甜瓜實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的篩選

章麗珍　韓曉云　吳菁華　GefuWANG-PRUSKI　張志忠

摘要：【目的】篩選可分別在甜瓜不同組織器官和不同脅迫處理下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，用于對靶基因表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量分析，保證相關(guān)試驗(yàn)的準(zhǔn)確性及可靠性?！痉椒ā恳蕴鸸掀贩N新銀輝為試驗(yàn)材料，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析18s rRNA、TUA、EFla、Actinl、Actin2、Actin3、Actin4、CYC和UBI-ep共9個(gè)候選內(nèi)參基因在甜瓜不同組織器官及不同脅迫處理下的表達(dá)穩(wěn)定性，包括甜瓜根、葉、種子和果實(shí)4種不同組織材料，以及水分脅迫、肉桂酸脅迫、鹽堿脅迫和ABA脅迫4種處理。同時(shí)使用Best-Keeper、Norm Finder和ge Norm軟件對9個(gè)候選內(nèi)參基兇進(jìn)行穩(wěn)定性分析。【結(jié)果】對不同組織器官而言，Best-Keeper評估排名前5的內(nèi)參基因依次為CYC>18srRNA> UBI-ep> EFla> TUA;Norm Finder計(jì)算排名前5的內(nèi)參基兇依次為EFla> UBI-ep>Actin4> CYC>Actin3;geNorm分析排名前5的基因依次為Actin4=Actin3>Actinl>EFla>UBI-ep。不同脅迫處理中，Best-Keeper計(jì)算排名前5的基兇依次為18s rRNA>Actin3>Actin4>EFla>UBI-ep;Norm Finder分析排名前5的基兇依次為EFla>UBI-ep>Actin4>CYC>18s rRNA;ge Norm分析排名前5的基因依次為EFla=UBI-ep>Actin4>CYC>Actinl?？傮w而言EFla在不同組織器官和不同脅迫處理中的綜合排名均較為穩(wěn)定;Actin4、Actin3、Actinl和EFla是不同組織器官中較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合;EFla和UBI-ep是4種脅迫條件下較穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合?！窘Y(jié)論】EFla在甜瓜不同組織器官及不同脅迫條件下均可穩(wěn)定表達(dá)，是較為合適的內(nèi)參基因;同時(shí)可通過設(shè)置雙內(nèi)參基因進(jìn)一步降低試驗(yàn)誤差。

關(guān)鍵詞：甜瓜;內(nèi)參基兇;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;組織器官;脅迫

中圖分類號(hào)：S 652

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-0384（2020）11-1179-09

0 引言

【研究意義】實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（QuantitativeReal-time PCR，RT-qPCR）因其具有簡單、高效、低成本等特點(diǎn)，在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。RT-qPCR檢測結(jié)果依樣品來源和處理?xiàng)l件而異，同時(shí)與樣本品質(zhì)、樣品反轉(zhuǎn)錄效率、加樣模板量等因素也密切相關(guān)，一個(gè)能在不同樣品中相對穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因是對其結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化衡量的關(guān)鍵[1]。甜瓜（Cucumis melo L.）具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是世界各地廣泛栽培和消費(fèi)的重要瓜果作物[2]。目前關(guān)于甜瓜內(nèi)參基因篩選的報(bào)道較少，不同研究選用的內(nèi)參基因不同，導(dǎo)致研究結(jié)果間可比性和重復(fù)性較差，限制了其分子生物學(xué)研究的深入。本研究旨在篩選適用于甜瓜不同組織器官和不同脅迫處理下的有效內(nèi)參基因，為甜瓜RT-qPCR檢測提供可靠理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】內(nèi)參基因的選擇對于RT-qPCR檢測至關(guān)重要，有嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)和分析方法[3-4]。但必須注意的是沒有一個(gè)內(nèi)參基因能在不同物種及不同試驗(yàn)條件下恒定表達(dá)[5]。如18s rRNA是最廣泛應(yīng)用的內(nèi)參基因之一，研究顯示其在野百合[6]（Lilium brownieF.E.）和黃山欒樹[7]（Koelreuteria bipinnata Franch，）等物種中可穩(wěn)定表達(dá);但在洪桐[8]（Davidia involucrataBaill.）和鼠尾草[9]（Salvia hispanica Thunb.）中表達(dá)穩(wěn)定性均較差，不適合作為二者相關(guān)研究中的內(nèi)參基因。在對中國石蒜（Lvcoris chinensis Traub.）的研究中發(fā)現(xiàn)，Ubiquitin5基因可在不同花發(fā)育時(shí)期穩(wěn)定表達(dá)，但在不同組織中表達(dá)穩(wěn)定性較差[10]。對內(nèi)參基因的篩選受到研究者的廣泛重視，如已有關(guān)于牡丹[11]（Paeonia suffruticosa Andr.）、 棉花[12]（Gossypiumhirsutum L.）和刺葡萄[13]（Vitis davidii Fo?x.）等重要植物內(nèi)參基因篩選的報(bào)道，這些報(bào)道將有利于提高相關(guān)試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性[14]。對甜瓜而言，Actin3在總樣品、根、莖葉樣品中具有較好的穩(wěn)定性，但在高低溫脅迫、不同激素脅迫下表達(dá)穩(wěn)定性較差[15]。【本研究切入點(diǎn)】目前甜瓜內(nèi)參基因篩選的報(bào)道較少，前人篩選的甜瓜內(nèi)參基因均是針對不同脅迫或是不同的組織器官分別篩選，鮮少將兩者結(jié)合考慮?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以甜瓜不同組織器官以及水分脅迫、白毒脅迫、鹽堿脅迫和ABA處理等多種脅迫處理樣品為材料，選擇18s rRNA、TUA、EFla、Actin、Actin2、Actin3、Actin4、CYC和UBI-ep等9個(gè)內(nèi)參基因，綜合利用Best-Keeper、NormFinder和ge Norm軟件對相關(guān)基因的穩(wěn)定性進(jìn)行分析，并進(jìn)行驗(yàn)證，以期篩選出在甜瓜中穩(wěn)定表達(dá)并適用于不同條件的內(nèi)參基因或其組合。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為新銀輝品種的甜瓜，購于福建農(nóng)嘉種業(yè)股份有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1甜瓜幼苗培育 選取顆粒飽滿的甜瓜種子，使用l0%過氧化氫溶液進(jìn)行浸種10 min，均勻撒到含有珍珠巖的培養(yǎng)皿（90 mm）中，并加入10mL無菌雙蒸水（保證充分浸濕珍珠巖），蓋上培養(yǎng)皿蓋子，放置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱，暗環(huán)境培養(yǎng)3d后，分別將單株苗轉(zhuǎn)移至500g基質(zhì)（蛭石、珍珠巖、草炭土比為1：1：3）中培育。在自然生長條件下，選取長勢一致的甜瓜三葉一心幼苗進(jìn)行處理，采用5%PEG-6000溶液模擬水分脅迫，采用0.6 mmol·L-1肉桂酸溶液模擬自毒脅迫，采用50 mmol·L-1 NaCI+25 mmol·L-1 NaHC03溶液模擬鹽堿脅迫，采用4mg·L-1ABA溶液進(jìn)行ABA處理，以上溶液均采用雙蒸水進(jìn)行配制。每盆根灌100 mL上述不同處理液，ABA處理采用葉面噴施方式進(jìn)行。在第3d取植株的第3葉作為甜瓜葉片不同脅迫處理的供試材料;另選取未經(jīng)過脅迫處理的甜瓜種子、根、葉、果實(shí)作為不同組織器官的供試材料對照。所有樣品均設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)處理不少于10株幼苗。取樣后迅速置于液氮中，存放于-80℃環(huán)境中用于提取RNA。

1.2.2總RNA提取及cDNA合成 用天根多酚多糖總RAN提取試劑盒（TIANGEN公司）提取供試材料總RNA，具體提取操作步驟按照說明書進(jìn)行，用NanoDrop200超微量分光光度計(jì)[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]測定RNA的OD值和濃度，用l%的凝膠瓊脂檢測RNA的完整性。利用Hifair?Ⅱlst Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（ gDNAdigester plus）試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于-20℃保存。

1.2.3引物設(shè)計(jì)和特異性檢測 選擇9個(gè)功能不同的看家基因：18s rRNA、TUA、EFla、Actinl、Actin2、Actin3、Actin4、CYC、UBI-ep作為候選內(nèi)參基因，通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)內(nèi)參基因引物（表1），由福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成引物。將所有樣品的cDNA模板等量混合，對10個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)采用2×Taq Master Mix（上海近岸科技有限公司）試劑，反應(yīng)20μL體系為：上、下游引物（10 μmol·L-1）分別0.5μL，cDNA模板1μL，2×Taq Master Mix 10μL，無菌水8μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min;98℃變性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。最后用l%的瓊脂糖凝膠電泳檢測引物特異性。

1.2.4擴(kuò)增效率及qRT-PCR分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR在伯樂公司的CFX96Touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，按照Hieff? qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）進(jìn)行，反應(yīng)體系為20μL：上、下游引物（10μmol·L-1）分別為0.4μL，cDNA模板1μL，Hieff? qPCR SYBR Green MasterMix 10μL，無菌水8.2μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，變性95℃10 s，60℃退火30s，72℃延伸20s，共45個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù);反應(yīng)結(jié)束，根據(jù)熔解曲線分析基因的特異性。將所有樣品的cDNA模板等量混合，按10倍進(jìn)行稀釋，稀釋成5個(gè)濃度梯度，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，根據(jù)Bio-RadCFX Manager 3.0（3.0.1224.1015）軟件給出的Ct值（循環(huán)閾值，Cycle threshold）計(jì)算引物的擴(kuò)增效率E值，計(jì)算公式為：E=（10-1/slope-1）×100%，Slope為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

1.3數(shù)據(jù)分析

通過Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，參照BestKeeper[14]、NormFinder[16]和geNorm[4]軟件使用說明，對9個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行分析篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量、引物特異性檢測及擴(kuò)增效率分析

采用NanoDrop 200超微量分光光度計(jì)測定所提取甜瓜不同組織RNA的OD值，所提的總RNA濃度為1028～7230 ng·μL-l，OD260/280值在1.89～2.10;經(jīng)過1%的瓊脂凝膠電泳檢測，18S和28S的條帶清晰，且28S條帶亮度約是18S條帶的2倍，表明所有樣品的總RNA質(zhì)量良好，符合后續(xù)試驗(yàn)要求。將8個(gè)不同組織器官的模板等量混合，在1%的瓊脂凝膠電泳檢測，擴(kuò)增出的條帶均為單一條帶，無引物二聚體（圖1）。所有引物的熔解曲線均只有單一峰且重復(fù)性好（圖2），進(jìn)一步說明引物特異性好。通過Ct值計(jì)算引物的擴(kuò)增效率E值，9個(gè)候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率在1.97～2.10（表1），符合熒光定量PCR要求。

2.2 9個(gè)候選參考基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

2.2.1 9個(gè)內(nèi)參基因Ct值分析 采用熒光定量PCR儀對9個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行擴(kuò)展，由圖3可看出，9個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值分布于9.02～35.63，其中18s rRNA Ct值最小，表明其在樣品中的轉(zhuǎn)錄水平最高;Actin2分布范圍最廣，且Ct值最大，豐度低，最大Ct值與最小Ct值相差6.36;EFla分布范圍最小，Ct值相差3.09;其他內(nèi)參基因Ct值的相差分布于3.40～4.99。

2.2.2 Best-Keeper穩(wěn)定性分析 使用Best-Keeper軟件分析結(jié)果如表2所示，在甜瓜不同組織器官中表達(dá)最穩(wěn)定的前5個(gè)基因依次為CYC>18s rRNA>UBI-ep>EFla>TUA。CYC在不同組織器官中表達(dá)最穩(wěn)定，其SD值（標(biāo)準(zhǔn)差，Stardand deviaton）為0.57;Actinl、Actin2、Actin3和Actin4的SD值均超過1，表明4個(gè)內(nèi)參基因在不同組織器官中表達(dá)穩(wěn)定性較低。在不同脅迫處理中表達(dá)最穩(wěn)定的前5個(gè)基因依次為18s rRNA>Actin3>Actin4> EFla>UBI-ep。18srRArA在不同脅迫處理中表達(dá)最穩(wěn)定，其SD值為0.22;Actin2的SD值為1.86，SD值超過1，說明Actin2在不同脅迫處理中的穩(wěn)定性較差。

2.2.3 Norm Finder及ge Norm穩(wěn)定性分析 在NormFinder軟件分析結(jié)果（表3）中，在不同組織器官中表達(dá)最穩(wěn)定的前5個(gè)基因依次為EFla>UBI-ep>Actin4>CYC>Actin3。EFla在不同組織器官中表達(dá)最穩(wěn)定，M值（穩(wěn)定值，Stabilityvalue）為0.107;Actin2表達(dá)最不穩(wěn)定，M值為0.423。在不同脅迫處理中表達(dá)最穩(wěn)定的前5個(gè)基因依次為EFla>UBI-ep>Actin4>CYC>18s rRNA，EFla在不同脅迫處理中表達(dá)最為穩(wěn)定，M值為0.023;Actin2表達(dá)最不穩(wěn)定，M值為0.264。

使用ge Norm分析結(jié)果如表3所示，在不同組織器官中穩(wěn)定值前5名的依次為Actin4=Actin3>Actinl>EFla>UBI-ep。Actin4和Actin3的M值均為0.526。CYC、TUA和Actin2的M值大于1，這3個(gè)基因在不同組織器官中表達(dá)不穩(wěn)定。不同脅迫處理中表達(dá)最穩(wěn)定的依次為EFla=UBI-ep>Actin4>CYC>Actinl，EFla和UBI-ep的M值為0.138。最不穩(wěn)定的基因是Actin2，M值為0.781。

2.2.4候選內(nèi)參基因組合分析 基于ge Norm軟件V值（配對變異值，Pairwise variation value）可計(jì)算出最適內(nèi)參基因組合的數(shù)量（圖4）。在甜瓜不同組織器官中V4/5=0.148，V值小于0.15，最佳基因組合數(shù)目為4個(gè)，Actin4、Actin3、Actinl和EFla可作為最佳內(nèi)參基因組合。在不同脅迫處理中的V2/3=0.043，小于0.15，最佳基因組合數(shù)目為2，EFla和UBI-ep可作為最佳內(nèi)參基因組合。

2.2.5候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性綜合排名 3款軟件算法不同導(dǎo)致候選內(nèi)參基因排名有所不同，可通過幾何平均值來綜合評估內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。根據(jù)3款軟件分析結(jié)果，確定了9個(gè)候選內(nèi)參基因的綜合排名（表4）。不同器官組織測試中排名前三的內(nèi)參基因依次是EFla>Actin4>CYC，ge Norm軟件計(jì)算出的最佳基因組合為Actin4、Actin3、Actinl和EFla。不同脅迫處理中排名前3的基因依次為EFla>UBI-ep>Actin4，ge Norm軟件評估EFla和UBI-ep穩(wěn)定性優(yōu)于其他基因，為最佳組合基因?？傮w而言EFla在甜瓜不同組織器官和不同脅迫處理中均能穩(wěn)定表達(dá)，可作為甜瓜RT-qPCR分析首選內(nèi)參基因。

3討論與結(jié)論

多數(shù)研究把傳統(tǒng)管家基因直接作為內(nèi)參基因，常見的如Actin（肌動(dòng)蛋白基因）、EFla（轉(zhuǎn)錄延伸因子）、18s rRNA（18s核糖體RNA）等[17]。但內(nèi)參基因的表達(dá)會(huì)因?yàn)橹参锊煌鞴俳M織和不同外界條件而產(chǎn)生差異性，在對人參[18]（Panax ginseng C.A.Meyer）、蒲公英[19]（Taraxacum officinaleF.H.Wigg，）、核桃[20]（Juglans reiga L.）和馬鈴薯[3]（Solanumtuberosum L.）等的相關(guān)研究中均證實(shí)了這一問題，進(jìn)行相關(guān)分析前篩選出合適內(nèi)參基因無疑是必要的。Best-Keeper、Norm Finder和ge Norm是公認(rèn)的內(nèi)參基因篩選軟件。Best-Keeper分析流程簡便，但分析數(shù)量僅限3～10個(gè)[14]。Norm Finder可處理組內(nèi)及組間差異，但無法消除樣品間誤差，且每次只能給出一個(gè)最適基因，無法確定最佳內(nèi)參基因組合[16]。ge Norm與Norm Finder類似，優(yōu)點(diǎn)在于可計(jì)算最佳組合，但給出的基因組合具有相似表達(dá)譜[20]。為了篩選在甜瓜不同組織及脅迫均能穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，本研究采取3款評測軟件同時(shí)對候選內(nèi)參基因進(jìn)行分析，并結(jié)合Excel進(jìn)行綜合評估，結(jié)果更具有可靠性。

本研究發(fā)現(xiàn)9個(gè)候選內(nèi)參基因在不同部位及不同脅迫處理?xiàng)l件下穩(wěn)定性不同。其中EFla在甜瓜鹽堿脅迫、ABA處理及葉片中表達(dá)最穩(wěn)定，EFla是不同甜瓜組織及脅迫處理中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，這與EFla在夜香樹[21]（Cestrum nocturnum L.）和羊草[22]（Levmus chinensis Tzvel.）中的鑒定結(jié)果類似。Actin2是3款軟件分析共同認(rèn)為表達(dá)最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因，這可能與樣品種類、組織及不同脅迫有關(guān)，在蒙古冰草[23]（Agropyron mongolicum Keng.）的干旱脅迫和劍麻（Agave sisalana Perr.）的水楊酸處理[24]的研究中同樣發(fā)現(xiàn)Actin2的穩(wěn)定性低，不適合選為內(nèi)參基因。在試驗(yàn)中引入2個(gè)或2個(gè)以上內(nèi)參基因可降低實(shí)驗(yàn)誤差[25]。基于ge Norm分析發(fā)現(xiàn)針對甜瓜不同組織器官而言最佳內(nèi)參基因組合數(shù)目是4個(gè)，同時(shí)使用Actin4、Actin3、Actin1和EFla為內(nèi)參基因組合來分析目的基因在不同組織器官中的表達(dá)可提高試驗(yàn)準(zhǔn)確性;但這樣可能會(huì)使試驗(yàn)設(shè)計(jì)較為復(fù)雜，操作流程繁瑣，具體分析時(shí)應(yīng)適當(dāng)加以選擇，縮減數(shù)量。對不同脅迫而言可采用EFla和UBI-ep作為組合，可使結(jié)果更加準(zhǔn)確和穩(wěn)定，也不會(huì)產(chǎn)生較多試驗(yàn)設(shè)計(jì)冗余。

本研究綜合利用Best-Keeper、Norm Finder和geNorm軟件對甜瓜內(nèi)參基因進(jìn)行評估及篩選，3款軟件分析結(jié)果存在一定差異，這與在蒲公英[19]、核桃[20]、黃山欒樹[5]和刺葡萄[13]等研究中的情況類似，3款軟件算法不同可能是導(dǎo)致這一問題的主要原因[26]。綜上所述，在甜瓜不同組織器官的基因定量分析中可選EFla為內(nèi)參基因，Actin4、Actin3、Actin1和EFla為內(nèi)參基因組合;在不同脅迫處理研究中推薦使用EFla為內(nèi)參基因，EFla和UBI-ep可作為內(nèi)參基因組合。

參考文獻(xiàn)：

[1]GINZINGER D G.Gene quantification using real-time quantitativePCR： An emerging technology hits the mainstream[J].ExperimentalHematology，2002，30（6）：503-512.

[2]ZHANG Z Z，F(xiàn)AN J R，WU J H，et al. Alleviating effect of silicon onmelon seed germination under autotoxicity stress [J]. Ecotoxicologyand Environmental Safety，2020，188：109901.

[3]PFAFFL M W，TICHOPAD A， PRGOMET C， et al. Determination ofstable housekeeping genes， differentially regulated target genes andsample integrity： BestKeeper-Excel-based tool using pair-wisecorrelations[J].Biotechnology Letters，2004，26（6）：509-515.

[4]VANDESOMPELE J， DE PRETER K，PATTYN F，et al. Accuratenormalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometricaveraging of multiple internal control genes [J]. Genome Biology，2002，3（7）：1-12.

[5]TANG x，ZHANG N，SI H J，et al. Selection and validation ofreference genes for RT-qPCR analysis in potato under abioticstress[J].Plant Methods，2017，13：85.

[6]LUO H L，LUO L P，GUAN B C，et al. Evaluation of candidatereference genes for RT-qPCR in lily （Lilium brownii） [J].The Journalof Horticultural Science and Biotechnology， 2014， 89（3）：345-351.

[7]呂運(yùn)舟，董筱昀，黃利斌.黃山欒樹實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選[J].分子植物育種，2019，17（2）：553-560.

LU Y Z，DONG X Y， HUANG L B.The screening of reference genesfor real-time fluorescent quantitative PCR of Koelreuteriabipinnata[J]. Molecular Plant Breeding， 2019，17（2）：553-560.（in Chinese）

[8]任銳，戴鵬輝，李萌，等.珙桐實(shí)時(shí)定量PCR內(nèi)參基因的篩選及穩(wěn)定性評價(jià)[J].植物生理學(xué)報(bào)，2016，52（10）：1565-1575.

REN R，DAI P H，LI M，et al.Selection and stability evaluation ofreference genes for real-time quantitative PCR in dove tree （Davidiainvolucrata）[J].Plant Physiology Communications，2016，52（10）：1565-1575.（in Chinese）

[9]GOPALAM R，RUPWATE S D，TUMANEY A W. Selection andvalidation of appropriate reference genes for quantitative real-timePCR analysis in Salvia hispanica [J]. PLoS One，2017，12（11）：e0186978.

[10]蔣婷婷，高燕會(huì)，童再康.石蒜屬植物實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的選擇[J].園藝學(xué)報(bào)，2015，42（6）：1129-1138.

JIANG T T，GAO Y H，TONG Z K.Selection of reference genes forquantitative real-time PCR in Lycoris [J]. Acta Horticulturae Sinica，2015，42（6）：1129-1138.（in Chinese）

[11]王彥杰，董麗，張超，等.牡丹實(shí)時(shí)定量PCR分析中內(nèi)參基因的選擇[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，20 （5）：521-528.

WANG Y J，DONG L， ZHANG C， et al. Reference gene selection forreal-time quantitative PCR normalization in tree peony （Paeoniasuffruticosa andr.） [J]. Journal of Agricultural Biotechnology， 2012，20（5）： 521-528. （in Chinese）

[12]FAUSTOAK S，SILVA T D F，ROMANEL E， et al_microRNAs asreference genes for quantitative PCR in cotton[J]. PLoS One， 2017，12（4）：e0174722.

[13]潘紅，賴呈純，張靜，等.不同光質(zhì)條件下刺葡萄紅色愈傷組織的RT-qPCR內(nèi)參基因篩選[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2019，25（6）：1407-1413.

PAN H，LAI C C，ZHANG J， et al.Selection of reference genes forRT-qPCR from the red callus of Vitis davidii （Rom. Caill.） Fo（e）xunder different light qualities [J]. Chinese Journal of Applied&Environmental Biology， 2019，25（6）：1407-1413.（in Chinese）

[14]GONZALEZ-VERDEJO C I，DIE J V， NADAL S， et al. Selection ofhousekeeping genes for normalization by real-time RT-PCR： Analysisof Or-MYBl gene expression in Orobanche ramosa development [J].Analvtical Biochemistry，2008，379（2）：176-181.

[15]史興青.甜瓜生長發(fā)育和脅迫條件下實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

SHI X Q，Selection of suitable reference genes for quantitative real-time RT-PCR studies in Cucumis melo under growth and developmentprocess， biotic and abiotic stresses[D]. Zhengzhou： Henan AgriculturalUniversity， 2016.（in Chinese）.

[16]ANDERSEN C L JENSEN J L，ORNTOFT T F.Normalization ofreal-time quantitative reverse transcription-PCR data：A model-basedvariance estimation approach to identify genes suited fornomalization，applied to bladder and colon cancer data sets[J].（Cancer Research，2004，64（15）：5245-5250.

[17]SUDHAKAR REDDY P，SRINIvAS REDDY D，SIvASAKTHI K，et al.Evaluation of Sorghum [Sorghum bicolor（L.）]reference genes invariOus tissues and under abiotic Stress conditiOnS for auantitative real-time PCR data nonnalization[J].Frontiers in Plant Science，2016，7：529.

[18]LI L，wANG K Y，ZHAO M Z，et al. Selection and validation ofreference genes desirable for gene expression analysis by qRT-PCR inMeJA-treated ginseng hairy roots[J]. PLoS One，2019，14（12）：e0226168.

[19]喬永剛，王勇飛，曹亞萍，等.藥用蒲公英低溫和高溫脅迫下內(nèi)參基因篩選與相關(guān)基因表達(dá)分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2020，47（6）：1153-1164.

QIAO Y G，WANG Y F，CAO Y P，et al. Reference genes selectionand related genes expressiOn analysis under low and high temperaturestress in Taraxacum officinale[J]. Acta Horticulturae Sinica，2020，47（6）：1153-1164.（in Chinese）

[20]宋曉波，常英英，劉吳，等，核桃不定根發(fā)生階段內(nèi)參基因篩選與關(guān)鍵基因表達(dá)分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2019，46（10）：1907-1918.

SONG X B，CHANG Y Y，LIU H，et al.Reference gene SeleCtion andgenes expression analysis during adventitious root formation inwalnut[J].Acta Horticulturae Sinica，2019，46（10）：1907-1918.（in Chinese）

[21]劉濤，熊青，許穎妍，等.夜香樹花期熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選[J].植物科學(xué)學(xué)報(bào)，2017，35（4）：534-542.

LIU T，XIONG Q，XU Y Y，et al.Selection of reference genes forqRT-PCR normalization in Cestru nocturnum during floweing[J].Plant Science Journal，2017.35（4）：534-542.（inChinese）

[22]胡寧寧，郭慧琴，李西良，等.羊草不同組織實(shí)時(shí)定量PCR內(nèi)參基因的篩選[J].草業(yè)科學(xué)，2017，34（7）：1434-l441.

HU N N，GUO H Q，LI X L，et al.Selection of reference genes forquantitative real-time PCR of Leymus chinensisi in

in differenttissues[J].Pratacultural Science，2017，34（7）：1434-1441.（inChinese）

[23]黃文華.蒙古冰草干旱脅迫下內(nèi)參基因的篩選及P5CS基因定量表達(dá)分析[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

HUANG W H. SeleCtion Of control gene in quantitative PCR andanalysis of differential expression of P5CS gene in Agropyronmongolicum Keng under drought stress[D].Hohhot：Inner MongoliaAgricultural University，2014.（in Chinese）.

[24]張燕梅，王瑞芳，楊子平，等.劍麻內(nèi)參基因篩選與穩(wěn)定表達(dá)分析[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2019，40（11）：2166-2173.

ZHANG Y M，WANG R F，YANG Z P，et al.Screening of suitablereference genes for qRT-PCR normalization in sisal[J].ChineseJournal of Tropical Crops，2019，40（11）：2166-2173.（inChinese）

[25]XIAO Z，SUN X B，LIU X Q，et al.Selection of reliable referencegenes for gene expression studies on Rhododendron molle G.don[J].Frontiers in Plant Science，2016，7：1547.

[26]HU R，QI G，KONG Y，et al. Comprehensive analysis of NAC domaintranscription factor gene family in Populus trichocarpa[J]. BMCPlant Biology，2010，10（1）：145-158.

（責(zé)任編輯：張梅）

收稿日期：2020-07-29初稿;2020-10-04修改稿

作者簡介：章麗珍（1994-），女，碩上研究生，研究方向：農(nóng)藝與種業(yè)（E-mail： 651260775@qq.com）

*通信作者：張志忠（1976-），男，博上，副教授，研究方向：園藝植物逆境生理和生物技術(shù)（E-mail：zeada2001@l63.com）

基金項(xiàng)目：福建省閩江學(xué)者科研基金（116-114120019）;福建農(nóng)林大學(xué)創(chuàng)新專項(xiàng)基金（CXZX2016108、CXZX2017168）