凡納濱對蝦室外生物絮團(tuán)養(yǎng)殖池水體理化因子和細(xì)菌的變化

廖栩崢，陳金榮，秦海鵬，王博，胡世康，孫成波

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

我國已成為世界上對蝦養(yǎng)殖面積最大和產(chǎn)量最高的國家。自2001年以來，我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，養(yǎng)殖面積和產(chǎn)量逐年增加，現(xiàn)已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中重要的支柱性產(chǎn)業(yè)[1]。凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）擁有生長速度快，對環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[2]。在20世紀(jì)80年代末，我國將其引入，并在人工育苗方面獲得成功[3]。近年來，隨著養(yǎng)殖的規(guī)模擴(kuò)大和集約化程度的提高，養(yǎng)殖對環(huán)境的污染、養(yǎng)殖生物疾病的暴發(fā)和化學(xué)藥物的殘留等問題日益突出，對凡納濱對蝦的養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展帶來了嚴(yán)重影響。目前對蝦養(yǎng)殖業(yè)的所需做的任務(wù)之一應(yīng)為進(jìn)一步提高高位池養(yǎng)殖技術(shù)，生物絮團(tuán)技術(shù)可作為一種新的思路。當(dāng)今對蝦高位池養(yǎng)殖的硬件設(shè)施以及管理操作等應(yīng)用為發(fā)展生物絮團(tuán)技術(shù)提供了必要條件[4]。生物絮團(tuán)技術(shù)（Biofloc Technology）的研究和發(fā)展為對蝦養(yǎng)殖提供了有效的技術(shù)支撐和解決方法[5]?；谏镄鯃F(tuán)技術(shù)的養(yǎng)殖模式符合當(dāng)代養(yǎng)殖發(fā)展的要求，是我國對蝦養(yǎng)殖的發(fā)展方向。

以色列學(xué)者Avnimelech在1999年系統(tǒng)地提出了關(guān)于在養(yǎng)殖系統(tǒng)中投入的C/N比對養(yǎng)殖系統(tǒng)水質(zhì)調(diào)控的生物絮團(tuán)反應(yīng)機(jī)制理論[6]，通過將生物絮團(tuán)技術(shù)投入到現(xiàn)實的生產(chǎn)，此舉對養(yǎng)殖水體中的氨氮和亞硝酸氮水平有著顯著的降低作用[7]。生物絮團(tuán)是以異養(yǎng)菌為主的菌膠團(tuán)，經(jīng)生物絮凝作用結(jié)合水體中有機(jī)質(zhì)、原生動物、藻類、絲狀菌等形成的絮狀物[8]。目前我國的傳統(tǒng)水產(chǎn)養(yǎng)殖的生產(chǎn)中，由于殘餌和養(yǎng)殖動物排泄物得不到及時分解，水體中的氮經(jīng)常會處于高水平，這時候通過添加碳源，異養(yǎng)微生物就開始同化水體無機(jī)氮從而轉(zhuǎn)化為自身蛋白，并且生物絮團(tuán)含有可被對蝦攝食的營養(yǎng)物質(zhì)，提高飼料的利用率，減少投餌量，此外生物絮團(tuán)含有大量活性物質(zhì)可以提高對蝦的非特異性免疫力[9]。生物絮團(tuán)技術(shù)目前還很不成熟，生產(chǎn)上生物絮團(tuán)的形成容易受到許多因素的影響，例如溫度、鹽度和pH值等。國外已有報道相似，國內(nèi)生物絮凝培養(yǎng)取得了理想效果，顯著提高了生長率，增加了誘餌系數(shù)，明顯著抑制了弧菌的產(chǎn)生，穩(wěn)定了水質(zhì)，使得對蝦的硝化沒活力和免疫酶活力得到提高[10]。

由于很多機(jī)理沒研究透徹導(dǎo)致室外不可控因素較多,現(xiàn)在大部分生物絮團(tuán)的形成是在室內(nèi)養(yǎng)殖池塘，該試驗在室外養(yǎng)殖池塘培養(yǎng)生物絮團(tuán)，以期為對蝦生物絮團(tuán)養(yǎng)殖奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗地點(diǎn)在廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物研究基地進(jìn)行，試驗時間為123 d。試驗挑選體長為（2.35±0.40）cm，體質(zhì)量為（0.16±0.07）g體質(zhì)健壯的凡納濱對蝦作為試驗用蝦，池塘面積為800 m2，池塘中放入130 000尾對蝦。試驗通過接種生物絮團(tuán)，添加氮源和碳源，維持水體C/N為15∶1，構(gòu)建室外生物絮團(tuán)池，試驗過程中適量補(bǔ)充碳源。投喂時間為 07：00、11：00、18：00、23：00，每天觀察對蝦的攝食情況和生長情況。

1.2 方法

1.2.1 測定指標(biāo)

試驗期間每日08：00點(diǎn)進(jìn)行水體理化因子的測定。pH值、溫度、鹽度檢測方法使用電子儀器檢測；氨氮（TAN）采用靛酚藍(lán)法，亞硝酸鹽（Nitrite）采用重氮-偶氮法，硝酸鹽（Nitrate）采用鋅-鎘還原法，弧菌菌落數(shù)、總菌菌落數(shù)使用稀釋涂步平板計數(shù)法。

1.2.2 主要試劑與器具

磺胺（10 g/L），鹽酸納乙二胺溶液（1 g/L），氯化鎘溶液（20%），鋅卷（AR）（5 cm×6 cm），檸檬酸鈉（480 g/L），苯酚溶液，次氯酸鈉溶液（1.50 mg/mL有效氯），鹽酸（0.018 mol/L），酚酞指示劑，甲基紅-次甲基藍(lán)混合指示劑，營養(yǎng)瓊脂，TCBS培養(yǎng)基。筆式酸度計pH-220（杭州齊威儀器有限公司）。

1.2.3 樣品的采集和DNA的提取

將采集的水樣用0.22 μm濾膜對室外生物絮團(tuán)水進(jìn)行真空抽濾，每張濾膜過濾150 mL的養(yǎng)殖海水，將濾膜置于50 mL的離心管中，放入-80℃冰箱中保存。DNA提取根據(jù)DNA Isolation Kit（美國Hipurte Power SoilR）說明書進(jìn)行。

1.2.4 PCR擴(kuò)增

引物設(shè)計：341F：5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’；806R：5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’。反應(yīng)體系：5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+Plus）10 μl，dNTP混合物（2.5 mM each）4 μL，上下游引物（5 μM）各 1 μL，PrimeSTARHSDNAPolymerase0.5μL，DNA模板10 ng，補(bǔ)充超純水至20μl。PCR反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性：1×（1min，98°C）；循環(huán)：27×（30 s，98 °C；30 s，55 °C；30 s，72 °C）；后延伸：5 min，72 °C。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用EXCEL軟件列出各個指標(biāo)變化值并且處理試驗組與對照組不同數(shù)據(jù)間的變化趨勢圖。試驗數(shù)據(jù)運(yùn)用平均值+標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)合Duncan’s法進(jìn)行多重比較，P<0.05時處理組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物絮團(tuán)對氨氮的影響

氨氮的最高濃度在第28天，濃度為（8.53±0.60）mg/L，之后開始下降，第30 天達(dá)到最低值（1.70±0.15）mg/L。在80 d之后的試驗養(yǎng)殖周期氨氮較為平穩(wěn)，大部分在1 mg/L以下，最低值在第88天和第108天，濃度為（0.24±0.05）mg/L。

2.2 生物絮團(tuán)對亞硝酸鹽的影響

驗期間亞硝酸鹽濃度從第1天到到第26天都在0.17 mg/L以下，最低值在第16天，濃度為0 mg/L。從第26天起亞硝酸鹽濃度開始快速上升，在第46天達(dá)到峰值，亞硝酸鹽濃度為（5.18±0.03）mg/L。從第65天開始到第83天快速下降，最低值在第83天，濃度為（0.89±0.02）mg/L。從第84天開始，到試驗結(jié)束，亞硝酸鹽一直保持在0.71 mg/L以下，最低值在第 121天，濃度為（0.07±0.01）mg/L。

2.3 生物絮團(tuán)對硝酸鹽的影響

試驗期間硝酸鹽濃度從第1天到到第28天波動較小，濃度都在0.34 mg/L以下。從第29天起硝酸鹽濃度開始迅速上升，第90天硝酸鹽濃度達(dá)到最高為（11.11±0.39）mg/L，到試驗結(jié)束，硝酸鹽的濃度趨于平穩(wěn)，濃度在（4.10±0.15）～（6.49±0.23）mg/L之間。

2.4 構(gòu)建生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng)期間pH值的變化

試驗前期，最高值為第12天，pH值為8.05±0.00，最低值在第53天，pH值為7.49±0.02。在第64天，pH值快速降低，達(dá)到6.61±0.03。從第65天開始，到第84天一直穩(wěn)定在pH值為7.47±0.01～7.59±0.01之間。試驗進(jìn)行到第85天開始，pH值呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢，最高值在第108天，pH值為8.31±0.02。

2.5 生物絮團(tuán)微生物多樣性分析

表1為室外生物絮團(tuán)Alpha生物多樣性分析結(jié)果。其Otus數(shù)量為831±72.06，在菌群豐度指數(shù)指數(shù)中，Ace 為 1 180.75±133.94，Chao1 為 1 195.12±124.93；在菌群多樣性指數(shù)中，Shannon為 6.16±0.02，Simpson 為 0.96±0.01。

表1 Alpha多樣性分析

2.6 生物絮團(tuán)微優(yōu)勢菌群分析

由圖5可見，從門的分類水平上來分析，變形菌門（Proteobacteria）所占的比例最多（62.43%±1.26%），藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）所占的比例最低（4.44%±0.35%）；從科的分類水平上分析，紅桿菌科（Rhodobacteraceae）占的比例最高（22.01%+2.25%），分支桿菌科（Mycobacteriaceae）占的比例最低（1.06+0.40%）（表2）；從屬的分類水平上分析，Candidatus Aquiluna所占的比例最高為8.10%±0.39%，其次是聚球藍(lán)細(xì)菌屬所占的比例為3.32%±0.31%（圖6）。

表2 室外生物絮團(tuán)微生物優(yōu)勢科結(jié)構(gòu)

3 討論

3.1 室外生物絮團(tuán)養(yǎng)殖模式對亞硝酸鹽、氨氮和硝酸鹽含量的影響

從監(jiān)測水體中三氮轉(zhuǎn)化的變化結(jié)果來看，該試驗所構(gòu)造的生物絮團(tuán)能很好的促進(jìn)三氮的轉(zhuǎn)化。有研究表明，生物絮團(tuán)起著降低養(yǎng)殖水體中的氮含的作用。生物絮團(tuán)技術(shù)是一種通過向水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)添加額外碳，并通過添加外部碳源或提高飼料中碳含量來提高水質(zhì)的技術(shù)[11]。在碳氮平衡的條件下，養(yǎng)殖動物排泄物和剩餌產(chǎn)生的氨氮的轉(zhuǎn)化可通過自養(yǎng)微生物的硝化作用、藻類的光能自養(yǎng)和異養(yǎng)微生物的同化作用等途徑實現(xiàn)[12]。傳統(tǒng)水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中，水體中的氮經(jīng)常會由于殘餌和養(yǎng)殖動物排泄物而處于較高水平[9]，若此時添加額外碳源，異養(yǎng)微生物就會同化水體無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為自身蛋白[8]，同時生物絮團(tuán)作為食物被水生動物攝食，并能夠凈化養(yǎng)殖水體[9]?？傮w來說，該技術(shù)通過3個方面使對蝦養(yǎng)殖受益：增加產(chǎn)量、降低飼料成本和減少水體中的無機(jī)氮[13]。從圖1可以看出，構(gòu)建的生物絮團(tuán)系統(tǒng)前期氨氮濃度不高，從第17天開始水體中氨氮濃度急劇上升，最高達(dá)到（8.53±0.60）mg/L，這可能由于投喂餌料和凡納濱對蝦排泄物增加造成有機(jī)氮過剩，生物絮團(tuán)量還不足有關(guān)。通過補(bǔ)充碳源，維持水體中C/N為15，正常投喂下，在第28天氨氮開始下降，試驗后期，也就是在第67天，即使投餌量不斷增加，氨氮能一直維持在較低的穩(wěn)定值。從圖2可知，亞硝酸鹽濃度在試驗的第26天開始急劇上升，在第64天開始下降，能一直維持在較低值，0.5 mg/L以下。從表3可以得出，水體中硝酸鹽濃度在第26天開始逐步上升，后期穩(wěn)定在 3.70±0.27～11.11±0.39mg/L之間。水體中氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽這種承接的變化，可以看出該試驗生物絮團(tuán)系統(tǒng)除了有異養(yǎng)細(xì)菌的同化氨氮，亞硝酸氮外，還存在硝化-反硝化作用，并且對有機(jī)氮的轉(zhuǎn)化起著很大的影響[14]。該試驗在室外養(yǎng)殖池構(gòu)建生物絮團(tuán)可以對室外高位池和土塘帶來更加安全的養(yǎng)殖模式。

3.2 室外生物絮團(tuán)養(yǎng)殖模式對水質(zhì)微生物菌群的影響

生物絮團(tuán)能為水體中的微生物提供安全的環(huán)境，以此躲避高級原生動物捕食，同時絮團(tuán)結(jié)構(gòu)能有效提高微生物汲取營養(yǎng)的效率，因而大部分的海水微生物可以聚集到生物絮團(tuán)中[15]。從該試驗結(jié)果中可以得知，菌群豐度指數(shù)中ACE為1 180.75±133.94、Chao1為1 195.12±124.93，菌群多樣性的結(jié)果為Shannon 為 6.16±0.02，Simpson 為 0.96±0.01，與于任利華等的報道相似[16]。夏耘等[17]在對草魚養(yǎng)殖中形成的生物絮團(tuán)的研究中發(fā)現(xiàn)，生物絮團(tuán)菌群多樣性隨著養(yǎng)殖的時間變化而變化，之后趨于穩(wěn)定的特征。變形菌是細(xì)菌中最大的門類，廣泛分布于海洋、江河、海底沉積物中，是凡納濱對蝦養(yǎng)殖中常見優(yōu)勢種類[18]。在該試驗驗中，變形菌門所占的比例也是最大的，其所占的比例為62.43%，這與于任利、夏耘等研究的結(jié)果相似[16-17]。在科的分類水平上，紅桿菌科所占的比例最高為22.01%+2.25%，其屬于α-變形菌綱（Alphaproteobacteria），這與任利華等研究的黃桿菌綱、α-變形菌綱和芽孢桿菌綱是刺參苗種培育池中生物絮團(tuán)的主要優(yōu)勢菌群的結(jié)果相似，Zhao等（2012）利用bioflocs技術(shù)分析生物絮團(tuán)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)得出α-變形菌亞綱細(xì)菌是優(yōu)勢菌群[19]。異養(yǎng)細(xì)菌是生物絮團(tuán)轉(zhuǎn)換養(yǎng)殖水體中三氮的主要力量。該試驗中變形菌綱占主要地位，這與過往研究污水處理的結(jié)果基本一致[20-22]，其主要的功能是處理污水中的有機(jī)物，由此說明生物絮團(tuán)在養(yǎng)殖水體中起到了調(diào)節(jié)水質(zhì)的作用。該試驗在室外凡納濱對蝦養(yǎng)殖池中所構(gòu)建的生物絮團(tuán)，從三氮的轉(zhuǎn)換能力和水體中的微生物菌群結(jié)構(gòu)都與一些室內(nèi)的構(gòu)建結(jié)果相似，此結(jié)果可以為室外高位池和土塘養(yǎng)殖帶來指導(dǎo)的作用。