基于高通量測(cè)序技術(shù)的紅棗黑斑病病原菌分離與鑒定

劉曉勤 張銳利

摘要：通過(guò)探究造成南疆紅棗黑斑病的主要病原菌類別，為該病的靶向防治奠定理論基礎(chǔ)。采用高通量測(cè)序技術(shù)和傳統(tǒng)分離鑒定相結(jié)合的方法分別對(duì)南疆的喀什、和田、阿克蘇等3個(gè)地區(qū)患病紅棗黑斑部位進(jìn)行病原菌鑒定。結(jié)果表明，從27個(gè)樣品中獲得91 137個(gè)高質(zhì)量序列，其中相對(duì)豐度最高的菌門是子囊菌門，相對(duì)豐度最高的菌屬是鏈格孢屬（Alternaria），3個(gè)地區(qū)鏈格孢屬的相對(duì)豐度分別是99.98%、98.15%、99.92%，其他菌屬的相對(duì)豐度均在0.95%以下。通過(guò)對(duì)患病果實(shí)樣品和代表菌株進(jìn)行組織分離、形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)分析和病理學(xué)接種試驗(yàn)，明確造成南疆紅棗黑斑病的主要病原菌是鏈格孢（Alternaria alternata），占85.6%。

關(guān)鍵詞：南疆地區(qū);紅棗黑斑病;高通量測(cè)序;病原鑒定

中圖分類號(hào)： S436.65 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）24-0108-04

紅棗具有豐富的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，近年來(lái)已成為新疆農(nóng)民增收致富的支柱型產(chǎn)業(yè)[1];然而，紅棗黑斑病的發(fā)生嚴(yán)重阻礙了新疆紅棗產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。該病害于2009年在新疆和田和阿克蘇地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，2011—2016年新疆棗園陸續(xù)被感染，發(fā)病率高達(dá)50%，部分棗園發(fā)病率高達(dá)70%[2]，給當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)造成了嚴(yán)重?fù)p失，因此對(duì)引起紅棗黑斑病病原菌的研究刻不容緩。

目前，對(duì)造成紅棗黑斑病病原的鑒定還存在爭(zhēng)議，林忠敏等研究認(rèn)為，山西省紅棗黑斑病病原菌為交鏈孢屬（Alternaria）和莖點(diǎn)屬（Phoma sp.）[2];靳增軍等報(bào)道河北冬棗黑斑病病原物為毀滅莖點(diǎn)霉（Phoma destructiva Plowr.）和鏈格孢（Alternaria alternata）等2種[3];劉曉琳等研究認(rèn)為，新疆部分地區(qū)紅棗黑斑病病原菌為鏈格孢[4]，由此，推測(cè)地域不同可能造成紅棗黑斑病病原的不同。

傳統(tǒng)的分離鑒定方法在分析鏈格孢屬形態(tài)特征復(fù)雜等問(wèn)題時(shí)，準(zhǔn)確鑒定菌屬種存在一定困難和局限性[5]。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)因耗時(shí)短、效率高、成本低、準(zhǔn)確性高和針對(duì)性強(qiáng)等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于土壤[6]、腸道[7]、葉片和果實(shí)[8]等領(lǐng)域。因此，本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行預(yù)判后，結(jié)合傳統(tǒng)鑒別方法[2-4]，有針對(duì)性地進(jìn)行分離鑒定和回接驗(yàn)證，2種方法取長(zhǎng)補(bǔ)短、互為印證，為后續(xù)拮抗菌的精準(zhǔn)篩選和靶標(biāo)防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

患病駿棗果實(shí)樣品于2018年11月從南疆的喀什、和田、阿克蘇等3個(gè)地區(qū)9個(gè)患病棗園采集，3個(gè)地區(qū)的編號(hào)分別為喀什地區(qū)J1、和田地區(qū)J2、阿克蘇地區(qū)J3（表1）。

試驗(yàn)在新疆塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試棗果為農(nóng)一師十團(tuán)駿棗成熟期果實(shí)，用于致病性測(cè)定。培養(yǎng)基有PDA培養(yǎng)基[9]、WA培養(yǎng)基[9]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取和MiSeq測(cè)序 果實(shí)DNA的提取使用Fast DNA SPIN Kit for Soil試劑盒（MP），用NanoDrop-2000 測(cè)定DNA濃度，然后將質(zhì)量合格的DNA樣品送上海派森諾生物科技股份有限公司使用 Illumina （MiSeq）平臺(tái)對(duì)真菌ITS 區(qū)進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 用DADA2方法進(jìn)行去引物、質(zhì)量過(guò)濾、去噪、拼接和去嵌合體，得到高質(zhì)量的序列;用QIIME2 （2019.4）軟件和R軟件中g(shù)gplot2對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 病原物分離與純化 對(duì)患病棗果實(shí)進(jìn)行表面清洗消毒后，取患病棗果實(shí)病健交界處的果肉，采用組織分離法[10]分離菌株，后在培養(yǎng)基WA上進(jìn)行純化菌株，將純化的菌株進(jìn)行編號(hào)，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 致病性測(cè)定 從棗果黑斑病的分離物中挑選53T-3、50T-2、47T-2、224T-1、224T-7、HP-1、AH-2、3T-3和10T-5等9株代表菌株，通過(guò)離體菌塊貼接法測(cè)定其致病力。將純化后的菌株接種至PDA培養(yǎng)基在28 ℃條件下培養(yǎng)6 d，用無(wú)菌的1 mL移液槍頭從底端打取生長(zhǎng)較好的連同培養(yǎng)基一起的菌塊;選取健康無(wú)外力損傷的棗果實(shí)，用無(wú)菌水清洗，后用75%乙醇進(jìn)行表面消毒，在超凈工作臺(tái)中晾干;用無(wú)菌牙簽刺孔，將菌餅的菌面朝下接種至棗果實(shí)刺孔處，同時(shí)用PDA培養(yǎng)基餅塊作對(duì)照;將接有有菌菌餅和無(wú)菌餅塊的棗果分別放入鋪有濕潤(rùn)無(wú)菌棉的玻璃罐中，每株菌接種3個(gè)健康果實(shí)，接種完畢后置于28 ℃培養(yǎng)箱中，有光照和無(wú)光照12 h交替培養(yǎng);每24 h觀察記錄果實(shí)表面變化情況，待6 d后對(duì)患病果肉部分進(jìn)行菌株再分離。

1.2.5 病原菌鑒定

1.2.5.1 菌株形態(tài)觀察 將病原菌的單孢菌株接于PDA培養(yǎng)基，28 ℃恒溫光暗交替培養(yǎng)6 d，記錄其形態(tài)特征，參照張?zhí)煊畹姆椒╗5]在顯微鏡下觀察分生孢子、分生孢子梗、喙的形態(tài)和成鏈情況。

1.2.5.2 菌株分子鑒定 選取不同地區(qū)的9株菌，編號(hào)分別為53T-3、50T-2、47T-2、224T-1、224T-7、HP-1、AH-2、3T-3和10T-5;分別在培養(yǎng)基PDA上培養(yǎng)6 d，后用無(wú)菌一次性1 mL藍(lán)色移液槍頭底端打取菌塊接種在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃ 恒溫條件下12 h白晝交替培養(yǎng)7 d后收集菌絲體，用試劑盒（TIANGEN Plant Genomic DNA Kit）進(jìn)行基因組DNA提取。以菌株基因組DNA為模板，以Beta-F和Beta-R[11]為引物擴(kuò)增代表菌株的β-tubulin基因;將PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，獲得同源性較高的菌株序列，通過(guò)MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定菌株親緣關(guān)系，明確菌株分類學(xué)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 物種組成分析

從喀什、和田、阿克蘇等3個(gè)地區(qū)27個(gè)樣品中共獲得91 137個(gè)高質(zhì)量序列，各水平OTUs數(shù)量由高到低排列依次為和田地區(qū)>阿克蘇地區(qū)>喀什地區(qū)（圖1）;共檢測(cè)出3個(gè)菌門分別是子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、被孢霉菌門（Mortierellomycota），其中子囊菌門（Ascomycota）是物種數(shù)量最多的菌門（表1），8個(gè)綱、12個(gè)目、15個(gè)科和19個(gè)屬;3個(gè)地區(qū)相對(duì)豐度最高的菌屬是鏈格孢屬（Alternaria），相對(duì)豐度分別為喀什地區(qū)99.98%、和田地區(qū)98.15%、阿克蘇地區(qū)99.92%，其他菌屬的相對(duì)豐度均在0.95%以下（圖2）;高通量測(cè)序結(jié)果表明，導(dǎo)致紅棗黑斑病主要病原菌屬為鏈格孢屬。

2.2 病原物的分離結(jié)果

通過(guò)傳統(tǒng)的組織分離法增加樣品數(shù)量，從81份患病果實(shí)樣品中分離獲得90株分離物，依據(jù)菌落形態(tài)初步確定77株鏈格孢菌占85.6%，7株鐮刀菌占7.8%，3株青霉菌占3.3%，3株其他菌占3.3%（表2）;因此，推測(cè)導(dǎo)致紅棗黑斑病的主要病原菌是鏈格孢菌。

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將分離獲得的53T-3、50T-2、 47T-2、 224T-1、224T-7、HP-1、AH-3、3T-3、10T-5等9株菌在PDA培養(yǎng)基上28 ℃條件下培養(yǎng)6 d，從圖3-A、3-B可見，菌落顏色初期為白色，后逐漸變?yōu)榛疑恋稚?，邊緣整齊;從圖3-C、3-D 可見，分生孢子梗單生或簇生，或直或彎，淡褐色至褐色，（30.0～71.0） μm×（3.9～5.4） μm。分生孢子單生或鏈生，表面光滑，有橫、縱隔膜，倒棍棒形或卵形，淡褐色至褐色，孢身（22.0～40.1） μm×（8.1～13.3） μm。依次對(duì)菌株的菌落、分生孢子梗和分生孢子所呈現(xiàn)出來(lái)的顏色變化、形態(tài)特征等參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行鑒定，初步鑒定其為鏈格孢（Alternaria alternate）。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 通過(guò)傳統(tǒng)組織分離后進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得β-tubulin基因，后在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），所有供試菌株與A.alternate聚在同一個(gè)單源分支上，同源性為99%。UPGMA聚類分析結(jié)果表明，3個(gè)地區(qū)的樣品聚類在一起（圖5）。圖4、圖5均表明導(dǎo)致南疆3個(gè)地區(qū)紅棗黑斑病的主要病原菌是A.alternate。

2.4 致病性測(cè)定

將分離獲得的代表菌株回接至健康的駿棗果實(shí)上，棗果在接種病原菌20 d后，接種部位開始形成病斑，呈黑色，病斑逐漸擴(kuò)大（圖6-B），接種病癥與田間癥狀相同（圖6-C），致病性測(cè)定結(jié)果表明，導(dǎo)致紅棗黑斑病的主要病原菌是A.alternate。

3 討論

目前，關(guān)于造成紅棗黑斑病病原的研究報(bào)道較多;但可能因地域或品種不同，不同學(xué)者的研究結(jié)果各有不同。王軍等鑒定了山東省部分縣（市）冬棗黑斑病病原為細(xì)鏈格孢菌[A.alternata（Fr.） Keissler][12];宗淑萍等發(fā)現(xiàn)河北省冬棗黑點(diǎn)病病原菌為桑殼小圓孢菌（Coniothyrium Sacc.）、仁果莖點(diǎn)霉（Phoma pomirum Thum）以及細(xì)鏈格孢[A.alternata（Fr.） Keissler][13];包慧芳等研究認(rèn)為，新疆部分地區(qū)紅棗黑斑病病原為鏈格孢（A.alternata）[14]。本研究結(jié)果表明，針對(duì)南疆地區(qū)紅棗黑斑病的病原研究很有必要。

因鏈格孢屬種類多、形態(tài)特征復(fù)雜多變，傳統(tǒng)的分離鑒定手段一部分主要依靠肉眼判斷，主觀性較強(qiáng)，一些細(xì)微差異可能被忽視，準(zhǔn)確率降低。隨著研究對(duì)象范圍的擴(kuò)大和數(shù)量的增加，傳統(tǒng)的分離鑒定存在耗時(shí)長(zhǎng)、效率低、成本高等局限性，在一定程度上影響了后續(xù)試驗(yàn)的深入開展，而高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用[6-8]可彌補(bǔ)傳統(tǒng)分離鑒定的不足，也為導(dǎo)致紅棗縮果病等其他病害病原的準(zhǔn)確鑒定和靶向防治提供思路。當(dāng)然要想達(dá)到高效防治，還須對(duì)病原菌的生活習(xí)性、侵染時(shí)機(jī)以及發(fā)病條件等方面進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)和傳統(tǒng)分離鑒定相結(jié)合的方式，對(duì)南疆喀什、和田、阿克蘇等3大紅棗產(chǎn)區(qū)患病棗園中患病駿棗進(jìn)行樣品采集，通過(guò)對(duì)病原物進(jìn)行組織分離、形態(tài)學(xué)觀察、病理學(xué)接種試驗(yàn)和分子生物學(xué)分析，結(jié)果表明，鏈格孢（A.alternata）為主要的病原菌，試驗(yàn)結(jié)果與向征等的研究結(jié)果[15-16]一致。

參考文獻(xiàn)：

[1]付 威，何 榮，坎 雜，等. 紅棗力學(xué)特性的試驗(yàn)研究[J]. 石河子大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，31（4）：518-522.

[2]林忠敏，趙曉軍，趙子俊，等. 紅棗果實(shí)黑斑病的病原分離和鑒定[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，29（1）：74-77.

[3]靳增軍，劉春琴，甄文超，等. 冬棗黑疔病病原菌鑒定[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，21（增刊1）：162-165.

[4]劉曉琳，劉 玉，馬 榮，等. 新疆棗果黑斑病病原菌鑒定及生物學(xué)特性[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，30（3）：132-138.

[5]張?zhí)煊?中國(guó)真菌志：鏈格孢屬[M]. 北京：科學(xué)出版社，2003：281.

[6]Teixeira L C R S，Peixoto R S，Cury J C，et al. Bacterial diversity in rhizosphere soil from Antarctic vascular plants of Admiralty Bay，maritime Antarctica[J]. ISME Journal，2010，4（8）：989-1001.

[7]Yatsunenko T，Rey F E，Manary M J，et al. Human gut microbiome viewed across age and geography[J]. Nature，2012，486（742）：222-227.

[8]魏玉潔，鄒 彎，馬文瑞，等. 應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)研究新疆產(chǎn)區(qū)葡萄果實(shí)、葉片及果園土壤微生物多樣性[J]. 食品科學(xué)，2018，39（6）：162-170.

[9]杜 娟，任 娟，趙思峰，等. 新疆馬鈴薯瘡痂病病原的鑒定[J]. 石河子大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，28（4）：414-417.

[10]冉俊祥，肖杰文，楊占臣，等. 美國(guó)大豆中鏈格孢的分離鑒定研究[J]. 植物檢疫，2011，25（3）：17-21.

[11]Peever T L，Su G，Carpenter-Boggs L，et al. Molecular systematics of citrus-associated Alternaria species[J]. Mycologia，2004，96（1）：119-134.

[12]王 軍，辛玉成. 冬棗黑斑病病原的分離與鑒定[J]. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，24（1）：21-23.

[13]宗淑萍，楊文香，劉大群，等. 冬棗黑點(diǎn)病病原鑒定[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，21（5）：105-107.

[14]包慧芳，王 寧，侯 敏. 新疆紅棗黑斑病病原菌鑒定及拮抗細(xì)菌篩選[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，53（9）：1667-1673.

[15]向 征，鐘聰慧，胡 軍，等. 新疆棗果黑斑病病原鑒定[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，50（5）：845-850.

[16]董 寧，馮宏祖，王 蘭，等. 南疆駿棗黑斑病癥狀表現(xiàn)及病原菌鑒定[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2016，43（6）：922-927.孫 凱，陳夕軍，沈迎春，等. 江蘇省栝樓爛果病病原鑒定及室內(nèi)防治藥劑篩選[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（24）：112-116.