E-mail： 171087155@qq.com

#通信作者：教授，碩士生導(dǎo)師，博士。研究方向：中藥及復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)理。E-mail： tangyuling6688@163.com