蒲公英酚酸綜合提取技術(shù)優(yōu)化及質(zhì)量評(píng)價(jià)

吳哲 李趙嘉 馮薇 孟然 王秀萍

摘要：為獲得快速和準(zhǔn)確檢測(cè)蒲公英成分的提取工藝，以甲醇為提取劑，通過超聲波和酶解輔助提取，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法，結(jié)合指紋圖譜綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，篩選最佳提取工藝。結(jié)果表明，纖維素酶有利于提升提取和檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性，液料比對(duì)提高提取率具有促進(jìn)作用，甲醇與提取時(shí)間或甲醇與液料比對(duì)提取率的提升表現(xiàn)出了協(xié)同作用。高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜分析結(jié)果顯示，在所有的處理中，綠原酸和咖啡酸與對(duì)照?qǐng)D譜匹配度均為100%，以二者含量為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，獲得的最佳提取條件為纖維素酶0.1%，pH值為4，液料比為300 ∶ 1（mL ∶ g），甲醇體積分?jǐn)?shù)為40%，超聲提取時(shí)間120 min。本提取技術(shù)降低了操作成本，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，可直接用于實(shí)驗(yàn)室蒲公英酚酸類成分檢測(cè);同時(shí)，本研究中的提取優(yōu)化方法也為其他植物成分提取技術(shù)優(yōu)化提供了參考。

關(guān)鍵詞：蒲公英;指紋圖譜;咖啡酸;綠原酸;優(yōu)化及質(zhì)量評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào)：R284.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）23-0190-06

蒲公英是一種常見的中草藥，富含多糖、綠原酸、咖啡酸、總黃酮等多種活性成分。近年來隨著人們健康意識(shí)的提高，蒲公英逐漸成為一種藥食兼用植物。現(xiàn)代藥理研究表明，蒲公英具有廣譜抑菌、抗氧化、抗腫瘤和免疫促進(jìn)等作用，而這些作用與酚酸類物質(zhì)有一定的關(guān)系[1-2]。因此蒲公英不僅在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域備受關(guān)注，在食品特別是功能性食品的研究開發(fā)上也成為熱點(diǎn)。而酚酸類化合物的提取以及檢測(cè)則成為蒲公英應(yīng)用開發(fā)的重要基礎(chǔ)。

咖啡酸和綠原酸均為蒲公英的主要活性物質(zhì)[3]，且《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定蒲公英咖啡酸含量不應(yīng)低于0.02%。蒲公英成分含量變化除了與種類和栽培條件有關(guān)之外[4]，也與提取技術(shù)有關(guān)[1]。蒲公英成分提取方法按提取劑可分為水提和醇提，原理是酚酸物質(zhì)易溶于水和醇類溶劑。因此可將原料溶于提取劑，同時(shí)輔以物理方法或酶解方法破碎細(xì)胞壁，可提高酚酸成分提取率。提取工藝通常有熱水浸提、超聲波輔助提取、回流浸提等方法。影響提取率的因素還包括料液比、提取時(shí)間、提取溫度、溶劑濃度等，不同的提取條件有可能導(dǎo)致蒲公英成分結(jié)構(gòu)變化[1，3，5]，進(jìn)而影響成分功效。因此如何平衡最大的提取率及提取質(zhì)量成為本研究的重點(diǎn)內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丹東蒲公英（Taraxacum antungense）葉片干粉為河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所選育的濱蒲1號(hào)葉片加工獲得。60 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎后過80目篩，粉末置干燥器中干燥保存、備用。

咖啡酸、綠原酸、阿魏酸及木樨草素標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所;無水甲醇為國產(chǎn)分析純;纖維素酶酶活性為10 000 U/g;純化水由河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所制備。

1.2 提取工藝及優(yōu)化

稱取一定量蒲公英樣品，放入50 mL具塞離心管中，加入5 mL纖維素酶溶液（質(zhì)量濃度為0.1%，pH值為4），置于60 ℃水浴加熱30 min[1，6];隨后離心管中加入甲醇溶液20 mL，進(jìn)行超聲提取，超聲波功率120 W，提取結(jié)束后離心取上清液，待測(cè)。優(yōu)化的參數(shù)為甲醇濃度、料液比以及提取時(shí)間，具體提取參數(shù)及蒲公英樣品質(zhì)量按響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)表進(jìn)行（表1）。

1.3 檢測(cè)方法

利用注射器輔以0.45 μm濾膜將提取液注入進(jìn)樣瓶，準(zhǔn)備液相檢測(cè)。液相檢測(cè)條件為安捷倫 1 200 HPLC，鉆石1代C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相：A（0.02% 磷酸水溶液） ∶ B（甲醇）=50 ∶ 50;檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm;柱溫：30 ℃;流速：1 mL/min;進(jìn)樣量：10 μL。

配制不同濃度的綠原酸和咖啡酸標(biāo)品，與對(duì)應(yīng)的HPLC峰面積建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)擬合后，標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y1=16.835x1-16.971、y2 =22.173x2-13.042。其中，y1、y2為綠原酸和咖啡酸峰面積;x1和x2為綠原酸和咖啡酸含量，μg/mL。有效檢測(cè)范圍為0～100 μg/mL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

為了更好地評(píng)價(jià)提取工藝，將不同提取條件下的綠原酸和咖啡酸得率加權(quán)，以總咖啡酸得率為優(yōu)化目標(biāo)[11]，利用Design Expert 8.0.6軟件綜合評(píng)價(jià)提取工藝。加權(quán)方法：以綠原酸和咖啡酸得率的算術(shù)平均值比值為系數(shù)（k），將綠原酸轉(zhuǎn)換為咖啡酸，可得總咖啡酸得率，經(jīng)計(jì)算k=0.544（表1），即：總咖啡酸得率=綠原酸得率（%）×0.544+咖啡酸得率（%）。最后將HPLC數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，進(jìn)行相似度分析。試驗(yàn)每個(gè)處理重復(fù)4次，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤形式呈現(xiàn)，采用SPSS 16.0軟件Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡酸提取工藝優(yōu)化

試驗(yàn)結(jié)果表明，Cubic模型擬合結(jié)果呈顯著性（F=6.855，P=0.039），但是部分交叉項(xiàng)超出可信范圍，調(diào)整后模型變?yōu)閥=5.710-0.410x1+0.740x2-0.190x3+0.078x1x2-0.480x1x3+0.048x2x3-0.140x21-0.800x22+0.260x23-0.660x21x2+1.170x21x3+1.880x1x22，R2=0.95，其中y為咖啡酸含量，x1、x2、x3為甲醇含量，液料比和時(shí)間。根據(jù)模型的方差分析（表2），從單因子影響結(jié)果看，液料比顯著促進(jìn)提取率（F=9.416，P=0.037），其他2個(gè)因素對(duì)提取率沒有顯著影響，影響力大小為液料比>甲醇含量>時(shí)間。從影響因子協(xié)同效果看，甲醇含量與時(shí)間（A2C，F(xiàn)=11.536，P=0.027），甲醇含量與液料比（AB2，F(xiàn)=29.85，P=0.006）協(xié)同作用均對(duì)提取率有顯著促進(jìn)作用。根據(jù)實(shí)際數(shù)值，擬合函數(shù)為 y= 0.884 28x1+ 0.221 73x2+ 0.361 80x3-0.001 71x1x2-0.013 38x1x3+0.000 01x2x3-0.003 35x21-0.000 77x22+0.000 13x23-0.000 03x21x2+0.000 12x21x3+ 0.000 01x1x22-36.276 06。據(jù)此，可獲得10個(gè)最高提取率的方案（表3），其中優(yōu)化后的甲醇濃度主要圍繞在40%和70%，提取時(shí)間主要圍繞在120 min，液料比主要圍繞在200 ∶ 1（mL ∶ g）和300 ∶ 1（mL ∶ g）。由表3可知，最高提取率的方案為甲醇濃度40%，液料比200.7 ∶ 1（mL ∶ g），提取時(shí)間 120 min，預(yù)期咖啡酸含量7.7 mg/g。

2.2 綠原酸提取工藝優(yōu)化

利用同樣的分析及處理方法，對(duì)綠原酸提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，可得到擬合模型，即y=3.059-0.107x1+0.255x2+0.005x3+0.055x1x2-0.075x1x3+0.004x2x3-0.055x21-0.196x22-0.019x23-0.122x21x2+0.228x21x3+0.356x1x22，R2=0.98，其中y為咖啡酸含量，x1、x2、x3為甲醇濃度，液料比和時(shí)間。根據(jù)模型結(jié)果和方差分析（表4）可知，甲醇濃度（F=9.660，P=0.036 0）和液料比（F=54.960，P=0.002 0）均對(duì)綠原酸提取率有顯著促進(jìn)作用，甲醇濃度與時(shí)間（A2C，F(xiàn)=22.010，P=0.009 0），甲醇濃度與液料比（x1x22，F(xiàn)=53.550，P=0.002 0）協(xié)同作用均對(duì)提取率有顯著促進(jìn)作用。根據(jù)優(yōu)化模型，可獲得10個(gè)最高提取率的方案（表5），其中優(yōu)化后的甲醇濃度主要為40%、70%，提取時(shí)間約為 120 min，而液料比約為200 ∶ 1（mL ∶ g）和300 ∶ 1（mL ∶ g），最高提取率的方案為甲醇濃度40%，液料比 203.7 ∶ 1（mL ∶ g），提取時(shí)間120.0 min，預(yù)期綠原酸含量為3.40 mg/g。

2.3 總酚酸提取工藝優(yōu)化

對(duì)咖啡酸和綠原酸加權(quán)處理后?利用同樣的分析方法，對(duì)總酚酸提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，可得到擬合模型，即y=7.374 0-0.472 5x1+0.885 0x2-0.190 0x3+0.107 5x1x2-0.522 5x1x3+0.050 0x2x3-0.167 0x21-0.909 5x22+0.250 5x23-0.732 5x21x2+1.287 5x21x3+2.065 0x1x22，R2=0.96，其中y為咖啡酸含量，x1、x2、x3為甲醇濃度，液料比和時(shí)間。根據(jù)模型結(jié)果和方差分析可知，液料比（F=11.610，P=0.027 1）對(duì)總酚酸提取率有顯著性促進(jìn)作用，甲醇濃度與時(shí)間（A2C，F(xiàn)=12.290，P =0.025 0），甲醇濃度與液料比（AC，F(xiàn)=31.620，P =0.005 0）協(xié)同作用均對(duì)提取率有顯著促進(jìn)作用（表6）。根據(jù)模型可得到10個(gè)最高提取率的方案，其中優(yōu)化后的甲醇濃度約為40%、70%，提取時(shí)間約為120.0 min，液料比約為200.0 ∶ 1、300.0 ∶ 1（mL ∶ g）。由表7可知，最高提取率方案為甲醇濃度40%，液料比202.7 ∶ 1（mL ∶ g），提取時(shí)間 120.0 min，預(yù)期總酚酸含量為9.55 mg/g。

2.4 總成分提取工藝指紋圖譜分析與聚類分析

將所有提取液的HPLC數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)中，經(jīng)數(shù)據(jù)匹配，以中位數(shù)法建立對(duì)照指紋圖譜（圖1、表8）。結(jié)果顯示所有峰的保留時(shí)間RSD均小于1%，說明所有的提取工藝一致性較好。蒲公英樣品共檢測(cè)出10種成分，其中所有提取方法均檢測(cè)出綠原酸（4號(hào)）和咖啡酸（8號(hào)），二者為共有成分，與對(duì)照?qǐng)D譜匹配度為100%。其他成分1號(hào)、5號(hào)、9號(hào)匹配度也較高，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)和文獻(xiàn)查閱，這3種成分為七葉內(nèi)酯[3，7]、木樨草素-7-O-β-D葡萄糖苷[3，7]和阿魏酸。通過指紋圖譜相似度分析，所有的提取工藝之間相似度均在0.98以上，說明所有的提取工藝在質(zhì)量上具有高度相似性。為了更好地篩選提取工藝，筆者以咖啡酸和綠原酸峰面積為聚類指標(biāo)，應(yīng)用SPSS分析軟件，采用組間聯(lián)結(jié)、歐氏聚類法，所有提取工藝的聚類分析結(jié)果見圖2。

當(dāng)閾值為10時(shí)，所有的提取工藝被劃分為兩大類，其中10號(hào)處理被單列為一類，其他16種處理被劃為一大類。隨著閾值的減小，所有提取工藝可分為5類，其中處理5為單獨(dú)一類。結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化模型給出的方案可知，處理5提取率最高，其次為處理2、處理3、處理4、處理6、處理8、處理9、處理12、處理17。

2.5 提取工藝篩選與驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化模型，本研究獲得3個(gè)最高提取率的條件，這3個(gè)條件非常相近，因此可確定優(yōu)選條件（Ⅰ）為甲醇濃度40%，液料比200 ∶ 1（mL ∶ g），提取時(shí)間 120 min。同時(shí)結(jié)合聚類分析結(jié)果，筆者選擇提取率相對(duì)中等（Ⅱ）和低水平（Ⅲ）的2個(gè)條件，分別為甲醇濃度70%，液料比300 ∶ 1（mL ∶ g），提取時(shí)間120 min;甲醇濃度60%，液料比300 ∶ 1（mL ∶ g），提取時(shí)間30 min;提取結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示試驗(yàn)結(jié)果與軟件模擬計(jì)算結(jié)果差異不顯著，說明優(yōu)化模型預(yù)測(cè)結(jié)果可信。另外，優(yōu)選條件Ⅰ的咖啡酸提取率顯著高于條件Ⅲ，但與條件Ⅱ差異不顯著（P=0.785），說明優(yōu)選條件Ⅰ和Ⅱ均可作為最佳提取工藝。

2.6 纖維素酶及離心操作對(duì)提取及檢測(cè)結(jié)果的影響

本試驗(yàn)優(yōu)化工藝篩選是基于加酶輔以超聲波提取，由于水浴過程中可能存在酶解不完全或水分損失問題，因此筆者考察纖維素酶以及離心操作后二次定容對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。由于咖啡酸是《中華人民共和國藥典》2015版規(guī)定的參考標(biāo)準(zhǔn)，因此筆者在優(yōu)選條件Ⅱ下比較了不同操作咖啡酸檢測(cè)結(jié)果（表9）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是否離心，加酶偏差最小，說明加酶后可提高該工藝的穩(wěn)定性。離心定容后咖啡酸含量均降低，說明二次定容帶來的絕對(duì)誤差加大，因此本研究中的提取及檢測(cè)不需要二次定容，須注意水浴過程中盡可能避免水分損失。

3 結(jié)論與討論

目前商業(yè)生產(chǎn)中蒲公英成分提取多采用水提法，是因?yàn)榭紤]到提取劑成本以及提取設(shè)備復(fù)雜程度相對(duì)較低[1]，而小規(guī)模提取多采用乙醇溶劑提取[5-6，8]，是因?yàn)榉铀嵛镔|(zhì)更易溶于醇類溶劑。本研究采用甲醇為溶劑，是因?yàn)榉铀嵛镔|(zhì)檢測(cè)多用HPLC檢測(cè)方法，如GB/T 22250—2008《保健食品中綠原酸的測(cè)定》以及《中華人民共和國藥典》2015年版等。甲醇由于極性好，常用于HPLC流動(dòng)相。因此本研究直接用甲醇提取，省略了乙醇提取物旋蒸發(fā)+甲醇二次溶解步驟[4，8-10]，不僅降低了液相進(jìn)樣的前處理時(shí)間，提高了檢測(cè)效率，也減少了試驗(yàn)操作誤差，提高了檢測(cè)準(zhǔn)確率。

已發(fā)表文獻(xiàn)中蒲公英樣品質(zhì)量多在1 g左右，液料比常見于（10～30） ∶ 1（mL ∶ g）之間[1，2，9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，液料比過低容易使溶解不充分，影響提取效果。本研究中干樣品質(zhì)量約為0.1 g，甲醇 25 mL，降低材料成本。另外從指紋圖譜可知，蒲公英主要物質(zhì)在15 min內(nèi)即可檢出，因此在用液相色譜檢測(cè)蒲公英咖啡酸和綠原酸時(shí)，可將檢測(cè)時(shí)間控制在 15 min 內(nèi)，從而降低了檢測(cè)時(shí)間成本。根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，在酶解+超聲波輔助提取條件下，如果從節(jié)約成本的角度，本研究推薦優(yōu)化條件 Ⅰ，即甲醇40%、液料比200 ∶ 1（mL ∶ g），提取時(shí)間120 min;如果考慮提取率和綜合質(zhì)量，則選擇優(yōu)化條件 Ⅱ，即甲醇70%，液料比300 ∶ 1（mL ∶ g），提取時(shí)間120 min。

目前關(guān)于蒲公英有效成分提取技術(shù)優(yōu)化研究主要集中在提高某一種成分提取率或浸出物總提取率方面;在用于提取質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)篩選過程中，筆者利用指紋圖譜分析，采用多指標(biāo)評(píng)價(jià)了提取質(zhì)量，這對(duì)評(píng)價(jià)成分復(fù)雜的中藥材，具有一定的科學(xué)合理性[11]。本研究為綜合評(píng)價(jià)中藥材質(zhì)量提供了一種思路，即可根據(jù)各成分在藥效中所起的作用賦予不同的權(quán)重系數(shù)綜合評(píng)分進(jìn)行評(píng)價(jià)，避免了對(duì)多指標(biāo)單獨(dú)評(píng)價(jià)時(shí)相互間的沖突。同時(shí)本研究的提取優(yōu)化方法也為其他植物成分提取技術(shù)優(yōu)化提供了參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]王秋亞. 蒲公英有效成分的提取及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（8）：21-24.

[2]何婷婷，柴軍紅，鐘讀波，等. 蒲公英活性成分提取工藝的優(yōu)化、多糖紅外表征及其抗氧化性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（11）：163-166.

[3]王亞茹，李雅萌，楊 娜，等. 蒲公英屬植物的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J]. 特產(chǎn)研究，2017（4）：71-79.

[4]寧 偉，賈慶飛，朱 丹，等. 東北地區(qū)11種蒲公英咖啡酸和綠原酸的含量測(cè)定[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，43（5）：595-598.

[5]李喜鳳，郝 哲，邱天寶，等. 蒲公英中有機(jī)酸類成分的提取工藝研究[J]. 中成藥，2011，33（2）：262-265.

[6]張桂芳，郭希娟，王瑞琦. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助萃取蒲公英多酚的研究[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2017，37（5）：421-426.

[7]姚 巍，林文艷，周長(zhǎng)新，等. 蒙古蒲公英化學(xué)成分研究[J]. 中國中藥雜志，2007，32（10）：926-929.

[8]王 鵬，郭 麗. 響應(yīng)面法優(yōu)選蒲公英中綠原酸的提取工藝研究[J]. 北方園藝，2010（23）：44-46.

[9]張 玲，李繼昌，許 薇，等. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化蒲公英中咖啡酸的提取工藝[J]. 飼料研究，2013（5）：83-86.

[10]尹 青，張 華. 超聲波法提取蒲公英中的綠原酸[J]. 食品研究與開發(fā)，2009，30（5）：23-27.

[11]李景華，鐘佳佳，劉玉芹，等. 吉林12種蒲公英HPLC指紋圖譜研究[J]. 植物研究，2014，34（3）：423-427.江 偉，張 曉，李 曼，等. 江蘇省倉儲(chǔ)小麥品質(zhì)性狀分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（23）：196-199.