Hedgehog通路在缺氧誘導腦膠質(zhì)瘤轉移中的作用及分子機制研究

傅之梅 胡兵偉 王錢東 馬婷婷

[摘要] 目的 探討Hedgehog通路在缺氧誘導腦膠質(zhì)瘤轉移中的作用及分子機制。 方法 選擇2018年1月～2019年8月浙江省立同德醫(yī)院腦膠質(zhì)瘤患者5例，取其腦膠質(zhì)瘤細胞，隨機分為對照組、抑制劑處理組、乏氧組和乏氧加抑制劑處理組。各組細胞均完成48 h培養(yǎng)，采用Westernblot檢測各組細胞Smoothened（SMO）、神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關癌基因同源蛋白1（GLI1）和上皮間質(zhì)轉化（EMT）E-cadherin基因表達，采用BrdU-ELISA法檢測細胞增殖，采用Transwell法檢測細胞侵襲作用。 結果 Westernblot檢測結果顯示，乏氧加抑制劑處理組SMO、GLI1及EMT相關蛋白表達水平低于乏氧組、抑制劑處理組與對照組（P<0.05）;乏氧組SMO、GLI1及EMT相關蛋白表達水平高于抑制劑處理組與對照組（P<0.05）。BrdU-ELISA法結果顯示，乏氧加抑制劑處理組不同時間點細胞增殖率低于乏氧組，高于抑制劑處理組與對照組（P<0.05）。Transwell法檢測結果顯示，乏氧加抑制劑處理組細胞侵襲率低于乏氧組，但明顯高于抑制劑處理組與對照組（P<0.05）;乏氧組細胞侵襲率高于抑制劑處理組與對照組（P<0.05）。 結論 Hedgehog通路可能通過SMO、GLI1調(diào)控EMT，參與疾病的發(fā)生、發(fā)展，在缺氧誘導腦膠質(zhì)瘤轉移中發(fā)揮重要的作用，能為腦膠質(zhì)瘤轉移治療提供新的靶點。

[關鍵詞] Hedgehog通路;Smoothened;神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關癌基因同源蛋白1;上皮間質(zhì)轉化;缺氧誘導;腦膠質(zhì)瘤轉移

[中圖分類號] R739.41? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）32-0020-04

[Abstract] Objective To explore the role and molecular mechanism of Hedgehog pathway in hypoxia-induced glioma metastasis. Methods From January 2018 to August 2019， a total of 5 patients with glioma from Tongde Hospital of Zhejiang Province were selected as subjects. Glioma cells were collected and randomly divided into a control group， an inhibitor-treated group， a hypoxia group， and a hypoxia combined with inhibitor-treated group. The cells in each group were given 48 hours of culture. The expression of Smoothened（SMO）， glioma-associated oncogene homologous protein 1（GLI1） and epithelial mesenchymal transformation（EMT） E-cadherin genes were detected by Westernblot， cell proliferation was detected by BrdU-ELISA method， and cell invasion was detected by Transwell method. Results Westernblot test results showed that the expression levels of SMO， GLI1 and EMT-related proteins in the hypoxia combined with inhibitor-treated group were lower than those in the hypoxia group， inhibitor-treated group and control group（P<0.05）; the expression levels of SMO， GLI1 and EMT-related proteins in the hypoxia group were higher than those in the inhibitor-treated group and the control group（P<0.05）; the results of BrdU-ELISA showed that the cell proliferation rate in the hypoxia combined with inhibitor-treated group at different time points was lower than that in the hypoxia group， but was higher than that in the inhibitor-treated group and control group（P<0.05）; Transwell test results showed that the cell invasion rate in the hypoxia combined with inhibitor-treated group was lower than that in the hypoxia group， but was significantly higher than that in the inhibitor-treated group and control group（P<0.05）; the cell invasion rate in the hypoxia group was higher than that in the inhibitor-treated group and control group（P<0.05）. Conclusion Hedgehog pathway may participate in the occurrence and development of EMT through SMO and GLI1 regulations， which play important roles in hypoxia-induced glioma metastasis and can provide a new target for the treatment of glioma metastasis.

[Key words] Hedgehog pathway; Smoothened; Glioma-associated oncogene homologous protein 1; Epithelial mesenchymal transformation; Hypoxia-induced; Glioma metastasis

膠質(zhì)瘤是臨床常見的惡性腫瘤，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中較為常見，占顱腦腫瘤的35.26%～60.96%，其發(fā)病率占腦腫瘤首位，死亡率居第二位[1]。由于膠質(zhì)瘤具有高浸潤生長的生物學特性，導致手術無法保證腫瘤的完全切除，術后復發(fā)率近90.0%，且隨著手術次數(shù)、復發(fā)次數(shù)的增加，惡性程度具有增加趨勢。缺氧是腫瘤微環(huán)境的基本特征之一，能促進腫瘤侵襲和轉移作用[2-3]。臨床研究顯示，介導缺氧應答的主要轉錄因子-缺氧誘導因子1α（HIF-α）在腦膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中過表達，且與腦膠質(zhì)瘤的轉移、預后有關[4-5]。上皮間質(zhì)轉化（EMT）是將具有極性的上皮細胞轉換成具有活性能力、能在細胞基質(zhì)間自由移動的間質(zhì)細胞的過程[6]。Suh[7]的研究表明，Hedgehog通路中的鋅指轉錄因子GLI1及上游轉膜蛋白SMO亦是上述缺氧/JDAC3調(diào)節(jié)的靶基因，哺乳動物Hedgehog通路由三種HH配體激發(fā)，能與受體轉膜蛋白Patched1（PTCH1）結合，從而阻斷PTCH1對轉膜蛋白SMO的抑制功能，釋放SMO活性，實現(xiàn)下游靶基因的調(diào)控作用[8-9]。因此，本研究以腦膠質(zhì)瘤細胞為研究對象，探討Hedgehog通路在缺氧誘導腦膠質(zhì)瘤轉移中的作用及分子機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年1月～2019年8月浙江省立同德醫(yī)院腦膠質(zhì)瘤患者5例。取其腦膠質(zhì)瘤細胞，隨機均分為對照組、抑制劑處理組、乏氧組和乏氧加抑制劑處理組。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 材料與設備? 胎牛血清RMPI-1640培養(yǎng)基（美國HyClone公司）、小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、Transwell小室（美國Becton Dickinson）、人工基質(zhì)膠Mateigel（美國Becton Dickinson）、青/鏈霉素，RIPA裂解液、BCA法蛋白濃度測定試劑盒（碧云天公司）。

1.2.2 細胞處理[10-11]? 取腦膠質(zhì)瘤細胞，將細胞接種在濃度為10.0%的胎牛血清RMPI-1640培養(yǎng)基中，放置在37℃、濃度為5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合80.0%以上時，開始傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)前去除原培養(yǎng)液，并利用PBS緩沖液連續(xù)進行2次漂洗。向獲得的溶液中加入濃度為0.25%的胰蛋白酶消化液進行消化，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，待細胞回縮、變圓后，將消化液吸出，并加入完全培養(yǎng)液終止消化。利用吸管反復、輕柔吹打培養(yǎng)瓶底，使細胞充分脫離瓶壁。取細胞懸液15 mL放置在離心管中，連續(xù)進行8 min離心，離心速度1000 rpm，去除上清液;向獲得的細胞懸液中加入完全培養(yǎng)基重懸細胞，以1∶2進行傳代培養(yǎng)，每3天換液一次，待細胞融合90.0%時再次傳代，取第三代對數(shù)生長的細胞，將其隨機分裝在不同的試管中進行分組。對照組不采取任何措施處理及干預，向細胞中加入培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng)，連續(xù)完成48 h培養(yǎng);抑制劑處理組在常規(guī)培養(yǎng)24 h后加入SANT1、GANT61處理48 h;乏氧組在收細胞前24 h由常規(guī)培養(yǎng)改為低氧（1%O2）培養(yǎng)，連續(xù)完成48 h培養(yǎng);乏氧加抑制劑處理組在低氧培養(yǎng)24 h后加抑制劑處理48 h。各組細胞處理后放置在培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱為37℃、5%CO2、飽和濕度[12]。

1.2.3 檢測方法? （1）典型基因標志表達：采用Western blot檢測各組細胞Smoothened（SMO）、神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關癌基因同源蛋白1（GLI1）和上皮間質(zhì)轉化（EMT）標志蛋白E-cadherin表達[13]。具體步驟包括：①蛋白質(zhì)的提取;②蛋白質(zhì)SDS-PAGE凝膠電泳;③蛋白質(zhì)轉印;④封閉;⑤一抗、二抗孵育;⑥顯影。將最終處理后的PVDF膜，以β-actin作為內(nèi)參物，根據(jù)正確的位置、方法放置在發(fā)光板（蛋白面板）上，并加入少許發(fā)光液，選擇合適的曝光條件，完成顯影并保存。（2）細胞增殖：采用BrdU-ELISA法檢測細胞增殖。取各組干預后12、24、36及48 h的細胞，以20 000/孔培養(yǎng)在96孔細胞培養(yǎng)板中，以梯度濃度CWE完成72 h處理，根據(jù)BrdU試劑盒說明，完成細胞的固定、沖洗，加入相應的抗體、洗滌后顯色，在微孔板分光光度計上以450 nm波長度數(shù)進行測定[14]。（3）細胞侵襲能力：采用Transwell法檢測細胞侵襲能力。取各組干預后的細胞，以1×105個/孔的密度接種在24孔板Transwell中，每孔中設置復孔5個，并且在上室加入200 μL DMEM∶F12培養(yǎng)基、下室加入600 μL DMEM∶F12培養(yǎng)基，并在37℃細胞培養(yǎng)箱中連續(xù)完成48 h培養(yǎng)，吸取下室中培養(yǎng)液，加入結晶紫染色液100 μL/孔，連續(xù)完成10 min染色，染色完畢后采用PBS進行2次洗滌，400倍顯微鏡下連續(xù)統(tǒng)計5個視野的細胞并取平均值[15]。

1.3觀察指標

①典型基因表達：記錄乏氧加抑制劑處理組、乏氧組、抑制劑處理組、對照組各典型基因的表達水平。②增殖率：記錄各組干預后12、24、36及48 h的細胞增殖率。③細胞侵襲率：記錄各組細胞干預后12 h的細胞侵襲率。

1.4 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)應用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料用（x±s）表示，采用t檢驗;計數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組典型基因標志表達比較

Westernblot檢測結果顯示，乏氧加抑制劑處理組SMO、GLI1及EMT相關蛋白E-cadherin表達水平分別為（0.32±0.05）、（0.41±0.08）、（0.35±0.06），低于乏氧組的（0.78±0.12）、（0.80±0.14）、（0.79±0.13），低于抑制劑處理組的（0.57±0.11）、（0.62±0.14）、（0.59±0.12），低于對照組的（0.60±0.13）、（0.69±0.16）、（0.67±0.15），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;乏氧組SMO、GLI1及EMT相關蛋白E-cadherin表達水平高于抑制劑處理組與對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1、圖1。

2.2 各組細胞增殖率比較

BrdU-ELISA法結果顯示，乏氧加抑制劑處理組不同時間點細胞增殖率低于乏氧組，高于抑制劑處理組與對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;乏氧組不同時間點細胞增殖率高于抑制劑處理組與對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3各組細胞侵襲率比較

Transwell法檢測結果顯示，乏氧加抑制劑處理組細胞侵襲率為（58.56±5.67）%，低于乏氧組的（78.57±6.83）%，但明顯高于抑制劑處理組的（27.58±5.31）%與對照組的（37.59±7.21）%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;乏氧組細胞侵襲指數(shù)高于抑制劑處理組與對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是由大腦和脊髓膠質(zhì)細胞癌變產(chǎn)生的、最常見的原發(fā)性顱腦惡性腫瘤，其發(fā)病率占顱內(nèi)腫瘤的35.2%～61.0%，主要由膠質(zhì)細胞演化而來，具有發(fā)病率高、復發(fā)率高及死亡率高等特點，影響患者的健康和生活。缺氧是腦膠質(zhì)瘤轉移的基本特征，持續(xù)的缺氧能促進腫瘤侵襲與轉移[16]。而介導缺氧應答的主要轉錄因子在腦膠質(zhì)瘤中呈高表達，其表達水平與腦膠質(zhì)瘤的轉移、預后存在相關性[17]。目前，臨床對于腦膠質(zhì)瘤的病因尚未明確，可能與腫瘤本身存在緊密聯(lián)系，其中主要包括病毒感染、化學、電磁輻射及環(huán)境等因素。臨床研究顯示，HIF-1α/HIF-1β轉錄復合體的穩(wěn)定與活化激活下游靶基因，調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖、血管生成及上皮間質(zhì)轉化（EMT），能促進腫瘤的轉移[18]。本研究中Westernblot檢測結果顯示，乏氧加抑制劑處理組SMO、GLI1及EMT相關蛋白E-cadherin表達水平低于乏氧組、抑制劑處理組與對照組（P<0.05），乏氧組SMO、GLI1及EMT相關蛋白E-cadherin表達水平高于抑制劑處理組與對照組（P<0.05），說明Hedgehog通路在腦膠質(zhì)瘤轉移中呈高表達，且乏氧狀態(tài)下腫瘤轉移率最高，能加劇腫瘤的轉移。Hedgehog通路最早在研究果蠅基因突變時被發(fā)現(xiàn)，在脊椎動物中其信號通路成員較多，如膜受體Ptch、配體Hh、Smo及下游轉錄因子Gli。當配體處于功能狀態(tài)時，Shh、Ptch結合接觸，能抑制Smo受體，從而引起下游轉錄因子激活，能促進細胞的增殖激活。而當配體處于無功能狀態(tài)時，Ptch對受體能發(fā)揮良好的抑制作用，引起Gli發(fā)生水解、失效。因此，激活Hh對配體的發(fā)育具有重要的作用。本研究中BrdU-ELISA法的結果顯示，乏氧加抑制劑處理組不同時間點細胞增殖率低于乏氧組，高于抑制劑處理組與對照組（P<0.05），說明乏氧能促進腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖，而給予細胞抑制劑，則能在一定程度上抑制細胞的增殖。楊寧等[19]的研究結果顯示，N-Shh能刺激腦膠質(zhì)瘤細胞的侵襲、轉移，而Hh信號通路特異性阻斷劑的干預可降低細胞的侵襲和轉移。本研究中Transwell法檢測結果顯示，乏氧加抑制劑處理組細胞侵襲率低于乏氧組，但明顯高于抑制劑處理組與對照組（P<0.05），乏氧組細胞侵襲率高于抑制劑處理組與對照組（P<0.05），說明乏氧加抑制劑處理能降低腦膠質(zhì)細胞的侵襲和轉移，而乏氧則能促進腦膠質(zhì)細胞的侵襲。姚軍利等[20]的研究顯示，阻斷Hh信號通路能抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的侵襲，可能與Glil抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達有關，從而抑制腫瘤的侵襲和轉移。

綜上所述，Hedgehog通路可能通過SMO、GLI1調(diào)控EMT，參與疾病的發(fā)生、發(fā)展，在缺氧誘導腦膠質(zhì)瘤轉移中發(fā)揮重要的作用，能為腦膠質(zhì)瘤轉移治療提供新的靶點。

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（收稿日期：2019-12-09）