外源NO對低溫脅迫下龍眼幼苗生理特性的影響

摘 要 研究外源一氧化氮（NO）對5 ℃低溫脅迫下龍眼幼苗生理特性的影響。結(jié)果表明：低溫脅迫下，龍眼幼苗葉片中的SOD、POD和CAT活性降低，葉綠素、可溶性糖和蛋白質(zhì)含量下降，丙二醛含量升高。噴施硝普鈉（SNP、NO供體）顯著提高龍眼幼苗的葉綠素、可溶性糖和蛋白質(zhì)含量，提高凈光合速率，增強(qiáng)SOD、POD和CAT活性，降低丙二醛含量和電解質(zhì)滲透率；其中150 μmol/L SNP處理效果最好?？梢?，外源NO通過刺激抗氧化酶活性來清除活性氧，減輕膜脂過氧化作用，緩解低溫脅迫對龍眼幼苗的傷害作用，提高龍眼的抗低溫脅迫能力。

關(guān)鍵詞 一氧化氮；硝普鈉；低溫脅迫；龍眼；生理特性

中圖分類號 S667.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Effects of Exogenous Nitric Oxide on Physiological Characteristics in Longan Seedling under Low Temperature Stress

GAO Junjie

Planting Station， Quanzhou Municipal Bureau of Agriculture， Quanzhou， Fujian 362000， China

Abstract The effects of sodium nitropprusside（SNP）as an exogenous nitric oxide donor at different concentrations on the physiological reaction of longan seedlings under low temperature（5 ℃）stress were studied. Under the stress of low temperature， superoxide dismutase（SOD）， peroxidase（POD）， and catalase（CAT）activities as well as the total chlorophyll， soluble protein， and soluble sugar contents of the leaf decreased obviously， and the leaf malondialdedyde content had a remarkable increase. The SOD， POD， and CAT activities and the total chlorophyll， soluble protein， and soluble sugar contents were improved significantly after applying SNP， the malondialdedyde content was reduced. The best abating effect occurred with the SNP concentration 150 μmol/L. It was suggested that exogenous nitric oxides could alleviate the toxic effect of low temperature stress on longan seedlings via activating the seedlings leaf antioxidant enzyme activities and reducing oxidative stress，

Key words Nitric oxide（NO）； sodium nitroprusside（SNP）； low temperature stress； Dimocarpus longana cv. Fuyan； physiological effects

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.09.009

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是典型的亞熱帶常綠果樹，主要分布在廣東、廣西、福建、海南等?。▍^(qū)）；福建省為“中國龍眼之鄉(xiāng)”，種植面積已超過6萬hm2，占全國龍眼種植總面積的26%[1]。龍眼喜溫忌凍，耐寒性差；幼果發(fā)育期和反季節(jié)栽培的開花期，遇到低溫天氣，果實(shí)生長發(fā)育會出現(xiàn)生理障礙，嚴(yán)重時(shí)引發(fā)大量落果[2]。福建地處東南沿海，寒潮天氣和周期性凍害偶有發(fā)生，這將給龍眼生產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。因此，研究龍眼低溫脅迫的緩解措施為促進(jìn)龍眼產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展有重要意義。

一氧化氮（Nitric oxide，NO）作為一種新的植物生長調(diào)節(jié)信號分子，參與植物逆境響應(yīng)和抗病防御反應(yīng)等過程。NO作為防御響應(yīng)中的關(guān)鍵信使，在緩解高溫脅迫[3]、低溫脅迫[4]、酸雨脅迫[5-6]、干旱脅迫[7]和重金屬脅迫[8]等非生物脅迫起到重要作用。NO作為信號分子在植物抗逆性中的作用越來越受到重視。目前，龍眼耐寒性的研究主要集中在葉片組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)特性、成花誘導(dǎo)、生理生化特性和基因表達(dá)[9-11]影響等方面，有關(guān)龍眼低溫脅迫下的緩解作用尚未見報(bào)道。本文開展低溫脅迫下外源NO緩解龍眼葉片生理特性的變化研究，為龍眼抗寒性和耐寒機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的龍眼品種為主栽中熟品種‘福眼（Dimocarpus longana‘Fuyan），果實(shí)由泉州市帝福生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供。2015年8月進(jìn)行種子濕沙催芽，待種子萌芽長出1片真葉后種植于塑料盆中，種植盆規(guī)格為直徑26 cm×高28 cm的圓形塑料盆，基質(zhì)為蛭石與營養(yǎng)土質(zhì)量比為2︰1，每盆種植5株龍眼幼苗。龍眼在自然條件下培養(yǎng)至長出5片真葉（株高35～40 cm×莖粗3.5～4.0 cm）進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)期間按常規(guī)進(jìn)行水肥管理。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 2016年5月選擇長勢基本一致的健康龍眼幼苗進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。低溫處理前葉片噴施硝普鈉（Sodium nitropprusside ， SNP）溶液，濃度分別為0、50、100、150、200 μmol/L，共設(shè)5個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每盆為1個(gè)重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)；每隔 24 h 噴施1次，共噴施3次，每次噴至所有葉片滴液為止。SNP處理后置于人工氣候箱進(jìn)行晝夜低溫（5 ℃/5 ℃，12 h）培養(yǎng)，以噴施蒸餾水且正常溫度（25 ℃/18 ℃，12 h）培養(yǎng)為對照組（CK）。第3次SNP處理后培養(yǎng)3 d，采集植株上部倒數(shù)第2片功能葉放入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80 ℃冰箱中用于各項(xiàng)生理指標(biāo)的測定。

1.2.2 測定項(xiàng)目與方法 丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸反應(yīng)法[12]；電導(dǎo)測定儀測定相對電導(dǎo)率[12]。超氧化物歧化酶活性測定采用氧化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）法[13]，以單位時(shí)間內(nèi)抑制NBT光還原50%為一個(gè)酶活性單位（U）；愈創(chuàng)木酚比色法測定過氧化物酶活性[13]，以每分鐘A470變化值表示酶活性大小；過氧化氫酶活性測定采用比色法[12]，以每分鐘A240的變化值表示酶活力大小?？扇苄蕴呛繙y定采用蒽酮比色法[12]，蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法[12]；葉綠素含量和類胡蘿卜素含量采用乙醇浸提法測定[12]。葉片凈光合速率采用CI-340便攜式光合儀進(jìn)行測定[14]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan法進(jìn)行多重比較及差異顯著性分析（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源NO對低溫脅迫下龍眼苗期丙二醛含量和相對電導(dǎo)率的影響

低溫脅迫下龍眼葉片噴施SNP后丙二醛（MDA）含量和相對電導(dǎo)率發(fā)生變化（圖1）。由圖1可見，低溫脅迫下（0 μmol/L SNP）丙二醛含量均顯著高于對照，比對照增加143.5%，表明低溫對龍眼產(chǎn)生傷害。低溫脅迫下噴施SNP顯著降低丙二醛含量，隨著SNP濃度的增加，丙二醛含量逐漸降低；200 μmol/L SNP處理后MDA含量降至最低，比低溫脅迫（0 μmol/L SNP）降低了40.9%，仍顯著高于對照處理CK。因此，噴施SNP可以顯著降低低溫脅迫下龍眼丙二醛含量，減輕膜脂過氧化程度。

低溫脅迫下細(xì)胞的質(zhì)膜系統(tǒng)受到傷害，表現(xiàn)為電解質(zhì)滲漏和相對電導(dǎo)率的增加。由圖1可知，低溫脅迫下龍眼的相對電導(dǎo)率均顯著高于對照，噴施SNP降低相對電導(dǎo)率；相對電導(dǎo)率隨著SNP濃度的增加表現(xiàn)為先下降后上升的變化。150 μmol/L SNP處理后相對電導(dǎo)率含量降為最低，比低溫脅迫降低41.3%；高于對照處理54.0%。可見，低溫脅迫條件下SNP可緩解細(xì)胞質(zhì)膜的損傷，保護(hù)細(xì)胞的質(zhì)膜透性和完整性，提高龍眼葉片的抗逆性。

2.2 外源NO對低溫脅迫下龍眼苗期抗氧化酶活性的影響

由圖2可知，低溫脅迫（0 μmol/L SNP）顯著降低龍眼葉片的SOD、POD和CAT 3種酶活性。低溫脅迫下噴施SNP顯著提高龍眼葉片的SOD、POD和CAT活性，隨著SNP濃度的增加酶活性出現(xiàn)先增加后降低的變化；150 μmol/L SNP處理后，SOD、POD和CAT活性均達(dá)到最大值，比低溫脅迫（0 μmol/L SNP）分別提高136.2%、116.4%和180.8%，但SOD和CAT活性與對照處理差異不顯著；200 μmol/L SNP處理后，SOD、POD和CAT活性均出現(xiàn)降低，仍高于對照處理?？梢姡瑖娛㏒NP顯著提高低溫脅迫下SOD、POD和CAT活性，150 μmol/L SNP有利于提高低溫脅迫下龍眼葉片抗氧化酶活性，增強(qiáng)清除活性氧的能力。

2.3 外源NO對低溫脅迫下龍眼苗期光合色素含量的影響

低溫脅迫顯著降低龍眼葉片的總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量（圖3），分別比對照處理降低66.9%和58.0%；噴施SNP顯著提高低溫脅迫下龍眼的總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量。由圖3可知，低溫脅迫下總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量隨著噴施SNP濃度的升高而表現(xiàn)出先逐漸增加后降低的變化，150 μmol/L SNP處理后總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量均達(dá)到最大值，分別比低溫脅迫（0 μmol/L SNP）處理提高170.5%和112.6%；200 μmol/L SNP處理后其含量反而出現(xiàn)降低，但顯著高于低溫處理（0 μmol/L SNP）。這表明SNP處理可以緩解低溫對葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞，提高龍眼對低溫脅迫的抵抗能力。

2.4 外源NO對低溫脅迫下龍眼苗期葉片凈光合速率的影響

低溫脅迫顯著降低龍眼葉片凈光合速率，噴施SNP緩解低溫脅迫的傷害（圖4）。從圖4可見，低溫脅迫下凈光合速率比對照處理降低53.3%，低溫脅迫下噴施SNP后凈光合速率隨著SNP濃度的增加而呈現(xiàn)出先提高后降低，但顯著高于低溫脅迫（0 μmol/L SNP）。SNP濃度為150 μmol/L時(shí)葉片的凈光合速率達(dá)到最大值，比低溫脅迫（0 μmol/L SNP）提高86.7%；200 μmol/L SNP處理后，其含量反而出現(xiàn)降低，但顯著高于低溫處理（0 μmol/L SNP）?？梢?，噴施150 μmol/L SNP有利于提高低溫脅迫下龍眼的光合能力。

2.5 外源NO對低溫脅迫下龍眼苗期可溶性糖和蛋白質(zhì)含量的影響

低溫脅迫顯著降低龍眼葉片可溶性糖和蛋白質(zhì)含量，噴施SNP顯著延緩龍眼葉片可溶性糖和蛋白質(zhì)含量的下降（圖5）。從圖5可以看出，低溫脅迫下可溶性糖和蛋白質(zhì)含量分別比對照處理降低49.5%和48.3%；隨著SNP濃度的增加，龍眼葉片的可溶性糖和蛋白質(zhì)含量均表現(xiàn)為先升高而后降低的變化。SNP濃度為150 μmol/L時(shí)其含量均達(dá)到最大值，分別比對照提高88.0%和84.2%；200 μmol/L SNP處理后可溶性糖和蛋白質(zhì)含量均下降，但顯著高于低溫處理（0 μmol/L SNP）。因此，噴施150 μmol/L SNP有利于提高低溫脅迫下龍眼光合產(chǎn)物的合成，從而提高龍眼的抗寒性。

3 討論

抗氧化酶活性與植物活性氧代謝直接相關(guān)，SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)的重要活性氧清除系統(tǒng)，其活性水平代表植物體清除活性氧自由基的能力，反映植物抗逆境能力的高低。NO 作為信號調(diào)節(jié)分子和活性氧清除劑能調(diào)節(jié)植物對非生物脅迫的適應(yīng)反應(yīng)，顯著提高葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量，并可有效提高SOD、POD和CAT等保護(hù)酶的活性，增強(qiáng)抗逆能力[15]。樊懷福等[16]研究表明，SNP處理顯著降低黃瓜幼苗葉片細(xì)胞膜的離子滲漏和MDA含量，緩和膜相變化，緩解膜透性的增大，可防止離子滲漏；可溶性蛋白是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和保護(hù)物質(zhì)。已有研究表明，外源NO可以增加脅迫下棉花[17]、香蕉[18]和苦瓜[19]幼苗葉片的可溶性蛋白含量。姜義寶等[20]發(fā)現(xiàn)0.1 mmol/L SNP減緩干旱脅迫下苜蓿幼苗細(xì)胞膜透性的增加，使CAT先升后降，SOD和POD活性持續(xù)升高；SNP處理黑麥草，可提高黑麥草SOD、POD和CAT等保護(hù)酶活性[21]。本研究表明，龍眼噴施低濃度SNP溶液，提高葉片中可溶性糖和蛋白質(zhì)含量，SOD、POD和CAT 3種酶活性均得到不同程度的提高?？扇苄蕴呛涂扇苄缘鞍鬃鳛闈B透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可提高低溫脅迫下細(xì)胞液濃度，增加細(xì)胞保水能力，維持植株滲透勢、抗脫水，從而提高植物的抗冷性[19]；同時(shí)，NO能提高低溫脅迫下龍眼的抗氧化酶活性，有利于清除低溫脅迫誘導(dǎo)生產(chǎn)的活性氧，以及抑制脂氧合酶活力，降低超氧陰離子的產(chǎn)生速度和質(zhì)膜相對透性從而降低丙二醛（MDA）的積累，外源NO對細(xì)胞膜具有良好的修復(fù)和保護(hù)作用，減緩膜脂過氧化程度，從而提高龍眼的抗性。外源NO對植物的作用具有雙重性。高濃度對生物體有毒害作用，低濃度緩解脅迫效應(yīng)[22]。這與NO緩解其他非生物脅迫的作用機(jī)制相似[23-25]。高濃度SNP處理降低龍眼低溫脅迫的緩解作用，可能是高濃度NO與O2-相互作用生成大量的過氧亞硝酸根陰離子，后者經(jīng)質(zhì)子化后形成具有強(qiáng)氧化性的過氧亞硝酸，破壞生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能，表現(xiàn)出其生物毒性。

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的細(xì)胞器，溫度是影響葉綠體發(fā)育的重要因素；葉綠體對低溫弱光反應(yīng)最敏感。低溫脅迫下植物葉片光合活性的顯著下降與葉綠體超微結(jié)構(gòu)有關(guān)。低溫脅迫顯著降低葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量，可能是低溫降低生物合成過程酶活性，引起葉綠素合成系統(tǒng)受阻，以及低溫脅迫下葉綠素受到破壞[1-2]。已有研究表明，外源NO能提高低溫脅迫下玉米[22]、棉花[17]、黃瓜[16]、苦瓜[19]葉片的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量。本研究表明，外源NO提高低溫脅迫下龍眼葉綠素和類胡蘿卜素含量，這可能是NO激活龍眼葉綠素生物合成過程中的某些酶類[26]；而且NO具有強(qiáng)氧化性的活性氮，能夠促進(jìn)低溫脅迫下植物類囊體膜蛋白復(fù)合體的組裝和穩(wěn)定，增強(qiáng)葉綠體對光能的吸收和利用能力，緩解低溫脅迫導(dǎo)致的葉綠體破壞，提高龍眼幼苗抗冷害能力[19]。同時(shí)，低溫脅迫下龍眼幼苗的凈光合速率明顯下降，光合產(chǎn)物可溶性糖含量也顯著降低[27]；150 μmol/L SNP顯著提高低溫脅迫下龍眼幼苗的凈光合速率，說明外源NO顯著緩解低溫脅迫造成的葉肉細(xì)胞光合活性的下降；從而緩解同化物可溶性糖和蛋白質(zhì)含量的下降[17]。

綜上所述，外源NO能顯著緩解低溫脅迫對龍眼幼苗生長造成的抑制作用，提高抗氧化酶活性，降低幼苗葉片的膜脂過氧化作用，減少低溫對膜造成的傷害，提高龍眼苗期抗低溫脅迫能力。NO作為一種信號分子參與植物體內(nèi)非常復(fù)雜的生理過程，其緩解低溫脅迫的機(jī)理尚需要進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉建福， 鐘書淳， 王奇志， 等. 龍眼葉片對低溫脅迫的生理響應(yīng)研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014，36（4）：737-742.

[2] 鄭重祿. 龍眼低溫脅迫及其抗寒性生理[J]. 中國南方果樹， 2012， 41（3）： 64-71.

[3] 李 秀， 鞏 彪， 徐 坤. 外源NO對高溫脅迫下姜葉片活性氧代謝的影響[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2014， 41（2）： 277-284.

[4] 相 昆， 徐 穎， 李國田， 等. 外源NO對低溫脅迫下核桃幼苗活性氧代謝的影響[J]. 林業(yè)科學(xué)， 2016， 52（1）： 143-149.

[5] 劉建福， 鐘書淳， 王奇志， 等. NO供體SNP對酸雨脅迫下龍眼種子萌發(fā)及生理特性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2013， 29（5）： 1 143-1 148.

[6] 高俊杰. 多效唑?qū)λ嵊昝{迫下龍眼幼苗生理特性的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016， 44（2）：4 8-50， 53.

[7] 邵瑞鑫， 李蕾蕾， 鄭會芳， 等. 外源一氧化氮對干旱脅迫下玉米幼苗光合作用的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016， 49（2）： 251-259.

[8] 夏海威， 施國新， 黃 敏， 等. 一氧化氮對植物重金屬脅迫抗性影響的研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)， 2015， 35（10）： 3 139-3 147.

[9] 張惠斌， 劉星輝. 龍眼葉片組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)特性與耐寒性關(guān)系[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 1993， 20（1）： 1-7.

[10] 姜建初， 裴鐵雄， 王靜靜， 等. 低溫冷害對龍眼成花的影響及抹除荔枝和芒果冷害花穗促進(jìn)腋芽再生花穗的效果[J]. 廣西植物， 2010， 30（2）： 220-223.

[11] 陳 虎， 何新華， 羅 聰， 等. 低溫脅迫下龍眼碳酸酐酶基因（CA）的克隆與表達(dá)分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2012， 39（2）： 243-252.

[12] 鄒 琦. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2000.

[13] 王學(xué)奎. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 北京： 高等教育出版社， 2006.

[14] 劉建福， 鐘書淳， 黃安民， 等. 武夷巖茶光合特性及品質(zhì)成分比較[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2014， 35（6）： 1 148-1 152.

[15] 郭經(jīng)緯， 商 桑， 穆大偉， 等. 外源NO對低溫脅迫下豇豆幼苗生長和生理特性的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2015， 36（12）： 2 179 -2 183.

[16] 樊懷福， 杜長霞， 朱祝軍. 外源NO對低溫脅迫下黃瓜幼苗生長、葉片膜脂過氧化和光合作用的影響[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2011， 23（3）： 538-542.

[17] 楊美森， 王雅芳， 干秀霞， 等. 外源一氧化氮對冷害脅迫下棉花幼苗生長、抗氧化系統(tǒng)和光合特性的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 45（15）： 3 058-3 067.

[18] 湯紅玲， 李 江， 陳惠萍. 外源一氧化氮對香蕉幼苗抗冷性的影響[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2010， 30（10）： 2 028-2 033.

[19] 杜卓濤， 商 桑， 朱白婢， 等. 外源NO對低溫脅迫下苦瓜幼苗生長和幾個(gè)生理指標(biāo)的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2016， 37（3）： 482-487.

[20] 姜義寶， 楊玉榮， 鄭秋紅. 外源一氧化氮對干旱脅迫下苜蓿幼苗抗氧化酶活性和葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊慬J]. 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究， 2008， 26（2）： 65-68.

[21] 張遠(yuǎn)兵， 劉愛榮， 方 蓉. 外源一氧化氮對鎘脅迫下黑麥草生長和抗氧化酶活性的影響[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)， 2008， 17（4）： 57-64.

[22] 陳銀萍， 王曉梅， 楊宗娟， 等. NO對低溫脅迫下玉米種子萌發(fā)及幼苗生理特性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 31（2）：270-277.

[23] Bailly C， Benamar A， Corbineau F， et al. Changes in malondialdehyde content and in superoxide dismutase， catalase and glutathione reductase activities in sunflower seeds as related to deterioration during accelerated aging[J]. Physiologia Plantarum， 2012， 97（1）： 104-110.

[24] 吳錦程， 陳偉建， 蔡麗琴， 等. 外源NO對低溫脅迫下批把幼果抗氧化能力的影響[J]. 林業(yè)科學(xué)， 2010， 46（9）： 73-78.

[25] Li X， Gong B， Xu K. Interaction of nitric oxide and ployamines involves antioxidants and physiological strategies against chilling induced oxidative damage in Zingiber officinale Roscoe[J]. Scientia Horticulturae， 2014， 170（7）： 237-248.

[26] 劉建福， 王明元， 楊 晨， 等. 外源NO對酸雨脅迫下龍眼幼苗生理特性的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2013， 24（8）： 2 235-2 240.

[27] Palma F， Carvajal F， Lluch C， et al. Changes in carbohydrate content in zucchini fruit（Cucurbita pepo L.） under low temperature stress[J]. Plant Science， 2014， 217-218： 78-86.