菊苣酸脂質(zhì)體制備工藝研究

王玉真，高爽，孫越，張麗，薄福民，封安杰，李凌軍

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250355)

菊苣酸(chicoric acid ，CA)是一種咖啡酸衍生物，主要存在于紫錐菊、菊苣、白頭翁、蒲公英等天然植物中[1-4]?！懊庖咧参铩弊襄F菊作為免疫促進劑和調(diào)節(jié)劑，受到國內(nèi)外的極大關(guān)注，菊苣酸就是其有效活性成分之一[5-6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，菊苣酸具有抗氧化、保護心血管、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗HIV病毒、抗乙型肝炎病毒、降血糖、治療脂肪肝、降尿酸等作用[7]。

菊苣酸化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，受熱見光易分解，膜滲透性差，口服生物利用度較低，容易在胃內(nèi)發(fā)生降解，且腸道吸收較差[8-9]。脂質(zhì)體作為一種新型藥物載體，具有生物相容性好、生物利用度高、提高藥物穩(wěn)定性、促進吸收等優(yōu)點[10]。因此，為了提高菊苣酸穩(wěn)定性及生物利用度，將其制備成脂質(zhì)體。目前常用pH梯度、薄膜分散、乙醇注入、逆向蒸發(fā)法來制備脂質(zhì)體，具體選擇何種方法由藥物的性質(zhì)決定[10]?？梢酝ㄟ^透析[11]、高速離心[12]、微柱離心[13]、凝膠柱色譜[14]、超濾離心[15]等方法測定脂質(zhì)體包封率，每種測定方法都有其優(yōu)勢和不足，需根據(jù)藥物性質(zhì)及實際情況選擇合適的測定方法。通過前期實驗篩選，確定薄膜分散法為菊苣酸脂質(zhì)體的制備方法，透析法為菊苣酸脂質(zhì)體包封率測定方法，在此基礎(chǔ)上，本實驗通過單因素及Box-Behnken design(BBD)響應(yīng)面法，以菊苣酸的包封率為評價指標，考察菊苣酸脂質(zhì)體的最佳制備工藝。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Technologies 1260 Series高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；IKA RV8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司)；BLON-650Y超聲波細胞粉碎機(鄭州比朗儀器有限公司)。

1.2 材料

菊苣酸(純度98%，批號171225A，南京道斯夫生物科技有限公司)；菊苣酸對照品(純度97.6% ，批號111752-201703，中國食品藥品檢定研究院)；大豆卵磷脂(w(PC)≥90%，批號T27D9F77974)、膽固醇(純度95%，批號L27J9F66501)、透析袋(截留分子量8000～14 000 D ，批號R27F10J81596)均購自上海源葉生物科技有限公司；水為蒸餾水(山東中醫(yī)藥大學(xué)制造)；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm , 5 μm)；流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液(體積比22:78)；流速為1 mL·min-1；檢測波長為326 nm。

2.1.2 對照品儲備液

精密稱取菊苣酸對照品適量，加甲醇溶解得到濃度為0.476 0 mg·mL-1的菊苣酸對照品儲備液。

2.1.3 供試品溶液

精密量取菊苣酸脂質(zhì)體溶液1.0 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，搖勻，用0.22 μm濾膜過濾，即得菊苣酸供試品溶液。

2.1.4 專屬性考察

分別精密移取對照品溶液、空白脂質(zhì)體溶液和菊苣酸脂質(zhì)體溶液適量，進樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。

2.1.5 標準曲線的繪制

分別精密移取對照品儲備液0.20，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 mL于10 mL棕色容量瓶中，甲醇稀釋定容，得濃度分別為0.009 52，0.023 8，0.047 6，0.071 4，0.095 2，0.119 0 mg·mL-1的菊苣酸對照品溶液。進行HPLC測定，記錄峰面積。以菊苣酸對照品溶液濃度為橫坐標X，以峰面積為縱坐標Y，得菊苣酸回歸方程為Y=22 305X-140.14(R2=0.999 7 ，n=6)。結(jié)果表明，菊苣酸在0.009 52～0.119 00 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積的積分值線性關(guān)系良好。

2.1.6 精密度實驗

低濃度、中濃度、高濃度的菊苣酸對照品溶液，每個樣品連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。測得低濃度、中濃度、高濃度菊苣酸峰面積相對標準偏差分別為 0.60%，0.08%，0.06%(n=6)，表明該方法精密度良好。

圖1 空白脂質(zhì)體、菊苣酸脂質(zhì)體、菊苣酸對照品的HPLC圖Fig.1 HPLC diagram of blank liposome, chicoric acid liposome, chicoric acid, and reference substance

2.1.7 穩(wěn)定性實驗

精密移取一定量的菊苣酸供試品溶液，在室溫下分別放置0，2，4，6，12，24 h后進行測定。測得菊苣酸峰面積相對標準偏差為 0.23%(n=6)，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8重復(fù)性實驗

精密移取同一樣品6份，按照2.1.3項下方法制備供試品溶液，進行測定。測得菊苣酸峰面積相對標準偏差為 0.45%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收實驗

精密移取同一已知濃度供試品6份，分別精密加入適量菊苣酸對照品溶液，測定其峰面積，計算加樣回收率，得菊苣酸的平均加樣回收率為103.19%,表明該方法可靠性較高。

2.2 菊苣酸脂質(zhì)體制備及包封率測定

2.2.1 菊苣酸脂質(zhì)體的制備

稱取適量的磷脂、膽固醇，加入氯仿振蕩使之溶解，菊苣酸用無水乙醇溶解后，將兩者混勻，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜(45 ℃)，繼續(xù)抽真空15 min，再加入水合介質(zhì)，水化一定時間后，冰浴條件下用超聲波細胞粉碎機超聲一定時間(超聲3 s，間隔3 s)，即得菊苣酸脂質(zhì)體混懸液[16-17]。

2.2.2 菊苣酸脂質(zhì)體包封率的測定

精密量取適量菊苣酸脂質(zhì)體，甲醇溶解，過濾，進行HPLC測定，通過計算可得菊苣酸的質(zhì)量濃度(C0)。另取等量脂質(zhì)體于透析袋內(nèi)，以蒸餾水為透析介質(zhì)，透析8 h，透析后的脂質(zhì)體用甲醇破乳，過濾，進行HPLC測定，得菊苣酸的質(zhì)量濃度(C1)，根據(jù)式(1)計算菊苣酸的包封率。

包封率=包封的藥量/系統(tǒng)中包封與未包封藥物總量×100%。

(1)

2.3 菊苣酸脂質(zhì)體的單因素考察

2.3.1 磷脂與膽固醇的質(zhì)量比篩選

固定卵磷脂與菊苣酸的質(zhì)量比為10:1，以5 mL蒸餾水作為水合介質(zhì)，水合時間為30 min，超聲時間為3 min，分別以卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為3:1，4:1，6:1，8:1，10:1制備脂質(zhì)體，測得包封率分別為49.69%，51.07%，43.06%，38.91%，39.10%。結(jié)果表明，當(dāng)卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為4:1時包封率最大，且隨著卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比的逐漸增加包封率先增后減。

2.3.2 磷脂與藥物的質(zhì)量比篩選

固定卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為4:1，以5 mL蒸餾水作為水合介質(zhì)，水合時間為30 min，超聲時間為3 min，選取卵磷脂與藥物的質(zhì)量比為8:1，10:1，12:1，14:1，16:1制備脂質(zhì)體，測得包封率分別為43.20%，51.07%，53.03%，51.48%，45.67%。結(jié)果表明，當(dāng)卵磷脂與菊苣酸的質(zhì)量比為12:1時包封率最大，比例增大或減小包封率均降低。

2.3.3 水合介質(zhì)種類篩選

固定卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為4:1，卵磷脂與藥物的質(zhì)量比為12:1，水合介質(zhì)用量為5 mL，水合時間為30 min，超聲時間為3 min，水合介質(zhì)分別為水和pH6.4,pH6.8,pH7.2的PBS(磷酸鹽)緩沖液制備脂質(zhì)體，測得包封率分別為52.31%，51.56%，47.82%，54.47%。結(jié)果表明，pH7.2的PBS緩沖液作為水合介質(zhì)時包封率最大。

2.3.4 水合介質(zhì)用量篩選

固定卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為4:1，卵磷脂與藥物的質(zhì)量比為12:1，水合介質(zhì)為pH7.2的PBS緩沖液，水合時間為30 min，超聲時間為3 min，水合介質(zhì)用量分別為5，10，15，20 mL，測得包封率分別為53.25%，63.01%，62.19%，63.42%。結(jié)果表明，當(dāng)水合介質(zhì)用量為10 mL或更多時，包封率變化不大，因此水合介質(zhì)用量固定為10 mL。

2.3.5 水合時間篩選

固定卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為4:1，卵磷脂與藥物的質(zhì)量比為12:1，水合介質(zhì)為pH7.2的PBS緩沖液10 mL，超聲時間為3 min，水合時間分別為30，60，90，120 min，測得包封率分別為64.43%，66.23%，62.38%，58.44%。結(jié)果表明，當(dāng)水合時間為60 min時，包封率最大。

2.3.6 超聲時間篩選

固定卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為4:1，卵磷脂與藥物的質(zhì)量比為12:1，水合介質(zhì)為pH7.2的PBS緩沖液10 mL，水合時間分別為60 min，超聲時間分別2，4，6，8，10 min，測得包封率分別為63.72%，69.65%，72.38%，68.06%，61.80%?？芍S著超聲時間的逐漸增加，包封率先增大后減小，在超聲時間為6 min時包封率最大。

2.4 Box-Behnken design響應(yīng)面法優(yōu)化脂質(zhì)體處方

2.4.1 實驗設(shè)計及結(jié)果

以單因素試驗為基礎(chǔ)，選擇了卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比(X1)、卵磷脂與菊苣酸質(zhì)量比(X2)、超聲時間(X3)這三個對脂質(zhì)體包封率影響較大的因素作為實驗因素，采用響應(yīng)面法(BBD)進行分析，以包封率(Y)為評價指標。實驗設(shè)計及結(jié)果見表1、2。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素和水平

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

2.4.2 模型擬合

本實驗通過Design Expert軟件對實驗數(shù)據(jù)(表2)進行了分析及模型擬合，結(jié)果見表3，并對得到的擬合模型進行了評價，得到回歸方程：

Y=74.97+0.29X1-2.53X2+1.60X3-1.75X1X2+0.41X1X3-0.21X2X3-2.20X12-5.24X22-3.20X32(R2=0.981 8，P< 0.000 1，F(xiàn)=41.95，失擬度檢驗P=0.055 5> 0.05、F=6.17 )。

由擬合結(jié)果可知，模型F=41.95，P< 0.000 1，說明該擬合模型具有高度顯著性；失擬值F=6.17，P>0.05，說明失擬值不顯著性，模型無失擬情況且擬合良好，因此，可以用該模型對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。方程的決定系數(shù)R2=0.981 8>0.95，說明該模型能準確地預(yù)測實際情況[18]。

表3 方差分析結(jié)果

續(xù)表3

2.4.3 響應(yīng)面工藝優(yōu)化分析

根據(jù)擬合得到的結(jié)果，保持一個因素水平不變，繪制出Y與其他2個因素的等高線圖和3D效應(yīng)曲面圖，從而預(yù)測出菊苣酸脂質(zhì)體的最優(yōu)制備工藝，見圖2。由圖2和表3數(shù)據(jù)可知，X2，X3，X1X2，X12，X22，X32的P值均小于0.05，對包封率影響顯著，且各因素之間存在交互影響。

圖2 Y與(X1，X2，1)、(X1，X3，2)、(X2，X3，3)三因素的三維效應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.2 Three-dimensional effect surface diagram and contour map of Y and three factors(X1, X2, 1),(X1，X3, 2), and (X2，X3, 3)

根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果，得到菊苣酸脂質(zhì)體最優(yōu)工藝條件：磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為4.20:1，磷脂與藥物的質(zhì)量比為11.44:1，超聲時間為6.54 min。在實際實驗過程中為了操作便捷，僅保留小數(shù)點后一位，即磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為4.2:1，磷脂與藥物的質(zhì)量比為11.4:1，超聲時間為6.5 min。為檢驗結(jié)果的可靠性，根據(jù)上述調(diào)整后條件進行3批驗證實驗，測得包封率的平均值為75.18%，相對標準偏差為2.1%，與理論預(yù)測值(75.57%)相差不大，相對偏差低于3%，表明該模型可靠，菊苣酸脂質(zhì)體制備采用響應(yīng)面法具有可行性[19]。

2.5 脂質(zhì)體的載藥量、粒徑和Zeta電位

測定最優(yōu)工藝所得菊苣酸脂質(zhì)體的載藥量，并采用納米激光粒徑分析儀分別測定脂質(zhì)體的平均粒徑、多分散指數(shù)(PDI)和Zeta電位。實驗結(jié)果表明 ，其載藥量為5.15%、平均粒徑為150.73 mm、PDI為0.244、Zeta電位為-12.82 mV，粒徑分布及Zeta電位圖見圖3。

圖3 菊苣酸脂質(zhì)體的粒徑分布與Zeta電位Fig. 3 Particle size distribution and zeta potential of chicoric acid liposome

3 結(jié)論與討論

在前期實驗中，分別用高速離心法、透析法和葡聚糖凝膠微柱離心法來測定菊苣酸脂質(zhì)體的包封率，在高速離心的過程中，規(guī)定時間內(nèi)脂質(zhì)體無法在離心管中有效沉積，后來又延長離心時間，脂質(zhì)體與游離藥物也無法有效分離，因此該方法不能用來測定菊苣酸脂質(zhì)體包封率。葡聚糖凝膠微柱離心法測定脂質(zhì)體包封率時，利用分子篩的原理分離脂質(zhì)體及游離藥物，實驗結(jié)果表明空白脂質(zhì)體可以有效地洗脫下來，但凝膠微柱對游離藥物保留率不高，從而導(dǎo)致脂質(zhì)體與游離藥物也無法有效分離，因此該方法無法有效分離脂質(zhì)體與游離藥物。透析法測定包封率時，透析8 h后透析袋內(nèi)外游離藥物濃度即可達到平衡，脂質(zhì)體被有效截留在透析袋內(nèi)，且菊苣酸在該時間段內(nèi)保持穩(wěn)定。因高速離心法和葡聚糖凝膠微柱離心法無法將脂質(zhì)體與游離藥物有效分離，最終選擇透析法作為菊苣酸脂質(zhì)體包封率測定方法。

本實驗也分別考察了薄膜分散法、乙醇注入法、逆向蒸發(fā)法制備菊苣酸脂質(zhì)體，實驗結(jié)果顯示，采用薄膜分散-超聲法制得菊苣酸脂質(zhì)體時包封率較高，因此確定菊苣酸脂質(zhì)體制備方法為薄膜分散-超聲法。采用單因素試驗，考察了卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比、卵磷脂與藥物的質(zhì)量比、水合介質(zhì)種類、水合介質(zhì)用量、水合時間和超聲時間，確定了水合介質(zhì)為pH7.2的PBS緩沖液、用量為10 mL、水合時間為60 min，又通過Box-Behnken試驗設(shè)計得到了Y與X1，X2，X3三者之間關(guān)系的回歸模型，充分考慮了各因素的交互作用[20]，得到優(yōu)化后制備工藝條件：磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為4.20:1、磷脂與藥物的質(zhì)量比為11.44:1、超聲時間為6.54 min，在此條件下制備得到的脂質(zhì)體包封率為75.18%，驗證實驗結(jié)果表明，該制備工藝穩(wěn)定可行。

目前，脂質(zhì)體制備用到的水化介質(zhì)多為水或磷酸鹽緩沖液(具體選擇何種水化介質(zhì)需根據(jù)藥物性質(zhì)確定)，因此制備得到的大多數(shù)載藥脂質(zhì)體均處于水系環(huán)境中，存在脂質(zhì)體融合、藥物滲漏、磷脂水解等問題，不適合長時間貯存。冷凍干燥法被證實是可以有效改善脂質(zhì)體長期穩(wěn)定性的方法之一，因此下一步可將制備好的菊苣酸脂質(zhì)體混懸液制備為菊苣酸脂質(zhì)體凍干制劑，以提高制劑的穩(wěn)定性。