非洲豬瘟診斷方法研究綜述

田志革，于 瑞，廖曉夏，李 曉，李映春，殷忠偉，胡曉亮

（1.宜賓學(xué)院農(nóng)林與食品工程學(xué)部，四川宜賓；2.宜賓學(xué)院動物多樣性與生態(tài)保育宜賓市重點實驗室，四川宜賓644000）

非洲豬瘟（African Swine Fever, ASF）是一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，死亡率可高達(dá)100%；其病原為非洲豬瘟病毒（ASFV），可自然感染家豬和野豬，軟蜱是其貯藏宿主和媒介[1].該病發(fā)病過程短，以發(fā)熱及淋巴結(jié)、腎、胃腸粘膜明顯出血為主要特征.1900 年，非洲東部地區(qū)爆發(fā)非洲豬瘟，1921 年肯尼亞首次報道了非洲豬瘟病毒能夠引起家豬出現(xiàn)發(fā)熱、出血等癥狀，且死亡率達(dá)100%，隨后疫情蔓延至非洲大部分地區(qū)；并于1957 年傳入葡萄牙[2]，于1990 年在西班牙流行，隨后迅速蔓延至整個歐洲.2007 年在俄羅斯爆發(fā)[3]后向周邊國家不斷蔓延，2018 年8 月3-15 日，在遼寧沈陽、河南鄭州、江蘇連云港3個相隔很遠(yuǎn)的地區(qū)，接連發(fā)現(xiàn)3起非洲豬瘟疫情；截至2019 年11 月21 日，我國共報告發(fā)生160 起非洲豬瘟疫情.非洲豬瘟病毒已在我國形成比較大的污染面，預(yù)計后期仍將呈點狀發(fā)生[4].該病的流行嚴(yán)重威脅食品安全及養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，造成巨大的經(jīng)濟損失，是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）法定報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[5].

1 病原

ASFV屬DNA病毒目非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，也是目前已知唯一的蟲媒DNA病毒；病毒粒子具有雙層囊膜二十面體對稱結(jié)構(gòu)，大小為（175 ～215）nm.基因組為線性雙鏈DNA 分子，有一個血清型，22個基因型.

該病毒耐干燥或酸性環(huán)境，但對熱環(huán)境敏感，在（60 ～70）℃條件下加熱10 min 可使其滅活，對乙醚、氯仿等敏感，易被脂溶劑、消毒劑、胰酶等滅活[6].

依據(jù)毒力不同，可將ASFV 分為高致毒性、中等毒力、低毒力、感染無臨床癥狀毒株等[7].該病毒主要通過消化道和呼吸道侵入機體，通過巨胞飲及網(wǎng)格蛋白介質(zhì)的胞吞作用感染宿主單核巨噬細(xì)胞并進行復(fù)制，后期可擴散至全身其他細(xì)胞，導(dǎo)致豬免疫系統(tǒng)受損，隨后進入血液，引起器官出血等[8].

2 流行病學(xué)

豬是該病的主要宿主，任何年齡、品種的豬感染概率都很高，尤其是家豬和野豬，目前還沒有證實該病毒可以向人類傳播.如果將健康豬和患病豬放在一起，或者在泔水、飼料、墊料等傳播媒介的影響下，都極易傳播非洲豬瘟[9]，此外，被污染的器具、車輛、衣物等均是該病的傳染源；交配、舔咬等直接接觸也可傳播病毒.

3 癥狀

非洲豬瘟的潛伏期為（5 ～19）d[10]，根據(jù)引起癥狀的不同分為最急性型、急性型、亞急性型、慢性型.

（1）最急性型：無臨床癥狀，病豬突然死亡，死亡率可高達(dá)100%.

（2）急性型：體溫升高至42 ℃，病豬表現(xiàn)出明顯的倦怠狀態(tài)，進食量下降，在眼鼻周圍有大量的黏性分泌物流出，出現(xiàn)嘔吐、便秘等臨床癥狀，在糞便中存在大量血液和黏液[11]，呼吸困難，妊娠期的母豬會流產(chǎn).

（3）亞急性型：臨床癥狀與急性型相似，病情較輕，但病情時間更長，為（5 ～30）d，死亡率為30% ～70%，有出血癥狀，體溫一般不低于40.5 ℃.

（4）慢性型：咳嗽及呼吸困難，并且伴有消瘦、發(fā)育緩慢、毛發(fā)顏色淺等不良癥狀.病豬關(guān)節(jié)腫脹，局部皮膚出現(xiàn)壞死或潰瘍死亡率較低，但會受病毒的持續(xù)感染，康復(fù)豬是該病毒攜帶者.

4 病理變化

病豬剖檢的特點是腎皮質(zhì)顏色變淡，有點狀出血；脾臟腫大，大概為正常的5 ～10 倍，呈暗紅色或黑色，質(zhì)地較脆，梗死明顯；下頜淋巴結(jié)以及腸系膜有明顯的出血，切面呈大理石狀；肺臟變硬，有明顯的出血；胃漿膜膜面出現(xiàn)彌漫性出血，膀胱黏膜出血，回腸結(jié)腸處有“扣狀腫”.

5 診斷方法

ASF 的實驗室檢測方法分為病原檢測和血清抗體檢測方法.應(yīng)用范圍較廣、技術(shù)發(fā)展迅速的方法主要有分子生物學(xué)方法及血清學(xué)檢測方法.

5.1 分子生物學(xué)檢測方法

（1）PCR.目前實驗室最常用的檢測方法即為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction,PCR）.根據(jù)其基因組高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物進行常規(guī)PCR 擴增，因其具有良好的敏感性和特異性而成為最早期的快速診斷病毒感染方法；熒光定量PCR 方法較常規(guī)PCR 方法具有更高的特異性和敏感性，根據(jù)ASFV 的保守基因（如VP72、VP73、P54、K205R 基因）設(shè)計引物和探針建立TaqMan 實時熒光定量PCR，能特異性鑒別ASFV，或建立雙重?zé)晒舛縋CR 方法，可同時用于鑒別非洲豬瘟和豬瘟病毒[12-13]；巢式PCR 法是變異的PCR 方法，該方法需要2 對PCR 引物；第一對引物擴增片段和普通PCR 相似，第二對引物結(jié)合在第一次PCR 產(chǎn)物內(nèi)部，因此該方法比單次PCR 具有更好的特異性和敏感性，可用于檢測蜱中ASFV的感染[14].

（2）重組酶聚合酶擴增-RPA.RPA 是新型核酸檢測技術(shù)，其具有很好的靈敏度和特異性，反應(yīng)時間短，在臨床鑒別診斷、檢驗檢疫、病原監(jiān)測等方面具有巨大的開發(fā)前景.王建昌等[15]基于ASFV VP72基因保守序列建立了ASFV RPA 等溫檢測方法，在38 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min 即可對目的片段進行有效擴增；李林等[16]建立的實時熒光RPA 法，只需要20 min 就可完成檢測，最低可檢測到16 拷貝/反應(yīng).但該檢測方法需要專門的試劑盒，成本較高.

（3）線性指數(shù)PCR 技術(shù).線性指數(shù)PCR 是一種不對稱的PCR，其基本原理是采用不等量的一對引物產(chǎn)生大量的單鏈DNA，主要用于核酸序列測定.Ronish 等[17]根據(jù)ASFV VP72 基因建立了線性指數(shù)PCR 方法，病毒DNA 檢出限可達(dá)約1 拷貝，敏感性高.

（4）微滴數(shù)字PCR 技術(shù)（ddPCR）.ddPCR 是新興的一種絕對定量的擴增技術(shù)，擴增前對樣品進行微滴化處理，每個微滴不含或含有一個至數(shù)個待檢核酸靶分子，通過PCR 擴增，對微滴逐個檢測；該方法不依賴標(biāo)準(zhǔn)樣品，不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可實現(xiàn)絕對定量，靈敏度高，已被應(yīng)用于HIV等多種病毒的檢測中[18-20].鄔旭龍等[21]基于ASFV K205R 基因保守區(qū)設(shè)計特異引物建立了ASFV 的ddPCR 檢測方法，結(jié)果表明該方法具有靈敏度更高、特異性更強，重復(fù)性好等優(yōu)點，應(yīng)用前景較好.

（5）環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)（LAMP）.LAMP 技術(shù)是在恒溫下進行的核酸擴增方法，其特征是對目標(biāo)DNA 鏈上的6 個區(qū)段設(shè)計4 個不同的引物，然后利用鏈置換型DNA 合成酶在（60 ～65）℃溫度下進行反應(yīng)，經(jīng)過一個步驟即可完成，操作方法簡單，擴增效率極高，對儀器設(shè)備沒有特殊要求，適合基層診斷使用.江彥增[22]利用ASFV 的P72基因C 端保守序列設(shè)計篩選4 套LAMP 引物，建立了LAMP 檢測技術(shù)，靈敏度高，可靠性好，與其它病原沒有交叉反應(yīng).

（6）原位雜交技術(shù)（In Situ Hybridization, ISH）.ISH 是分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細(xì)胞學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興技術(shù)，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸（即探針）與組織、細(xì)胞或染色體上待測DNA 或RNA 互補配對，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來.Oura 等[23]建立了針對AS?FV vp73 基因的原位雜交技術(shù)，用于檢測ASFV 在感染豬不同組織中的分布.該方法操作繁瑣，對操作人員要求高，不適合于ASFV 的快速檢測，更多應(yīng)用于ASFV致病機理等的研究.

（7）探針雜交技術(shù).張鑫宇等[24]基于ASFV p72基因保守序列建立了檢測ASFV 的納米金探針雜交方法.檢測核酸濃度達(dá)到10 fmol/L，特異性及靈敏性高，且在酶標(biāo)板中可批量反應(yīng)，開辟了ASFV 檢測新途徑.但是該方法需要合成特異性探針并進行標(biāo)記，對操作技術(shù)要求較高.

5.2 血清學(xué)檢測方法

5.2.1 抗體檢測方法

（1）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）.ELISA 方法的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記.此方法方便快速，敏感特異，可使用自動化設(shè)備檢測大量樣本，是目前使用最廣泛的血清學(xué)檢測技術(shù)，是OIE指定的ASFV首選的血清學(xué)診斷方法；常用的抗原蛋白有P72、P73、P30、P32、P54 等，曹琛福[25]利用pET-52b(+)原核表達(dá)系統(tǒng)成功將非洲豬瘟病毒特異性P54 蛋白實現(xiàn)可溶性表達(dá)，基于VP54 蛋白建立競爭ELISA 法，其結(jié)果特異性達(dá)到100%，特意性強，靈敏度高達(dá)96.22%.

（2）膠體金免疫層析技術(shù)-GICA.膠體金免疫層析技術(shù)以膠體金為顯色媒介，利用免疫學(xué)中抗原抗體能夠特異性結(jié)合的原理，在層析過程中完成反應(yīng)從而達(dá)到檢測的目的.該方法在10 min 內(nèi)可得到檢測結(jié)果，無需特殊設(shè)備，靈敏度和準(zhǔn)確性高.張鑫宇等[26]通過原核表達(dá)及純化獲得ASFV 的p54 重組蛋白，建立了p54 抗體的膠體金檢測方法，特異性強，敏感性高，陽性符合率較OIE 推薦的ELISA 方法高.吳海濤[27]根據(jù)雙抗體夾心原理，制備了針對VP72 蛋白的多抗和單抗，建立了ASFV 膠體金免疫層析試紙條檢測方法，特異性較好；Giménez?Lirola等[28]利用ASFV 的p30 蛋白抗體建立了雙基質(zhì)間接ELISA 方法，用于檢測豬口腔液和血清中的ASFV 抗體.此法檢測速度快、特異性強、靈敏度高、操作簡單、成本低，適用于現(xiàn)場檢測.

5.2.2 抗原檢測

（1）熒光抗體試驗（FAT）.FAT 方法利用熒光標(biāo)記單抗用于分離病毒和組織的檢測，是OIE 推薦用于ASFV 抗原鑒定的方法，可以用于鑒定不產(chǎn)生紅細(xì)胞吸附試驗反應(yīng)的ASFV 毒株.FAT 使用異硫氰酸熒光素結(jié)合的特異性抗體檢測豬組織細(xì)胞內(nèi)ASFV抗原，但必須通過顯微鏡觀察感染臟器涂片或薄層冷凍片上的病毒抗原實現(xiàn)，且對亞急性和慢性病例的檢出率較低[29].

（2）雙抗夾心ELISA.雙抗夾心ELISA 是基于ELISA 方法建立的檢測方法.此方法是在特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，然后加入待檢測抗原，再加入酶標(biāo)抗體，最后結(jié)合底物顯色，根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析.Vidal等[30]建立針對ASFV VP73 蛋白的雙抗夾心ELISA 方法，對VP73 蛋白的檢出限為0.05 μg/mL，對 全 病 毒 粒 子 的 檢 出 限 為2.3×102PFU/mL.

（3）側(cè)向流動免疫色譜分析-LFA.LFA 是利用生物學(xué)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)相互特異性附著的性質(zhì)，快速定性或定量分析的檢測方法.Gao 等[31]建立了交叉引物擴增結(jié)合免疫層析條快速檢測ASFV 的方法，檢測限可低至200拷貝.

6 展望

自2018 年我國首例非洲豬瘟發(fā)生以來，非洲豬瘟疫情在我國迅速蔓延，對養(yǎng)豬業(yè)及人們?nèi)粘Ｉ钤斐芍卮笥绊?目前，尚無有效的市場化的非洲豬瘟疫苗，因此，只有早發(fā)現(xiàn)、早確診，對病豬進行無害化處理才能有效控制該病的蔓延與傳播.各地應(yīng)根據(jù)現(xiàn)有條件，選擇合適的檢測方法加強自檢，另外，科研單位將需加大診斷方法研發(fā)力度，不斷開發(fā)高通量、耗時短、易操作、設(shè)備簡單的適應(yīng)現(xiàn)地及基層診斷需要的診斷方法.