心臟Nmnat過(guò)表達(dá)聯(lián)合耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)果蠅高脂膳食誘發(fā)脂毒性心肌癥的影響

文登臺(tái) 鄭瀾 陸凱 劉憲楚 后文其

摘? ? 要：利用UAS/hand-gal4系統(tǒng)構(gòu)建果蠅心臟Nmnat基因特異性過(guò)表達(dá)，研究心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)聯(lián)合耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂膳食誘發(fā)脂毒性心肌癥的影響，并分析其分子機(jī)制。方法：雄性w1118和Nmnat-UAS系果蠅分別與雌性hand-Gal4雜交，收集F1代心臟Nmnat正常表達(dá)（hand>w1118）和過(guò)表達(dá) （hand>Nmnat）處女蠅，飼養(yǎng)至15 d后開(kāi)始進(jìn)行耐力運(yùn)動(dòng)（E）和高脂膳食（HFD），并分為hand>w1118、hand>w1118+E、hand>w1118+HFD、hand>w1118+HFD+E、hand>Nmnat、hand>Nmnat+E、hand>Nmnat+HFD、hand>Nmnat+HFD+E共8組，每組410只。ELISA檢測(cè)心臟TAG、NAD+、SIR2蛋白去乙?；OD活力和MDA水平，qRT-PCR檢測(cè)心臟相關(guān)基因mRNA表達(dá)，M-mode檢測(cè)心臟功能情況。結(jié)果：hand>w1118+HFD+E果蠅心臟的Nmnat、dFoxo、bmm表達(dá)、NAD+水平、SIR2去乙酰化、SOD活力、縮短分?jǐn)?shù)高于hand>w1118+HFD（P<0.05或P<0.01），且dFAS和Col4al表達(dá)、TAG和MDA水平、心率和纖維性振顫低于hand>w1118+HFD（P<0.05或P<0.01）; hand>Nmnat果蠅心臟各指標(biāo)與hand>Nmnat+HFD相比較未見(jiàn)顯著差異（P>0.05）;hand>Nmnat+HFD+E果蠅心臟的Nmnat、dFoxo、bmm表達(dá)、心臟NAD+水平、SIR2去乙酰化、SOD活力、心臟縮短分?jǐn)?shù)高于hand>Nmnat+HFD（P<0.05或 P<0.01），且dFAS和Col4al表達(dá)＼TAG和MDA水平、心率和纖維性振顫低于hand>Nmnat+ HFD（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：心臟Nmnat過(guò)表達(dá)和耐力運(yùn)動(dòng)均能抵抗果蠅高脂膳食誘發(fā)的心臟脂質(zhì)過(guò)度堆積、氧化損傷、減弱心臟收縮能力和增加纖維性振顫，其分子機(jī)制與心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性增強(qiáng)有關(guān)。心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)聯(lián)合耐力運(yùn)動(dòng)能更好地降低脂毒性心肌癥的發(fā)生概率，其機(jī)制與二者聯(lián)合對(duì)心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性上調(diào)的疊加作用有關(guān)。

關(guān)鍵詞：耐力運(yùn)動(dòng);高脂膳食;脂毒性心肌癥;Nmnat

中圖分類(lèi)號(hào)：G 804.2? ? ? ? ? 學(xué)科代碼：040302? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract：Objective： Constructing the specific overexpression of Nmnat gene in the heart of fruit flies using UAS/ hand-gal4 system to study the effect of the overexpression of Nmnat gene in the heart combined with endurance exercise on lipid toxicity induced by high-fat diet， and to analyze the molecular mechanism. Methods： Male w1118 and Nmnat-UAS fruit flies were respectively hybridized with female hand-gal4. Collecting the normal expression of heart Nmnat （hand>w1118） and the overexpression （hand>Nmnat） of F1 generation female flies. After feeding for 15 days， they began to perform endurance exercise （E） and high-fat diet （HFD）. They were divided into hand>w1118， hand>w1118+E， hand>w1118+HFD， hand>w1118+HFD+E， hand>Nmnat， hand>Nmnat +E， hand>Nmnat+HFD， hand>Nmnat+HFD+E， 410 flies in each group. The levels of cardiac TAG， NAD+， SIR2 protein deacetylation， SOD activity and MDA were detected by ELISA. The expression of cardiac related genes by RT-PCR; M-mode detects cardiac function. Results： the expression of Nmnat， dFoxo， bmm， NAD+ level， SIR2 deacetylation， SOD activity and shortened fraction of hand>w1118+HFD+E group were significantly higher than that of hand>w1118+HFD group （P<0.05 or P<0.01）， but the expression of dFAS， Col4al， TAG and MDA level， heart rate and fibrillation were significantly lower than that of hand>w1118+HFD group （P<0.05 or P<0.01）. There was no significant difference between the heart hand>Nmnat group and hand>Nmnat+HFD group （P>0.05）. The expression of Nmnat， dFoxo， bmm， NAD+， SIR2 deacetylation， SOD activity and shortened heart fraction in the hand>Nmnat+HFD+E group were significantly higher than those in the hand>Nmnat+HFD group （P<0.05 or P<0.01）， but the expression of dFAS， Col4al， TAG and MDA levels， heart rate and fibrillation were significantly lower than those in the hand>Nmnat+HFD group （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion： both overexpression of cardiac Nmnat and endurance exercise can prevent excessive accumulation of cardiac lipids， oxidative damage， decreased cardiac contractility and increased fibrillation induced by high-fat diet. The molecular mechanism is related to the fact that both of them can up-regulate the activity of cardiac Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo pathway. The overexpression of cardiac Nmnat gene combined with endurance exercise can better reduce the occurrence of lipid toxic cardiomyopathy， which is related to the superposition effect of the combination on the up-regulation of cardiac Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo pathway activity.

Keywords：endurance exercise; high-fat-diet; lipotoxic cardiomyopathy; Nmnat

在哺乳動(dòng)物和果蠅中，長(zhǎng)期高脂膳食能誘發(fā)脂毒性心肌癥，導(dǎo)致心力衰竭和心臟驟亡風(fēng)險(xiǎn)增加[1-2]。脂毒性心肌癥表現(xiàn)出4個(gè)主要特征：心臟的脂質(zhì)堆積過(guò)度、脂毒性損傷嚴(yán)重、收縮功能障礙及纖維性振顫增加[3]。果蠅是唯一有心臟的無(wú)脊椎動(dòng)物，在其正常食物中加入30%的椰子油即可制成高脂食物，連續(xù)喂食果蠅5 d高脂食物即可誘發(fā)脂毒性心肌癥[4]。研究表明，將果蠅心臟dFoxo基因特異性過(guò)表達(dá)能有效抵抗高脂膳食誘發(fā)脂毒性心肌癥;相反，心臟dFoxo基因敲減能導(dǎo)致正常飲食果蠅的心臟產(chǎn)生脂毒性心肌癥[4]，這提示心臟dFoxo基因是調(diào)控果蠅脂毒性心肌癥的關(guān)鍵基因。煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶（Nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase，Nmnat）是煙酰胺腺苷二核苷酸（NAD）生物合成途徑中的關(guān)鍵酶蛋白，在細(xì)胞內(nèi)Nmnat蛋白對(duì)NAD合成有重要調(diào)控作用[5]。NAD+不僅參與能量代謝，還參與SIR2蛋白去乙?；@種去乙?；泻筇煨揎椇娃D(zhuǎn)錄因子調(diào)控的作用，而且被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)代謝狀態(tài)與自適應(yīng)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之間聯(lián)系的分子機(jī)制[6]。而在細(xì)胞中，SIR2蛋白與NAD+的去乙?；瘜?duì)Foxo蛋白有上游調(diào)節(jié)作用[7]。研究還證實(shí)在哺乳動(dòng)物和果蠅中，耐力運(yùn)動(dòng)能有效預(yù)防和改善脂毒性心肌癥，如耐力運(yùn)動(dòng)能大量動(dòng)員脂肪分解和供能，防止心臟脂質(zhì)堆積[7-8]。此外，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能積極調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)Foxo蛋白，提高心臟的抗氧化能力，減少氧化損傷[9]。耐力運(yùn)動(dòng)還能提高骨骼肌和心肌的NAD+水平，以促進(jìn)電子的傳遞和能量代謝[10]。因此，這些研究提示Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路可能介導(dǎo)耐力運(yùn)動(dòng)預(yù)防和改善脂毒性心肌癥。

為確定Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路是介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)抵抗脂毒性心肌癥的關(guān)鍵通路，本研究選用遺傳學(xué)的經(jīng)典模式生物果蠅作為研究對(duì)象，首先對(duì)心臟Nmnat基因正常表達(dá)果蠅進(jìn)行耐力運(yùn)動(dòng)和高脂膳食干預(yù)，觀(guān)察其心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路、心臟氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝及心臟功能的變化，以確定運(yùn)動(dòng)抵抗高脂膳食誘發(fā)脂毒性心肌癥是否伴隨心臟Nmnat/NAD+/dFoxo通路活性變化;然后，利用Hand-Gal4/USA系統(tǒng)構(gòu)建心臟Nmnat基因特異性過(guò)表達(dá)品系果蠅，并對(duì)其進(jìn)行耐力運(yùn)動(dòng)和高脂膳食干預(yù)，以證實(shí)心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路是否為介導(dǎo)耐力運(yùn)動(dòng)抵抗脂毒性心肌癥的關(guān)鍵分子通路，旨在為脂毒性心肌癥的運(yùn)動(dòng)聯(lián)合基因療法提供理論基礎(chǔ)和新思路。

1? ?材料與方法

1.1? 果蠅品系

本實(shí)驗(yàn)所需果蠅品系有：野生型w1118（品系號(hào)：3605，來(lái)源：Bloomington Drosophila Stock Center）、hand-Gal4（品系號(hào)：48396，來(lái)源：湖南師范大學(xué)心臟發(fā)育中心）和Nmnat-UAS-overexpression（品系號(hào)：39699，來(lái)源：Bloomington Drosophila Stock Center），通過(guò)對(duì)含UAS和GAL4序列不同品系果蠅的雜交，構(gòu)建UAS/GAL4系統(tǒng)，對(duì)心臟目的基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控。所有果蠅放置在恒溫23 ℃、恒濕50 %、12 h晝夜循環(huán)的環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2? 雜交及分組

雄性野生系w1118和Nmnat-UAS-overexpression系果蠅分別與雌性hand-Gal4雜交，收集F1代羽化12 h內(nèi)的處女蠅，分為心臟Nmnat正常表達(dá)系（hand-Gal4>w1118和hand>w1118）和心臟Nmnat過(guò)表達(dá)系（hand-Gal4>Nmnat-UAS-overexpression和hand>Nmnat）。然后，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練（E）、高脂膳食（HFD）及二者聯(lián)合分別干預(yù)Nmnat正常表達(dá)系和心臟Nmnat過(guò)表達(dá)系，因此，收集的果蠅共分8組，分別為hand>w1118、hand>w1118+E、hand>w1118+HFD、hand>w1118+HFD+E、hand>Nmnat、hand>Nmnat+E、hand>Nmnat+HFD、hand>Nmnat+HFD +E，每組410只，如圖1所示。

1.3? 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和高脂膳食方案

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和高脂膳食均從15 d齡開(kāi)始（果蠅飼養(yǎng)至3周齡初，心臟生理機(jī)能趨于成熟，有利于排除生長(zhǎng)發(fā)育或衰老對(duì)心臟的影響），均持續(xù)5 d。運(yùn)動(dòng)方案為：運(yùn)動(dòng)組果蠅均放到運(yùn)動(dòng)裝置上，每管20只果蠅，果蠅每次翻轉(zhuǎn)至試管底部后，給予10 s做向上攀爬運(yùn)動(dòng)，試管長(zhǎng)約8 cm，每天運(yùn)動(dòng)1.5 h，持續(xù)5 d，訓(xùn)練完24 h后取材。通過(guò)觀(guān)察果蠅攀爬過(guò)程中能否跟上翻轉(zhuǎn)速度及是否保持逆重力攀爬和趨光特性來(lái)判斷是否產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)疲勞，由于逆重力攀爬果蠅自發(fā)的運(yùn)動(dòng)，且運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間達(dá)到1.5 h才產(chǎn)生疲勞現(xiàn)象，稱(chēng)之為果蠅耐力運(yùn)動(dòng)。

1.4? 正常膳食和高脂膳食配制

正常膳食：在鍋中加入水、黃豆粉、酵母粉、玉米粉攪勻，并在加熱過(guò)程中加入瓊脂，直至溶液沸騰。沸騰后停止加熱，冷卻過(guò)程中加入蔗糖和麥芽糖，待蔗糖和麥芽糖充分溶解后，加入防腐劑丙酸、對(duì)羥基苯，充分?jǐn)嚢韬罅⒓捶盅b于潔凈的培養(yǎng)管中，每管培養(yǎng)基厚度約為0.5 cm。

高脂膳食：正常膳食中加入30%的椰子油，充分溶解混合。先加入正常飲食的培養(yǎng)基上，約0.3 cm厚，然后將30%椰子油與正常飲食的混合物倒在已凝固的培養(yǎng)基上，約0.2 cm厚，使培養(yǎng)基總厚度約為0.5 cm。

1.5? M-mode心動(dòng)圖檢測(cè)心臟功能的變化

將麻醉果蠅在果蠅人工血淋巴（人工血淋巴：果蠅血淋巴配劑、蔗糖、海藻糖按照8∶1∶1的比例制成，4 ℃保存）中暴露心臟，用EM-CCD高速攝像機(jī)拍攝果蠅心臟跳動(dòng)顯微影像，拍攝時(shí)長(zhǎng)為30 s，頻率為130幀/s，利用HC-Image 軟件記錄并處理視頻數(shù)據(jù)，采用半自動(dòng)光學(xué)心動(dòng)分析軟件（semi-automatic optical heartbeat analysis software，SOHA）量化分析果蠅心率（heart rate，HR）、縮短分?jǐn)?shù)（fraction shortening，F(xiàn)S）、舒張直徑（diastolic diameters，DD）、收縮直徑（sysstolic diameters，SD）和纖維性振顫（fibrillations），以反映果蠅心臟收縮能力和心臟振顫情況。每組取30只果蠅檢測(cè)心臟功能。

1.6 ELISA檢測(cè)果蠅心臟TAG、NAD+、SIR2去乙?；?、SOD活力和MDA水平

每組取60只果蠅心臟放入150 μL PBS+1% Triton-x 中，用以檢測(cè)心臟TAG水平;每組每個(gè)指標(biāo)取80只果蠅心臟放入150 μL PBS中，用以檢測(cè)心臟NAD+水平、SOD活力水平和MDA水平。ELISA檢測(cè)步驟如下：用細(xì)胞破碎儀使果蠅心肌細(xì)胞破裂，將勻漿液離心：4 000 r/min，15 min，4 ℃，取上清備用;標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，樣本孔中加入待測(cè)樣本50 μL，3孔重復(fù);空白孔不加;除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min;棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液（350 μL），靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次;每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min;每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。以所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)，用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并得到直線(xiàn)回歸方程（如圖2所示），將樣品的OD值代入方程，計(jì)算出樣品的濃度。

1.7? qRT-PCR檢測(cè)心臟相關(guān)基因 mRNA表達(dá)情況

每組取80只果蠅心臟放入1 mL的trizol reagen中，加0.25 mL氯仿，離心，條件4 ℃，12 000 g，15 min，吸取上層水至另一離心管中并加入等體積100%異丙醇，-20 ℃放過(guò)夜，4 ℃下12 000 g離心10 min，留下RNA沉淀，保存在-70 ℃的75%酒精中。

mRNA逆轉(zhuǎn)錄：離心管在冰上依次加入5×gDNA Eraser Buffer 2? μL、gDNA Eraser 1 μL、RNase Free dH2O 5 μL，共10 mL混合液，42 ℃反應(yīng)5 min，去除基因組DNA。在冰上加入5×PrimeScript Buffer2 4 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、RNase Free dH2O 4 μL，輕柔混合后立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。水浴37 ℃反應(yīng)30 min，85 ℃反應(yīng)1 min，并將產(chǎn)物稀釋到100 μL，-20 ℃保存。

Real time PCR：儀器：Bio-Rad96孔熒光定量RT-PRC儀，試劑：SYBR？誖Premix Ex TaqTM（Takara RR820A）。體系：SYBR？誖Premix Ex Taq（2×）15 μL、PCR Forward Primer（10 μM）0.5 μL、PCR Reverse Primer（10 μM）0.5 μL、ROX 0.6 μL、Template 5 μL、ddH2O 8.4 μL，總體系 30 μL，分三重復(fù)孔，每孔10 μL，程序：95 ℃，30 s;95 ℃，5 s;60 ℃，30 s， 總循環(huán)40次。

引物使用Premiers5.0軟件設(shè)計(jì)，并經(jīng)NCBI BLAST基因庫(kù)檢索驗(yàn)證，與其他基因無(wú)高度同源性，以Rp49 基因?yàn)閮?nèi)參。引物由上海生物工程生物制品有限公司合成、純化，其序列為：Nmnat：F：5- AGACGATCTGGTGCTGGAGT-3，R：5- GTTGTCCGTATAGGCGTGGT-3;dFoxo：F：5-AACAACAGCAGCATCAGCAG-3， R：5-CTGAACCC GAGCAT TCAGAT-3; bmm：F：5-ACTGCACATTTCGCTTACCC-3， R：5-GAGAATCCG GGTATG AAGCA-3;dFAS：F：5-GGTGAGACCATCGTGGAAGT-3，R：5AAT

GTCTGCCAAGCCAGAGT-3;Col4a1：F：5-CCTGGCTTAAATGGAAACGA-3，R：5-TCCTGGTTCACCCTTCTGTC-3;Rp49：F：5-CTAAGCTGTCGCACAAATGG-3，R：5-AACTTCTTGAATCCG

GTGGG-3。取2μL RNA，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，PCR 擴(kuò)增后用 2% 的瓊脂糖電泳鑒定（如圖3所示）。計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量及過(guò)表達(dá)率。

1.8? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，采用多因素方差分析運(yùn)動(dòng)、高脂膳食、Nmnat過(guò)表達(dá)之間是否存在交互作用，并分析其主效應(yīng);用LDS比較分析各組指標(biāo)間差異，所有的數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異非常顯著。

2? ? 結(jié)果

2.1? 心臟Nmnat過(guò)表達(dá)、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和高脂膳食對(duì)果蠅心臟功能的影響

多因素方差分析結(jié)果顯示：運(yùn)動(dòng)、高脂膳食、Nmnat基因過(guò)表達(dá)對(duì)果蠅心率、縮短分?jǐn)?shù)、舒張直徑、纖維性振顫和Col4a表達(dá)有顯著影響（P<0.05或P<0.01）;運(yùn)動(dòng)×高脂、運(yùn)動(dòng)× Nmnat、運(yùn)動(dòng)×高脂×Nmnat對(duì)果蠅心率、縮短分?jǐn)?shù)、舒張直徑、纖維性振顫和Col4a表達(dá)均未見(jiàn)交互作用（P>0.05）;高脂×Nmnat對(duì)果蠅心率、縮短分?jǐn)?shù)、舒張直徑、纖維性振顫和Col4a表達(dá)存在交互作用（P<0.05或P<0.01）。

LSD比較結(jié)果：與hand>w1118相比，hand>w1118+E果蠅心率減慢（P<0.05），縮短分?jǐn)?shù)增加（P<0.05），收縮直徑、舒張直徑和纖維性振顫未見(jiàn)顯著變化（P>0.05），Col4a表達(dá)減少（P<0.05），表達(dá)率減少10%;hand>w1118+HFD果蠅心率加快（P<0.01），縮短分?jǐn)?shù)減少（P<0.01），收縮直徑未見(jiàn)顯著變化（P>0.05），舒張直徑減少（P<0.05），纖維性振顫和Col4a表達(dá)增加（P<0.05，P<0.01），Col4a過(guò)表達(dá)率25%;hand>w1118+E+HFD果蠅心臟TAG水平降低（P<0.05），其余各指標(biāo)未見(jiàn)顯著變化。與hand>w1118+HFD相比，hand>w1118+E+HFD果蠅心臟心率加快、縮短分?jǐn)?shù)增加（P<0.01，P<0.05），收縮直徑、舒張直徑、纖維性振顫和Col4a表達(dá)均未見(jiàn)顯著變化（P>0.05）。如表1、表2和圖4所示。

與hand>w1118相比，hand>Nmnat果蠅心臟心率減慢（P<0.05），縮短分?jǐn)?shù)增加（P<0.01），收縮直徑未見(jiàn)顯著變化（P>0.05），舒張直徑增加（P<0.01），纖維性振顫和Col4a表達(dá)減少（P<0.05），表達(dá)率減少11%。如表1、表2和圖4所示。

與hand>Nmnat相比，hand>Nmnat+E果蠅心率減慢（P<0.05），縮短分?jǐn)?shù)增加（P<0.05），收縮直徑和舒張直徑未見(jiàn)顯著變化（P>0.05），纖維性振顫和Col4a表達(dá)減少（P<0.05），表達(dá)率減少22%;hand>Nmnat+HFD果蠅心臟心率加快、縮短分?jǐn)?shù)、收縮直徑、舒張直徑、纖維性振顫和Col4a表達(dá)均未見(jiàn)顯著變化（P>0.05）;hand>Nmnat+E+HFD果蠅心率減慢（P<0.05），縮短分?jǐn)?shù)增加（P<0.05），收縮直徑和舒張直徑未見(jiàn)顯著變化（P>0.05），纖維性振顫和Col4a表達(dá)減少（P<0.05），表達(dá)率減少19%;與hand>Nmnat+HFD相比，hand>Nmnat+E+HFD果蠅心率減慢（P<0.01），縮短分?jǐn)?shù)增加（P<0.05），收縮直徑和舒張直徑未見(jiàn)顯著變化（P>0.05），纖維性振顫和Col4a表達(dá)減少（P<0.05）。如表1、表2和圖4所示。

與hand>w1118相比，hand>w1118+E和hand>w1118+HFD的心臟外徑增加（P<0.05），其余各組均未見(jiàn)顯著變化（P>0.05），見(jiàn)表3。如圖5所示：高脂膳食能明顯誘發(fā)hand>w1118果蠅心臟外徑增大和脂質(zhì)堆積增多，提示病理性心臟肥大;運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和Nmnat過(guò)表達(dá)同樣能使心臟外徑增大，但沒(méi)有出現(xiàn)脂質(zhì)堆積的現(xiàn)象，提示心臟生理性增大。

2.2? 心臟Nmnat過(guò)表達(dá)、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和高脂膳食對(duì)果蠅心臟脂質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激的影響

多因素方差分析結(jié)果顯示：運(yùn)動(dòng)、高脂膳食、Nmnat過(guò)表達(dá)對(duì)心臟TAG、bmm表達(dá)、dFAS表達(dá)、SOD活力、MDA水平、dFoxo表達(dá)均存在顯著影響（P<0.05或P<0.01）。運(yùn)動(dòng)×高脂、運(yùn)動(dòng)× Nmnat、運(yùn)動(dòng)×高脂×Nmnat對(duì)心臟TAG、bmm表達(dá)、dFAS表達(dá)、SOD活力、MDA水平、dFoxo表達(dá)均未見(jiàn)交互作用（P>0.05）;高脂×Nmnat對(duì)心臟TAG、bmm表達(dá)、dFAS表達(dá)、SOD活力、MDA水平、dFoxo表達(dá)存在交互作用（P<0.05或P<0.01）。

LSD比較結(jié)果顯示：與hand>w1118相比，hand>w1118+E果蠅心臟TAG水平、dFAS表達(dá)和MDA水平均降低（P<0.05或P<0.01），dFAS表達(dá)率減少42%，心臟bmm表達(dá)、SOD活力和dFoxo表達(dá)升高（P<0.01），bmm過(guò)表達(dá)率39%，dFoxo過(guò)表達(dá)率84%;hand>w1118+HFD組果蠅心臟TAG水平、dFAS表達(dá)和MDA水平均升高（P<0.01），dFAS過(guò)表達(dá)率85%，心臟bmm表達(dá)、SOD活力和dFoxo表達(dá)均降低（P<0.01），bmm表達(dá)率減少55%，dFoxo表達(dá)率減少54%;hand>w1118+E+HFD果蠅心臟TAG水平降低（P<0.05），其余各指標(biāo)未見(jiàn)顯著變化。與hand>w1118+HFD相比，hand>w1118+E+HFD果蠅心臟TAG水平、dFAS表達(dá)和MDA水平均降低（P<0.01），心臟bmm表達(dá)、SOD活力和dFoxo表達(dá)升高（P<0.01），見(jiàn)表4和表5。

與hand>w1118相比，hand>Nmnat果蠅心臟TAG水平、dFAS表達(dá)和MDA水平均降低（P<0.01），dFAS表達(dá)率-46%，心臟bmm表達(dá)、SOD活力和dFoxo表達(dá)升高（P<0.01），bmm過(guò)表達(dá)率42%，dFoxo過(guò)表達(dá)率86%，見(jiàn)表4和表5。

與hand >Nmnat相比，hand>Nmnat+E果蠅心臟TAG水平、dFAS表達(dá)和MDA水平均降低（P<0.05），dFAS表達(dá)率減少56%，心臟bmm表達(dá)、SOD活力和dFoxo表達(dá)升高（P<0.05或P<0.01），bmm過(guò)表達(dá)率57%，dFoxo過(guò)表達(dá)率114%;hand>Nmnat+HFD果蠅心臟TAG水平、dFAS表達(dá)、MDA水平、bmm表達(dá)、SOD活力和dFoxo表達(dá)均未見(jiàn)顯著變化（P>0.05）;hand>Nmnat+E+HFD果蠅心臟TAG水平、dFAS表達(dá)和dFoxo表達(dá)未見(jiàn)顯著變化（P>0.05），MDA水平減少（P<0.05），bmm表達(dá)和SOD活力升高（P<0.05）。與hand>Nmnat+HFD相比，hand>Nmnat+E+HFD果蠅心臟TAG水平、dFAS表達(dá)和MDA水平均降低（P<0.05），dFAS表達(dá)率減少52%，心臟bmm表達(dá)、SOD活力和dFoxo表達(dá)升高（P<0.05或P<0.01），bmm過(guò)表達(dá)率55%，dFoxo過(guò)表達(dá)率98%，見(jiàn)表4和表5。

2.3? 心臟Nmnat過(guò)表達(dá)、運(yùn)動(dòng)和高脂膳食對(duì)心臟Nmnat/NAD+/SIR2通路的影響

多因素方差分析結(jié)果顯示：運(yùn)動(dòng)、高脂膳食、Nmnat過(guò)表達(dá)對(duì)心臟Nmnat表達(dá)量、NAD+水平和SIR2去乙酰化水平存在顯著影響（P<0.05或P<0.01）。運(yùn)動(dòng)×高脂、運(yùn)動(dòng)×Nmnat、運(yùn)動(dòng)×高脂×Nmnat對(duì)心臟Nmnat表達(dá)量、NAD+水平和SIR2去乙?；骄匆?jiàn)交互作用（P>0.05）;高脂×Nmnat對(duì)心臟Nmnat表達(dá)量、NAD+水平和SIR2去乙?；酱嬖诮换プ饔茫≒<0.05或P<0.01）。

LSD比較結(jié)果顯示：與hand>w1118相比，hand>w1118+E果蠅心臟Nmnat表達(dá)增加（P<0.01），過(guò)表達(dá)率38%，心臟NAD+水平和SIR2去乙?；骄撸≒<0.05，P<0.01）;hand>w1118+HFD組心臟Nmnat表達(dá)降低（P<0.01），表達(dá)率減少29%，心臟NAD+水平和SIR2去乙?；骄鶞p少（P<0.01，P<0.05）;hand>w1118+E+HFD果蠅心臟Nmnat表達(dá)、NAD+水平和SIR2去乙?；骄匆?jiàn)顯著差異（P>0.05）。與hand>w1118+HFD相比，hand>w1118+E+HFD果蠅心臟Nmnat表達(dá)增加（P<0.01），NAD+水平和SIR2去乙酰化水平升高（P<0.01，P<0.05）。見(jiàn)表6。

與hand>w1118相比，hand >Nmnat果蠅心臟Nmnat表達(dá)增加（P<0.01），過(guò)表達(dá)率125%，心臟NAD+水平和SIR2去乙?；骄撸≒<0.01）。與hand >Nmnat相比，hand>Nmnat+E組果蠅心臟Nmnat表達(dá)增加（P<0.01），過(guò)表達(dá)率155%，心臟NAD+水平和SIR2去乙?；骄撸≒<0.05，P<0.01）;與hand>Nmnat+HFD相比，hand>Nmnat+E+HFD果蠅心臟Nmnat表達(dá)增加（P<0.01），過(guò)表達(dá)率143%，心臟NAD+水平未見(jiàn)顯著變化（P>0.05），SIR2去乙?；骄撸≒<0.05）。與hand>Nmnat+HFD相比，hand>Nmnat+E+HFD果蠅心臟Nmnat表達(dá)增加（P<0.01），心臟NAD+水平無(wú)顯著變化（P>0.05），SIR2去乙?；骄撸≒<0.05）。見(jiàn)表6。

3? ?討論

3.1? 高脂膳食對(duì)果蠅心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路的影響

正常飲食中混入30%的椰子油，連續(xù)喂食果蠅5 d，就能誘發(fā)其明顯可重復(fù)的肥胖表型，并造成機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，這與哺乳類(lèi)動(dòng)物長(zhǎng)期高脂膳食的結(jié)果類(lèi)似[1-2]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高脂膳食能使果蠅心臟結(jié)構(gòu)和功能異常，例如心臟TAG水平增多，心臟收縮功能減弱等[3]，提示脂毒性心肌癥產(chǎn)生。此外，高脂膳食還能導(dǎo)致果蠅心臟dFoxo、PGC-1、甘油三酯水解脂肪酶基因bmm表達(dá)下調(diào)，心臟TOR、心臟脂肪酸合酶1基因dFAS表達(dá)上調(diào)等[2-3，11-12]。本研究結(jié)果與前人基本一致。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)高脂膳食導(dǎo)致果蠅的心肌細(xì)胞更易遭受氧化毒性損傷，例如抗氧化酶SOD活力減少、脂質(zhì)氧化毒性物質(zhì)MDA增加。另外，高脂膳食能引起心臟Nmnat基因表達(dá)下調(diào)、NAD+水平下降、SIR2去乙?；綔p少，這可能是高脂膳食導(dǎo)致心臟dFoxo表達(dá)下調(diào)的重要原因。而高脂膳食能導(dǎo)致心臟膠原蛋白基因Col4a異常上調(diào)，則可能是引起心臟纖維性振顫增加的主要機(jī)制。

在哺乳動(dòng)物中，長(zhǎng)期高脂膳食能破壞脂肪酸代謝平衡，導(dǎo)致未充分氧化的脂質(zhì)不斷沉積于心臟，從而形成脂毒性心肌癥[13]。同樣，果蠅高脂膳食能誘發(fā)心臟TAG水平明顯升高，這與脂質(zhì)代謝平衡破壞有關(guān)。一方面心臟甘油三酯水解脂肪酶基因bmm表達(dá)下調(diào)，減弱脂肪動(dòng)員和分解[14];另一方面心臟脂肪酸合酶1基因dFAS表達(dá)增加，加快心臟內(nèi)脂質(zhì)的合成代謝[15]。因此，不斷沉積的脂質(zhì)導(dǎo)致心臟肥大，加重心臟收縮和舒張負(fù)擔(dān)，減弱心臟泵血能力（如圖5B和圖6C所示），導(dǎo)致心臟需通過(guò)增加心率代償輸出量[8，16]。此外，脂質(zhì)未充分氧化導(dǎo)致脂質(zhì)毒性損傷，例如抗氧化酶SOD活力減弱，毒性產(chǎn)物MAD水平增加，這可能使心肌細(xì)胞膜和線(xiàn)粒體膜的破壞增加，造成心肌細(xì)胞收縮能力減弱、泵血功能下降[13，17]。有研究表明，高脂膳食和衰老均能導(dǎo)致心臟膠原蛋白堆積，心肌細(xì)胞纖維程度增加，使心臟衰竭風(fēng)險(xiǎn)增加[18]。膠原蛋白是組成各種細(xì)胞外間質(zhì)的聚合物，適量的膠原蛋白有利于細(xì)胞的功能，而過(guò)量堆積，將使細(xì)胞纖維程度增加，果蠅心臟的膠原蛋白合成由Col4a1基因調(diào)控[19]。此外，還有研究表明，膠原蛋白表達(dá)與脂肪細(xì)胞增生有關(guān)，脂肪組織分化的一個(gè)特點(diǎn)是膠原蛋白積累，而分化成熟時(shí)膠原蛋白會(huì)停止積累。在發(fā)生胰島素抵抗和代謝相關(guān)疾病時(shí)，膠原蛋白會(huì)選擇性增生，而膠原蛋白積累經(jīng)常被認(rèn)為是一個(gè)病理過(guò)程[20];因此，高脂膳食導(dǎo)致果蠅心臟周?chē)窘M織分化增加和Col4a1基因表達(dá)上調(diào)，可能是心臟纖維性振顫增加的主要分子機(jī)制[21]。

在細(xì)胞內(nèi)NAD+不僅參與能量代謝[10]，還參與脂肪酸氧化的修復(fù)[22]，高脂膳食可能促進(jìn)NAD+參與心肌細(xì)胞脂肪酸氧化的修復(fù)，加快心肌細(xì)胞內(nèi)NAD+消耗。此外，高脂膳食能使細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)毒性物質(zhì)MDA增加，使線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，這也將導(dǎo)致NAD+水平減少，因?yàn)榫€(xiàn)粒體含有豐富的NAD+? ?[23]。Nmnat作為NAD+合成酶基因，隨著心肌細(xì)胞內(nèi)NAD+水平不斷減少，其表達(dá)適應(yīng)性下調(diào)。另外，NAD+作為催化物和底物參與SIR2去乙?；饔茫琋AD+水平減少降低SIR2的去乙?；?，最終導(dǎo)致dFoxo蛋白活性減少[7]，并使dFoxo基因適應(yīng)性下調(diào)。dFoxo是SOD上游調(diào)控因子[24]，dFoxo活性減少能造成SOD水平降低，這將使心肌細(xì)胞遭受氧化損傷的風(fēng)險(xiǎn)增加。研究表明，dFoxo基因?qū)χ拘孕募“Y形成起著關(guān)鍵性作用[4];因此，高脂膳食誘發(fā)的脂毒性心肌癥與心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性水平降低密切相關(guān)，但仍不能確定該通路是調(diào)控脂毒性心肌癥的關(guān)鍵通路。

3.2? 心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)對(duì)高脂膳食果蠅心臟的影響

有研究表明，特異性下調(diào)果蠅心臟Nmnat基因表達(dá)，能引起心臟功能紊亂，例如收縮能力減弱，泵血能力下降等[25]，與脂毒性心肌癥特征類(lèi)似，但心臟Nmnat基因是否參與調(diào)控脂毒性心肌癥形成。研究已證實(shí)果蠅高脂膳食能誘發(fā)脂毒性心肌癥[2-3，11-12]尚未知，心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性水平降低。為了進(jìn)一步證實(shí)心臟Nmnat基因和心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路與脂毒性心肌癥的關(guān)系，果蠅心臟Nmnat基因被進(jìn)行特異性過(guò)表達(dá)。通過(guò)檢測(cè)心臟Nmnat基因表達(dá)，即hand>Nmnat果蠅心臟Nmnat表達(dá)明顯高于hand>w 1118果蠅，可以判斷心臟Nmnat基因特異性過(guò)表達(dá)構(gòu)建成功。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)心臟Nmnat基因特異性過(guò)表達(dá)能提高果蠅心臟NAD+水平、SIR2去乙?；郊癲Foxo表達(dá)，提示心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性增強(qiáng)。

Nmnat是NAD+合成酶基因，是NAD+從頭合成途徑的關(guān)鍵酶基因，心臟Nmnat基因表達(dá)增加，有利于促進(jìn)NAD+從頭合成[5]，從而使心臟NAD+適應(yīng)性增加。有研究表明，Nmnat過(guò)表達(dá)能促使NAD+水平適應(yīng)性增加[26]，而細(xì)胞內(nèi)NAD+對(duì)SIR2有上游調(diào)節(jié)作用，適當(dāng)提高NAD+水平能上調(diào)SIR2表達(dá)和提高SIR2蛋白水平[27]，這可能是果蠅心臟內(nèi)SIR2去乙酰化水平增加的主要原因。心臟內(nèi)NAD+與SIR2去乙?；饔媚茉鰪?qiáng)Foxo活性水平，導(dǎo)致心臟dFoxo基因表達(dá)適應(yīng)性上調(diào)，從而減少氧化損傷[24]。此外，通過(guò)檢測(cè)心臟脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激及心臟功能相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)能明顯降低心臟TAG水平，這與bmm基因表達(dá)上調(diào)和dFAS表達(dá)下調(diào)有關(guān);心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)能明顯增加SOD活力水平，并減少脂質(zhì)毒性產(chǎn)物MAD水平，提示心肌細(xì)胞抗氧化能力增加，細(xì)胞膜和線(xiàn)粒體膜遭受氧化損傷風(fēng)險(xiǎn)降低[23-24]，有利于維持心臟收縮功能的穩(wěn)定。M-mode檢測(cè)心臟功能發(fā)現(xiàn)，心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)能明顯減慢心率，提高縮短分?jǐn)?shù)和增加舒張直徑，這反映出心臟泵血能力增強(qiáng)。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)能明顯降低心臟纖維性振顫，這與心臟Col4a1基因表達(dá)和脂質(zhì)堆積減少有關(guān)[21]。果蠅心臟dFoxo基因已被證實(shí)是調(diào)控脂毒性心肌癥的關(guān)鍵基因，因此，心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)能通過(guò)激活心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路來(lái)降低脂毒性心肌癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，但心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)是否能抵抗果蠅高脂膳食誘發(fā)脂毒性心肌癥仍未知。

為了確定心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)對(duì)果蠅高脂膳食誘發(fā)脂毒性心肌癥的影響，心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)果蠅給予高脂膳食。正常情況下，果蠅連續(xù)5 d高脂膳食能誘發(fā)脂毒性心肌癥及心臟分子機(jī)制異常改變[1-2]。而在心臟某些基因特異性改變情況下，心臟對(duì)高脂膳食誘發(fā)脂毒性心肌癥的耐受性增強(qiáng)，例如有研究證實(shí)，果蠅心臟dFoxo、PGC-1、bmm基因特異性過(guò)表達(dá)或TOR、dFAS特異性敲減或突變均能抵抗高脂膳食誘發(fā)脂毒性心肌癥[2-3，11-12]。因此，這些基因均是參與脂毒性心肌癥形成的重要基因。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂膳食不能造成心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)果蠅心臟脂質(zhì)堆積和脂肪酸代謝平衡破壞，也未誘發(fā)心臟氧化應(yīng)激增加和心臟收縮能力減弱，纖維性振顫也未見(jiàn)明顯改變，相關(guān)基因bmm、dFAS、Col4a1、dFoxo也不會(huì)出現(xiàn)明顯表達(dá)異常，心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性維持正常水平。這提示心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)能提高果蠅心臟對(duì)高脂膳食誘發(fā)脂質(zhì)毒性損傷的抵抗能力。心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致NAD+合成適應(yīng)性增加，一方面充足的NAD+具有還原性能減少脂質(zhì)氧化不充分導(dǎo)致的脂毒性損傷和保證正常有氧能量代謝，預(yù)防脂質(zhì)堆積[10，22];另一方面充足的NAD+與SIR2去乙?；芴岣逨oxo活性，提高SOD水平[24]，提高細(xì)胞的氧自由基清除能力，從而減少氧化損傷，維持心肌正常收縮功能[24]。這可能是心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)通過(guò)激活心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路，抵抗高脂膳食誘發(fā)脂毒性心肌癥的主要原因。

3.3? 耐力運(yùn)動(dòng)聯(lián)合心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)對(duì)高脂膳食果蠅心臟的影響

在哺乳動(dòng)物和果蠅中，大量研究證實(shí)，耐力運(yùn)動(dòng)能改善高脂膳食誘發(fā)的脂毒性心肌癥，包括減少心臟脂質(zhì)堆積、提高心臟功能、減少氧化應(yīng)激和增強(qiáng)有氧能量代謝等，其生理機(jī)制主要與耐力運(yùn)動(dòng)能加快動(dòng)員心臟內(nèi)的脂肪，促進(jìn)脂肪酸氧化分解和供能有關(guān)[28]。當(dāng)然，心臟對(duì)耐力運(yùn)動(dòng)的適應(yīng)也有分子水平的變化，例如心臟NAD+水平增加、SOD活力水平升高、dFoxo表達(dá)和SIR2表達(dá)上調(diào)等[8，29]，但心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路是否為耐力運(yùn)動(dòng)抵抗脂毒性心肌癥的關(guān)鍵通路還未見(jiàn)有研究。

為弄清這一問(wèn)題，本研究對(duì)果蠅進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是正常膳食，還是高脂膳食果蠅，進(jìn)行1周耐力運(yùn)動(dòng)后，心臟Nmnat和dFoxo表達(dá)顯著上調(diào)、NAD+水平和SIR2去乙酰化水平明顯升高，提示心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性增加。此外，心臟TAG水平下降，bmm基因表達(dá)上調(diào)，dFAS表達(dá)下調(diào)，提示心臟內(nèi)脂肪分解代謝可能大于合成代謝，有利于防止脂質(zhì)堆積。心臟SOD活力水平增加，MDA水平降低提示心肌細(xì)胞抗氧化能力增強(qiáng)，脂質(zhì)毒性損傷減少。心臟功能方面，心率顯著下降，縮短分?jǐn)?shù)和舒張直徑增加，提示心臟收縮能力增強(qiáng);心臟纖維性振顫減少，其生理機(jī)制與心臟膠原蛋白合成和脂質(zhì)減少有關(guān)。

在進(jìn)行耐力運(yùn)動(dòng)時(shí)，心臟對(duì)能量的需求非常高，這種刺激可能使運(yùn)動(dòng)后的心臟產(chǎn)生適應(yīng)性變化[30]。NAD+是呼吸鏈中電子的傳遞物，NAD+水平高低決定線(xiàn)粒體內(nèi)外電子傳遞的速率[23]。運(yùn)動(dòng)時(shí)，由于心肌細(xì)胞氧氣供應(yīng)不足，NAD+不斷轉(zhuǎn)化為NADH，NAD+水平不斷降低，導(dǎo)致能量代謝效率減低[31]。此外，運(yùn)動(dòng)時(shí)還會(huì)產(chǎn)生氧自由基，由于NAD+具有還原性，因此，NAD+還能消耗自身來(lái)抵抗氧化損傷[32]。因此，運(yùn)動(dòng)后NAD+水平有可能產(chǎn)生超量恢復(fù)，導(dǎo)致心臟NAD+水平適應(yīng)性增加[33]。NAD+的合成包括從頭合成和拯救合成，Nmnat是拯救合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，CG9940是從頭合成的關(guān)鍵酶基因。有研究證實(shí)，耐力運(yùn)動(dòng)能提高果蠅全身CG9940基因表達(dá)[34]。本研究發(fā)現(xiàn)耐力運(yùn)動(dòng)能上調(diào)心臟Nmnat基因表達(dá)，這可能是運(yùn)動(dòng)后NAD+水平需超量恢復(fù)造成的結(jié)果。NAD+水平升高不僅使心臟Nmnat基因表達(dá)上調(diào)，同時(shí)還能引起SIR2去乙?；胶虵oxo活性水平增加，因?yàn)镹AD+對(duì)SIR2有上游調(diào)節(jié)作用[27]，而SIR2去乙酰化對(duì)Foxo活性有上游調(diào)節(jié)作用[24]，這提示耐力運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)增加NAD+水平上調(diào)心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性。進(jìn)行耐力運(yùn)動(dòng)時(shí)，脂肪是能量代謝主要物質(zhì)，這使得脂肪分解代謝相關(guān)的酶基因適應(yīng)性增強(qiáng)，如果bmm表達(dá)上調(diào)，有利于脂肪動(dòng)員;同時(shí)，脂肪的合成會(huì)因?yàn)橛坞x甘油三酯水平降低而減少，導(dǎo)致脂肪合成代謝相關(guān)的酶基因適應(yīng)性下調(diào)，如果dFAS表達(dá)下調(diào)[4，35]，這是心臟甘油三酯水平減少的主要機(jī)制。耐力運(yùn)動(dòng)使心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性增加，還提高了心臟的抗氧化能力，因?yàn)镕oxo對(duì)SOD有上游調(diào)節(jié)作用[24]，這能減少氧化損傷，使脂毒性產(chǎn)物MDA減少。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)高脂膳食果蠅進(jìn)行耐力運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，與正常膳食果蠅相比，心臟Nmnat和dFoxo表達(dá)、NAD+水平、SIR2去乙酰化水平、心臟TAG、bmm基因表達(dá)、dFAS表達(dá)、心臟SOD活力水平、MDA水平降低，心率、縮短分?jǐn)?shù)、舒張直徑、心臟纖維性振顫等均未見(jiàn)顯著變化。結(jié)果提示，耐力運(yùn)動(dòng)能有效抵抗高脂膳食誘發(fā)的脂毒性心肌癥，心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路的激活是其重要機(jī)制。

不同遺傳因素極有可能造成運(yùn)動(dòng)效果的差異，例如在果蠅全身CG9940基因過(guò)表達(dá)、正常表達(dá)和敲減的條件下，規(guī)律運(yùn)動(dòng)對(duì)生命周期有促進(jìn)作用，但在CG9940基因突變的情況下，規(guī)律運(yùn)動(dòng)能對(duì)果蠅壽命產(chǎn)生不利影響[36]。盡管前面已經(jīng)論證心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)和耐力運(yùn)動(dòng)均能有效抵抗高脂膳食誘發(fā)脂毒性心肌癥，其機(jī)制均與心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路的激活有關(guān)，但還不清楚在心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)條件下，耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂膳食誘發(fā)脂毒性心肌癥和心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路的影響。本研究結(jié)果顯示，在心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)果蠅中，不管是正常膳食還是高脂膳食，耐力運(yùn)動(dòng)均能提高果蠅心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性，降低心臟TAG水平，增強(qiáng)心臟抗氧化能力和提高心臟收縮能力，減少纖維性振顫。前面已經(jīng)闡明心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)能有效地抵抗高脂膳食誘發(fā)脂毒性心肌癥，在其聯(lián)合耐力運(yùn)動(dòng)的情況下，這種抵抗性明顯增強(qiáng)，其分子機(jī)制也與心臟NAD+水平進(jìn)一步升高、心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性進(jìn)一步增強(qiáng)有關(guān)。

4? ?結(jié)論

心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)和耐力運(yùn)動(dòng)均能防止果蠅高脂膳食誘發(fā)脂毒性心肌癥的形成，包括減少高脂膳食果蠅心臟的脂質(zhì)過(guò)度堆積、氧化損傷、心臟收縮能力減弱和纖維性振顫增加，其分子機(jī)制與二者均能上調(diào)心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性有關(guān)。心臟Nmnat基因過(guò)表達(dá)聯(lián)合耐力運(yùn)動(dòng)時(shí)能更好地抵抗脂毒性心肌癥的發(fā)生，這與二者聯(lián)合對(duì)心臟Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性上調(diào)的疊加作用有關(guān)。

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