腦Ras同源蛋白(Rheb)基因研究概況

陳旭旭 李丹妮 陳鵬宇 楊受保

(紹興文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 紹興 312000)

腦Ras同源蛋白(Ras homolog enriched in brain，Rheb)作為具有代表性的GTP結(jié)合蛋白，在腦中含量較高，與多種蛋白具有互作關(guān)系.對細(xì)胞的生長、增殖、凋亡、存活以及自噬等細(xì)胞的基本生命活動具有重要調(diào)控作用，參與多種細(xì)胞以及機(jī)體的生理及病理過程，如結(jié)節(jié)性硬化癥(Tuberous sclerosis complex，TSC)以及某些腫瘤的發(fā)生.由于Rheb與雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路的特殊聯(lián)系，逐漸受到了人們的關(guān)注.

1 Rheb的分子生物學(xué)特性

1.1 Rheb超家族

Rheb是Ras超家族的成員，屬于Ras/Rap/Ral亞家族，該蛋白的氨基酸序列從酵母到人的不同生物中均高度保守，但不存在于植物中.Ras超家族是一類含超過150個(gè)人類蛋白質(zhì)的小鳥嘌呤三磷酸酶(Guanosine triphosphatase，GTP).根據(jù)其功能和序列的相似程度，可分為五個(gè)主要亞類：Ras，Rho，Rab，Ran和Arf[1-3].Ras蛋白作為二元分子開關(guān)發(fā)揮作用，參與和調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò).其調(diào)節(jié)的信號通路控制諸如細(xì)胞骨架完整性以及細(xì)胞增殖、分化、粘附、凋亡和遷移等過程.1994年Yamagata等[4]使用差異克隆技術(shù)來鑒定突觸活動在大腦神經(jīng)元中快速誘導(dǎo)的基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)并克隆了Rheb基因，并提出Rheb可以活性依賴性方式在腦中被誘導(dǎo).

1.2 Rheb的分子結(jié)構(gòu)

Rheb是一種分子量近21kDa的單體蛋白，由184個(gè)氨基酸組成，N末端的前169個(gè)氨基酸構(gòu)成GTP酶結(jié)構(gòu)域，剩余的氨基酸是以CAAX基序?yàn)榻Y(jié)尾的高度可變部分(C-半胱氨酸，A-脂肪族氨基酸，X-C-末端氨基酸)，在進(jìn)化上高度保守.Rheb在如酵母的低等真核生物中僅一種基因；而在哺乳動物細(xì)胞中，已發(fā)現(xiàn)兩種不同的Rheb基因：Rheb1和Rheb2(也稱為RhebL1)，其基因產(chǎn)物具有52%的同一性，并具有相似的功能，但它們的組織表達(dá)譜有所不同，Rheb1普遍表達(dá)，而Rheb2表達(dá)較受限制.Rheb蛋白是由脂質(zhì)錨定的細(xì)胞膜蛋白，具有5個(gè)重復(fù)的Ras相關(guān)GTP結(jié)合區(qū)域，還存在“Switch”區(qū)域I和II.當(dāng)在GTP結(jié)合和GDP結(jié)合形式之間穿梭時(shí)，它們會經(jīng)歷構(gòu)象變化[5-6].

2 Rheb的互作蛋白

2.1 TCTP

翻譯控制腫瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein，TCTP)是真核生物中廣泛表達(dá)的一種保守的蛋白，結(jié)構(gòu)上與磷脂酰肌醇激酶(Mammalian suppressor of Sec4，Mss4)蛋白相似，與腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖與凋亡有關(guān)，在維持細(xì)胞正常生理功能中發(fā)揮重要作用[7].2001年Thaw等發(fā)現(xiàn)了TCTP與Mss蛋白家族在結(jié)構(gòu)上具有相似性后，首次提出TCTP可能是GTP酶的鳥苷酸交換因子(Guanine-nucleotide exchange factor，GEF)[8].2007年Hsu的實(shí)驗(yàn)[9]證明了TCTP是調(diào)控Rheb的GEF，可以直接與Rheb相互作用.董咸池[10]通過體外和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明了人源TCTP可與Rheb相互作用，并且可加速GDP的釋放，激活mTORC1信號通路.此外，TCTP突變體E12V是一個(gè)缺乏GEF活性的突變體，解析該突變體晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該突變體活性的喪失并不是由于整體結(jié)構(gòu)上的改變，而是因?yàn)槿鄙倏梢耘cRheb上Lys45形成鹽鍵的谷氨酸.14-3-3蛋白與TCTP和Rheb的強(qiáng)遺傳相互作用表明它們可以共同調(diào)節(jié)器官發(fā)育，14-3-3蛋白是TCTP-Rheb相互作用和生長發(fā)育所需要的[11].上述研究明確了TCTP和Rheb的相互作用關(guān)系.

2.2 PLD1

磷脂酶D(Phospholipase，PLD)是一類能夠催化磷脂酰膽堿水解的酶.其水解產(chǎn)物磷脂酸、二脂酰甘油及溶血磷脂酸等均可作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，參與調(diào)控許多生理和生化過程，如調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、存活和遷移等[12-13].Sun等[14]發(fā)現(xiàn)PLD1是HEK293細(xì)胞中血清饑餓刺激mTORC1活化所必需的.并且C2C12成肌細(xì)胞中肌源性mTOR通路的激活也需要PLD1[15-16].在沒有促有絲分裂刺激的情況下，Rheb的過表達(dá)激活細(xì)胞中的PLD1，且敲除Rheb抑制血清饑餓刺激對PLD活化的作用.Rheb以GTP依賴性方式體外結(jié)合并激活PLD1，表明PLD1是Rheb的真正效應(yīng)器.以上均可說明，對于mTOR信號傳導(dǎo)的Rheb激活，PLD1是必需的.

2.3 FKBP38

FK506結(jié)合蛋白38(FK506 binding protein 38，F(xiàn)KBP38)，也稱之為FKBP8，屬于順反異構(gòu)酶FK506結(jié)合蛋白家族中的一員，是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的蛋白.FKBP38也是免疫親和素FKBP家族的成員，可與mTOR結(jié)合并抑制其活性，即Rheb通過與FKBP38結(jié)合釋放mTOR而使其具有活性[17].Bai等[18]在HEK293細(xì)胞中證實(shí)了在氨基酸和營養(yǎng)因子缺乏的情況下，F(xiàn)KBP38與mTOR的結(jié)合增強(qiáng)，抑制mTOR下游S6蛋白激酶1(Protein S6 kinase 1，S6K1)和4E結(jié)合蛋白-1(4 Ebinding protein 1，4E-BP1)的磷酸化.但在氨基酸和營養(yǎng)因子可用時(shí)，F(xiàn)KBP38對于mTORC1的抑制作用可被Rheb解除.Rheb是一種小G蛋白，具有小G蛋白典型的特征，即結(jié)合GTP后的Rheb可以強(qiáng)烈地結(jié)合FKBP38，而結(jié)合GDP的Rheb與FKBP38的結(jié)合能力很弱[19].2009年Dunlop也使用HEK293細(xì)胞證實(shí)了FKBP38可以抑制mTOR，支持Rheb-FKBP38有相互作用[20].Rheb通過其Switch區(qū)域與FKBP38的FKBP-C結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而使結(jié)合在mTORCl上的FKBP38解離下來，激活mTORCl，并磷酸化S6K1和4E-BPl，促進(jìn)蛋白質(zhì)的翻譯.另外，F(xiàn)KBP38N末端的108個(gè)氨基酸以及TM結(jié)構(gòu)域?qū)τ贔KBP38作用于mTORCl是必需的.利用線粒體探針實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了Rheb也定位于線粒體，即二者的相互作用很有可能依賴于在線粒體上的定位[21].這些結(jié)果，均支持Rheb與FKBP38之間相互作用的關(guān)系.

3 Rheb的功能

3.1 調(diào)節(jié)細(xì)胞分化

細(xì)胞分化(Cell differentiation)是指由于細(xì)胞內(nèi)基因選擇性表達(dá)，導(dǎo)致同一來源的細(xì)胞逐漸產(chǎn)生出形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能各不相同的細(xì)胞的過程.許多研究表明Rheb在一些細(xì)胞分化中起至關(guān)重要的作用.Ashraf等[22]通過研究發(fā)現(xiàn)Rheb在人類脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derived stem cell，ASCs)的分化中起重要作用.ASCs是一種可分化為包括軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等多種不同種類的細(xì)胞[23].過表達(dá)的Rheb可以增加ASCs前體的軟骨生成和成骨生成，降低ASCs前體的脂肪生成.SOX9(SRY-type HMG box 9)蛋白是軟骨特異性分化標(biāo)志物，而Rheb可以上調(diào)SOX9、糖胺聚糖(Glyeosaminoglycans，GAGs)和II型膠原(Collagen type Ⅱ，COL2)基因表達(dá)，促進(jìn)ASCs的軟骨分化.Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)是成骨特異性分化標(biāo)志物，Rheb可以上調(diào)該蛋白，增加鈣和磷酸鹽含量，促進(jìn)成骨分化.此外，Rheb過表達(dá)會阻礙細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞.多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均證明Rheb在ASCs的細(xì)胞分化中起著關(guān)鍵作用，所以可以利用Rheb增強(qiáng)干細(xì)胞的軟骨和成骨分化，治療軟骨和骨缺損.2019年Wang等[24]通過研究發(fā)現(xiàn)缺乏Rheb1也可導(dǎo)致細(xì)胞過度分化為骨髓.上述研究支持了Rheb與細(xì)胞分化之間存在復(fù)雜聯(lián)系，但是有待于進(jìn)一步研究.

3.2 mTOR信號通路與自噬

自噬(Autophagy)是指細(xì)胞通過溶酶體中的水解酶降解自身不需要或受損的細(xì)胞器和大分子，是一種細(xì)胞自身分解代謝的過程，在維持細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用.“自食”的概念最早是由De Duve[25]于1963年的研究中發(fā)現(xiàn)并提出的，他還在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)了宏觀自噬和微觀自噬[26].自噬的過程十分復(fù)雜，涉及多個(gè)自噬相關(guān)基因.Rheb就是與細(xì)胞自噬相關(guān)的重要基因之一[27].它有兩條途徑控制細(xì)胞自噬.

第一條途徑是Rheb通過直接調(diào)節(jié)AMP活化蛋白激酶(Adenosine 5‘-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK)調(diào)控細(xì)胞自噬[28].Rheb過表達(dá)，促進(jìn)AMPK表達(dá)，AMPK使自噬相關(guān)蛋白Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶(Vacuolar protein sorting 34，VPS34)和Beclin-1磷酸化，提高自噬啟動因子nuc-51樣激酶(Unc-51-like kinase，ULK)活性，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生自噬[29].

第二條途徑是通過控制mTOR調(diào)節(jié)其他自噬相關(guān)基因調(diào)控細(xì)胞自噬[30].mTOR是哺乳類動物的一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞增殖、細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞存活、蛋白質(zhì)合成、自噬與轉(zhuǎn)錄，同時(shí)又可被雷帕霉素(Rapamycin)抑制[31].其存在于兩種復(fù)合物中，分別被稱為mTOR復(fù)合物1(mTORC1)和mTOR復(fù)合物2(mTORC2).mTORC1是一種主要以mTOR與輔助蛋白Raptor(Regulatory associated protein of mTOR)和mLST8(Mammalian lethal with SEC13 protein 8)為核心成分的超過1MDa的二聚體復(fù)合物[32]，其機(jī)制靶標(biāo)充當(dāng)驅(qū)動細(xì)胞生長的代謝途徑的中心調(diào)節(jié)劑，是細(xì)胞生長和代謝的主要調(diào)節(jié)因子，同時(shí)對細(xì)胞自噬有重要的調(diào)節(jié)作用.Rheb是mTOR的上游調(diào)節(jié)物，正向調(diào)控mTOR信號通路.研究表明，與GTP結(jié)合的Rheb可激活mTORC1[33]，而mTORC1對自噬有負(fù)調(diào)控作用[34].在氨基酸存在的情況下，重組激活基因(Recombinase activating genes，Rag)蛋白定位mTORC1于溶酶體上，繼而被穩(wěn)定定位于溶酶體的GTP結(jié)合形式的Rheb激活[35].被激活的mTOR促使ULK1和自噬相關(guān)蛋白13(Autophagy-related gene 13，ATG13)磷酸化，阻斷ATG1和ATG13的相互作用，使ULK1-ATG13-FIP200(200 kDa的局灶性粘附激酶家族相互作用蛋白)多蛋白復(fù)合物的活性得到抑制，最終抑制細(xì)胞發(fā)生自噬.ULK-Atg13-FIP200復(fù)合物是mTOR信號通路調(diào)節(jié)自噬的直接靶點(diǎn)[36].mTORC1還通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子EB(Transcription Factor EB，TFEB)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控細(xì)胞自噬.自噬相關(guān)蛋白7(Autophagy-related gene，ATG7)是參與該類細(xì)胞自噬啟動的重要基因，TFEB通過增強(qiáng)ATG7的表達(dá)量來調(diào)節(jié)自噬.當(dāng)mTOR被Rheb激活后，mTOR在Ser211位點(diǎn)磷酸化TFEB.mTORC1也可能通過調(diào)控直接損害溶酶體腔酸化所需要的溶酶體蛋白的活性，如三磷酸水解酵素(Vacuolar-type ATPase，v-ATPase)，影響溶酶體功能和自噬體-溶酶體融合的過程，從而控制細(xì)胞自噬的發(fā)生[34].

上述研究證明細(xì)胞自噬受到Rheb的高度調(diào)控.因此可以通過控制Rheb的表達(dá)控制細(xì)胞自噬發(fā)生，并在今后將此運(yùn)用到疾病的治療中.

3.3 腫瘤與疾病

近年來，越來越多的研究表明Rheb與某些癌癥密切相關(guān).因此分析Rheb與腫瘤的關(guān)系對于全面認(rèn)識癌癥的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及癌癥的治療有非常重要的意義.Y35N為Rheb進(jìn)化保守區(qū)域的易突變位點(diǎn)，該點(diǎn)的突變不僅影響Rheb與BRAF的相互作用，還可導(dǎo)致BRAF/MEK/ERK信號傳導(dǎo)減少，最終造成細(xì)胞的癌變[37-38].此外，汪曉敏等[39]研究發(fā)現(xiàn)在急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)患者骨髓細(xì)胞Rheb的表達(dá)高于正常值，并且白血病細(xì)胞對阿糖胞苷藥較正常的敏感，還發(fā)現(xiàn)低表達(dá)Rheb會造成小鼠脾臟增大.Gao Y等[40]通過建立Rheb1缺失的MLL-AF9小鼠AML模型發(fā)現(xiàn)若缺失Rheb1，AML小鼠的生存時(shí)間將增加.上述研究為證明Rheb與白血病存在密切關(guān)系提供了有力的證據(jù)，也為白血病的治療提供了一種新思路.

4 小結(jié)與展望

Rheb是在進(jìn)化上高度保守的GTP結(jié)合蛋白，可通過mTOR信號通路影響下游基因，調(diào)控細(xì)胞自噬的發(fā)生，影響細(xì)胞的分化，在抑制腫瘤和癌癥方面有重要作用.迄今為止，對于Rheb的研究主要建立在mTOR信號通路的基礎(chǔ)上，二者功能的交集還處于未知狀態(tài).除此之外，雖然Rheb在抑制腫瘤和癌癥中有不可忽視的作用，但將其投入藥用依然具有挑戰(zhàn)性.通過對作用機(jī)理的深入探索，進(jìn)一步了解其生物學(xué)特性與功能，在醫(yī)學(xué)上的具體應(yīng)用產(chǎn)生突破.