多參數(shù)預(yù)測人巨細(xì)胞病毒臨床病毒株UL145基因B細(xì)胞表位

伍苑賓 胡兢晶 王波 蘇海浩 譚琪琪

[摘要] 目的 應(yīng)用多參數(shù)預(yù)測及分析人巨細(xì)胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）臨床病毒株UL145基因B細(xì)胞表位。 方法 根據(jù)人巨細(xì)胞病毒UL145基因氨基酸序列預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)，結(jié)合跨膜結(jié)構(gòu)、親水性、可及性及抗原性方案等參數(shù)綜合預(yù)測UL145基因B細(xì)胞表位。 結(jié)果 HCMV pUL145氨基酸等電點(diǎn)為6.64，二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷為主，1～130位氨基酸均為膜外區(qū)域，結(jié)合多種預(yù)測方法分析提示，88～99位氨基酸序列內(nèi)可作為HCMV UL145基因的B細(xì)胞候選表位。 結(jié)論 多參數(shù)預(yù)測提示88～99位氨基酸序列為HCMV UL145基因B細(xì)胞表位預(yù)測序列，為進(jìn)一步制備相應(yīng)的抗體提供了重要依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 人巨細(xì)胞病毒;UL145;B細(xì)胞表位;生物信息學(xué)分析

[中圖分類號] R39;R71? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）35-0027-04

[Abstract] Objective To predict and analyze B cell epitope of UL145 gene of human cytomegalovirus （HCMV） clinical strain by using multi-parameter method. Methods According to the amino acid sequence of HCMV UL145 gene， the secondary structure was predicted. Combined with transmembrane structure， hydrophilicity， accessibility， antigenicity scheme and other parameters， the B cell epitope of UL145 gene was predicted comprehensively. Results The amino acid isoelectric point of HCMV pUL145 was 6.64， the secondary structure was dominated by random curling， and amino acids 1-130 were all extra-membranous regions. Combined with various prediction methods， it was suggested that amino acid sequences at positions 88-99 could be used as B cell candidate epitopes of HCMV UL145 gene. Conclusion Multi-parameter prediction indicates that the amino acid sequences at positions 88-99 are predicted sequences of B cell epitopes of HCMV UL145 gene， which provide an important basis for further preparation of corresponding antibodies.

[Key words] Human cytomegalovirus; UL145; B cell epitope; Bioinformatics analysis

人巨細(xì)胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）屬皰疹病毒β亞科，為雙鏈DNA病毒，在多數(shù)人群中為隱性感染或潛伏感染，但在新生嬰兒、免疫低下或抑制的人群中可引起癥狀性感染，可導(dǎo)致較高的死亡率[1]。HCMV是新生兒最常見的病原體，也是宮內(nèi)感染的常見病原體，約0.5%的嬰兒會感染HCMV，其中有8%～10%的嬰兒在出生后出現(xiàn)癥狀性感染，感染后患兒可出現(xiàn)黃疸、肝脾腫大、發(fā)育延遲等臨床癥狀，并且對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成不可逆損傷，如感音神經(jīng)性聽力損失、小頭畸形及腦癱[2]。且有研究顯示，HCMV感染與動脈粥樣硬化、格林-巴利綜合征、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及癌癥的發(fā)生相關(guān)[3]。目前治療HCMV感染的藥物主要有更昔洛韋（GCV）、膦甲酸鈉（PFA）、纈更昔洛韋（VCG），但由于耐藥性及其毒副作用，在臨床上應(yīng)用具有一定的限制[4]。疫苗方面，在最近的Ⅱ期臨床試驗中，以水包油乳MF59佐劑（gB/MF59）配制的重組gB疫苗產(chǎn)生的抗體效價與自然感染所產(chǎn)生的效價相當(dāng)。然而，該疫苗在預(yù)防HCMV血清學(xué)陰性的婦女感染及減輕移植受體者的病毒血癥方面僅顯示出中等效力[5-6]。

HCMV基因組大小約為236 kb，編碼750個開放閱讀框（ORF）[7]。研究發(fā)現(xiàn)，與實驗室AD169病毒株相比，HCMV臨床病毒株存在一個包含至少有19個ORF的UL/B'區(qū)域，其大小約為15 kb[8]，而AD169病毒株中并不存在此區(qū)域，并且有研究表明，HCMV UL/B'區(qū)域內(nèi)的基因具有調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能，從而實現(xiàn)免疫逃避[9]。這些研究顯示，此區(qū)域內(nèi)的基因功能可導(dǎo)致HCMV產(chǎn)生致病性感染。目前已有發(fā)現(xiàn)UL148與HCMV免疫逃避有關(guān)[10-11]，UL146能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的趨化[12]，但UL145基因功能仍不明確。課題組前期已對UL145基因進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)其基因及編碼的氨基酸序列極為保守，存在多個翻譯后修飾位點(diǎn)，因此，UL145基因可能在感染或免疫逃避過程中起重要作用[13]。本研究通過應(yīng)用多參數(shù)預(yù)測UL145基因抗原表位，為研究其蛋白功能提供基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

HCMV UL145氨基酸序列：檢索自NCBI數(shù)據(jù)庫臨床低傳代HCMV D3病毒株，序列號為DQ180367.1。D3病毒株為本課題組前期對UL145基因全序列進(jìn)行了測序研究，提交給GenBank并被收錄。

1.2 方法

1.2.1 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測? 對UL145二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷區(qū)域作為預(yù)測區(qū)域。

1.2.2 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測? 對UL145進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，非跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域作為預(yù)測區(qū)域。

1.2.3 親水性、可及性、極性、柔韌性、抗原性參數(shù)預(yù)測? 選取多參數(shù)進(jìn)行綜合分析，以高于閾值的區(qū)域作為候選表位。

1.2.4 綜合分析? 通過在線軟件預(yù)測抗原性區(qū)域;同時結(jié)合吳玉章等[14]建立的抗原指數(shù)分析UL145基因的B細(xì)胞候選表位。

2 結(jié)果

2.1 pUL145氨基酸序列分析

pUL145包含130個氨基酸殘基，PI為6.64，相對分子質(zhì)量為14 KD。序列如下：MYGVLAHYYS FISSPSVMVN FKHHNAVQLL CARTRDGTTG WERLTHHASY HANYGAYAVL MATSQRKSLV LHRYSAVTAV ALQLMPVEML RKLDQSDWVR GAWIVSETFP TSDPKGFWSD DDSSMGGSDD。

2.2 pUL145二級結(jié)構(gòu)分析

結(jié)合多種預(yù)測方案，無規(guī)則卷及β-轉(zhuǎn)角區(qū)域多位于35～40、108～116、119～124位氨基酸。見圖1。

2.3 pUL145跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

1～130位氨基酸均為膜外區(qū)域，作為抗原表位預(yù)測區(qū)域。見圖2。

2.4 pUL145氨基酸的多參數(shù)預(yù)測

高于閾值4～6個氨基酸可作為候選區(qū)域。見圖3、表1。

2.5 pUL145 抗原指數(shù)預(yù)測

通過ABCpred服務(wù)器對pUL145進(jìn)行抗原指數(shù)分析，結(jié)果顯示表位區(qū)域在115～130、80～95、37～52、108～123可能性較大;結(jié)合其二級結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)域以及多參數(shù)預(yù)測，32～40、88～99、109～126區(qū)域可能為B細(xì)胞候選區(qū)域;將候選的3段區(qū)域計算各氨基酸殘基的抗原性總值，取其平均抗原指數(shù)，取分值高區(qū)域作為候選表位。可見88～99氨基酸區(qū)域分值較高，考慮pUL145 B細(xì)胞表位位于88～99位氨基酸區(qū)域內(nèi)或附近。見表2。

3 討論

在健康人群中，受自身免疫系統(tǒng)的調(diào)控，HCMV感染通常是無癥狀的。但在孕期及免疫受損的人群（如移植受體者或HIV感染者）中可能具有嚴(yán)重的致病性。HCMV的免疫調(diào)控通過下調(diào)人類白細(xì)胞抗原（HLA）-Ia分子，使被感染的細(xì)胞無法被T細(xì)胞識別從而形成免疫逃避[15]。UL/b'區(qū)編碼多種干擾NK細(xì)胞識別的免疫逃避蛋白，例如UL135可破壞免疫突觸，UL141和UL142可阻止NK細(xì)胞活化配體的表達(dá)[16]，UL148通過下調(diào)MICA，從而避免NK細(xì)胞殺死HCMV感染的細(xì)胞[17]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，UL145基因及其序列極為保守，一般保守基因與病毒生存關(guān)系更為密切，但關(guān)于其相關(guān)的功能研究較少。

B細(xì)胞表位（B cell epitope）是能被B細(xì)胞抗原受體或抗體特異性識別并相互結(jié)合的特殊化學(xué)基團(tuán)，是引起免疫應(yīng)答和免疫反應(yīng)的基本單位。目前B細(xì)胞表位在疾病的診斷及疫苗開發(fā)中有一定的優(yōu)勢?？乖砦豢煞譃锽細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞表位;并且根據(jù)表位結(jié)構(gòu)的不同可分為連續(xù)性及不連續(xù)性表位[18]。B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測方法有肽探針掃描技術(shù)、蛋白質(zhì)“切割”法、噬菌體展示技術(shù)等[19]，但總體這些方法具有昂貴、費(fèi)時及準(zhǔn)確率低等劣勢。目前已經(jīng)開發(fā)了多種計算方法來輔助或替代實驗方法，包括BepiPred、DiscoTope、CBtope和ABCpred，其中ABCpred其敏感性、特異性、陽性率分別為67.14%、64.71%、65.61%[20-21]。但單參數(shù)預(yù)測方法準(zhǔn)確率不高，通過上述結(jié)果可見，各方法預(yù)測B細(xì)胞表位結(jié)果有所不同，因此，需要結(jié)合多種方法進(jìn)行綜合分析以避免局限性。

目前，B細(xì)胞表位的預(yù)測主要結(jié)合二級結(jié)構(gòu)、親水性、可及性、抗原性等進(jìn)行綜合預(yù)測。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測可見pUL145二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占33.8%，β-折疊占20.0%，無規(guī)則卷占34.6%，β-轉(zhuǎn)角占11.5%，結(jié)果以無規(guī)則卷為主;位于表面的親水性區(qū)域能更好地與抗原表位接觸;抗原與抗體結(jié)合時蛋白構(gòu)象會出現(xiàn)改變，因此抗原表位需同時具備一定的柔韌性。應(yīng)用多種方案綜合分析pUL145抗原表位，能提高正確性。

目前，對UL145基因所編碼的蛋白功能及在HCMV感染中的作用研究較少。通過對UL145氨基酸序列進(jìn)行多參數(shù)預(yù)測，各方案預(yù)測的候選表位存在差異性。對各方案進(jìn)行綜合分析，可見3段候選表位，分別為32～40、88～99、109～126區(qū)域。將這3段潛在的抗原表位通過抗原指數(shù)法分析，認(rèn)為HCMV UL145 B細(xì)胞抗原表位存在于88～99位氨基酸區(qū)域內(nèi)，為研究UL145基因功能提供了重要依據(jù)。

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（收稿日期：2020-07-07）