基于微生物群體感應(yīng)的固定化研究進(jìn)展

陳天鵬，朱家慶，柳 東,3，陳 勇,3，應(yīng)漢杰,3

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.南京工業(yè)大學(xué) 國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 211800；3.江蘇先進(jìn)生物與化學(xué)制造協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 211800)

20世紀(jì)40年代，發(fā)酵工業(yè)研究者建立了深層液體培養(yǎng)的現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)[1]，然而有關(guān)微生物催化反應(yīng)體系方面的研究在近幾十年來(lái)始終未有突破性進(jìn)展。液體深層發(fā)酵依然存在如機(jī)械性損傷、液體環(huán)境不適、細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定性差、易發(fā)生細(xì)胞衰亡和自溶等現(xiàn)象，致使生物催化劑的使用壽命難以取代化學(xué)催化劑，這也是目前生物發(fā)酵工業(yè)難以替代化學(xué)制造的主要瓶頸之一。

借鑒醫(yī)學(xué)中致病菌會(huì)在醫(yī)療器械等處形成強(qiáng)抗逆性生物膜，結(jié)合筆者前期研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，EPS(extracellular polymeric substances)體系中細(xì)胞自增殖、自修復(fù)和抗衰老能力在實(shí)現(xiàn)高效連續(xù)化生產(chǎn)過(guò)程中起著重要作用，細(xì)胞顯示出集群效應(yīng)、生命周期得到延長(zhǎng)和抗逆性增強(qiáng)等特性。基于此現(xiàn)象，開(kāi)發(fā)并建立以微生物集群效應(yīng)形成EPS的固定化發(fā)酵系統(tǒng)并應(yīng)用于多種化學(xué)品的生物制造將具有十分重要的意義。

本文中，筆者將重點(diǎn)敘述以EPS為催化劑的固定化發(fā)酵研究進(jìn)展，尋找出生物膜形成的調(diào)控因子，重點(diǎn)闡述生物膜形成過(guò)程中基于信號(hào)分子介導(dǎo)的集群效應(yīng)，為解決固定化發(fā)酵中出現(xiàn)的耐受性差和細(xì)胞易衰老等問(wèn)題提供新的途徑。

1 固定化發(fā)酵技術(shù)概述

固定化技術(shù)包括固定化酶技術(shù)和固定化細(xì)胞技術(shù)。固定化酶技術(shù)是通過(guò)物理或化學(xué)的方式將酶附著或封閉在不同基質(zhì)材料的表面或內(nèi)部的技術(shù)。酶固定化以后，一般情況下其活性和穩(wěn)定性會(huì)提高。通常固定化載體含有多孔的結(jié)構(gòu)，能為附著的細(xì)胞提供一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的催化環(huán)境，有利于菌體的生長(zhǎng)和繁殖。固定化載體主要分為兩大類，一類是無(wú)機(jī)載體，如硅藻土、活性炭等；另一類是有機(jī)載體，包含天然凝膠載體和有機(jī)合成高分子凝膠載體。固定化細(xì)胞技術(shù)主要是通過(guò)將細(xì)胞約束在一定的空間范圍內(nèi)，使其既可以保持原有的催化活性，又可以被循環(huán)回收使用。目前，固定細(xì)胞的方法根據(jù)細(xì)胞固定原理的不同，主要分為四類：共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法和吸附法[4]。Talabardon等[5]和Hui等[6]通過(guò)物理方法如吸附法和包埋法將真菌細(xì)胞固定在載體表面，證實(shí)可以高效分泌蛋白；Abdella等[7]在旋轉(zhuǎn)纖維床生物反應(yīng)器中采用重復(fù)批次發(fā)酵生產(chǎn)β-1,4葡萄糖苷酶最高產(chǎn)率達(dá)1.178 U/(mL·d)。

盡管材料和機(jī)械等行業(yè)的發(fā)展促使發(fā)酵裝備和控制系統(tǒng)技術(shù)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但是由于固定化細(xì)胞存在的天然缺陷，細(xì)胞易出現(xiàn)機(jī)械性損傷、穩(wěn)定性差和自溶等現(xiàn)象。自然界中，微生物在合適的固體表面集聚可產(chǎn)生群體效應(yīng)，形成生物膜，以提高其整體適存能力，因此，解決此問(wèn)題的最好辦法是向自然界學(xué)習(xí)。

2 生物膜概述

生物膜(biofilm)是一種復(fù)雜的細(xì)胞群落，是細(xì)胞與細(xì)胞或非生物表面的相互關(guān)聯(lián)[8]。在自然界中，90%微生物都可以形成生物膜，并且在極端條件下，微生物也具有生存能力，這些微生物具有較強(qiáng)的耐受性、抗逆性，在營(yíng)養(yǎng)匱乏時(shí)也能生存繁殖。在宏觀上，生物膜可看成是一層薄的黏液，它們具有獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)，是由細(xì)胞外基質(zhì)形成的復(fù)雜的生物聚集體[2，8]。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，生物膜已被證實(shí)與醫(yī)療器械的污染相關(guān)聯(lián)，從而導(dǎo)致各種疾病的產(chǎn)生和感染[9]。借鑒醫(yī)學(xué)領(lǐng)域生物膜感染的現(xiàn)象，通過(guò)對(duì)生物膜感染的細(xì)胞機(jī)制的研究，同時(shí)發(fā)現(xiàn)生物膜對(duì)發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中固定化細(xì)胞具有重要作用，細(xì)菌生物膜的相關(guān)研究將越來(lái)越受到重視。

生物膜的形成是一種動(dòng)態(tài)的過(guò)程，在各個(gè)時(shí)期中，微生物表現(xiàn)出不同的存在形式，通過(guò)觀察生物膜的整個(gè)形成過(guò)程，Sauer等[10]將其分成5個(gè)階段。①初始黏附期：微生物細(xì)胞可逆地附著在非生物或細(xì)胞表面，通過(guò)菌毛、黏附素類的物質(zhì)相互關(guān)聯(lián)；②生長(zhǎng)固著期：微生物細(xì)胞不可逆地附著在非生物或細(xì)胞表面，主要由胞外聚合物介導(dǎo)并與之相關(guān)聯(lián)；③立體時(shí)空發(fā)展期：生物膜的早期發(fā)展成熟階段，可以發(fā)現(xiàn)形成片狀的生物膜，所占據(jù)的空間位置擴(kuò)大，形成三維空間結(jié)構(gòu)；④成熟期：生物膜的完全成熟階段，在此過(guò)程中可以看到形成許多菌落，生物膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對(duì)外界環(huán)境的抗逆性增強(qiáng)；⑤分散瓦解期：分散階段，受到外界環(huán)境如營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH和細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)途徑的調(diào)控，生物膜破裂，單個(gè)細(xì)胞從聚集的群體中分散出來(lái)，回到最初的游離狀態(tài)。有的假說(shuō)認(rèn)為分散出來(lái)的細(xì)胞們繼續(xù)尋找合適的生存環(huán)境，進(jìn)一步形成生物膜；而另一種假說(shuō)認(rèn)為分散出來(lái)的細(xì)胞已經(jīng)完成它們的職責(zé)，自動(dòng)結(jié)束生命過(guò)程，進(jìn)入細(xì)胞凋亡狀態(tài)[11]。因此，生物膜形成固有的三維空間結(jié)構(gòu)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，涉及協(xié)調(diào)一系列的信號(hào)分子過(guò)程，包括細(xì)胞的黏附、聚集的細(xì)胞與細(xì)胞之間生存區(qū)域的擴(kuò)張。

3 固定化細(xì)胞技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用

細(xì)胞固定化技術(shù)可使高活性菌體細(xì)胞聚集于特定空間并且快速生長(zhǎng)繁殖，形成高強(qiáng)度催化體系，由此，發(fā)酵速度加快，產(chǎn)品得率提高。尤業(yè)兵等[12]采用海藻酸鈣凝膠顆粒固定化酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇發(fā)現(xiàn)，乙醇收率隨凝膠顆粒通透性的增加而增加，最終確定采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.45%的海藻酸鈉和17.45%的CaCl2，固定時(shí)間為1.09 h時(shí)，固定化酵母的乙醇收率達(dá)到24.1%，相較于游離酵母提高20%以上。海藻酸鈣作為一種優(yōu)良的固定化載體，同樣還可應(yīng)用于乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。Givry等[13]采用海藻酸鈣固定化發(fā)酵乳桿菌的策略生產(chǎn)乳酸，以半纖維素水解液為碳源，最終得到乳酸62.77 g/L，相較于游離細(xì)胞發(fā)酵提高了50%以上，收率也提高了76%，達(dá)到0.83 g/g；Shen等[14]以海藻酸鈉凝膠小球固定化德氏乳桿菌發(fā)酵纖維素水解液生產(chǎn)乳酸，最終獲得乳酸48.7 g/L，乳酸/葡萄糖的收率達(dá)到95.2%。宋威等[15]以海藻酸鈉與聚乙烯醇混合制備高性能固定化載體，并確定當(dāng)其比例為1∶ 2時(shí)，固定化細(xì)胞力學(xué)強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性達(dá)到最佳，在50 d內(nèi)發(fā)酵的20個(gè)批次中，核酸酶P1酶活性穩(wěn)定，保持在460 U/mL以上。

基于微生物集群效應(yīng)開(kāi)發(fā)的生物膜固定化技術(shù)是一種新型的吸附法。細(xì)胞吸附于載體后大量增殖，形成密集的菌群，進(jìn)而顯示出集群效應(yīng)。集群效應(yīng)使群體成員之間實(shí)現(xiàn)生理協(xié)同作用，提高整個(gè)種群的代謝活力和生存能力[16]。生物膜固定化方法克服了包埋、交聯(lián)和共價(jià)結(jié)合法的缺點(diǎn)，既能使細(xì)胞聚集發(fā)揮作用，又不會(huì)對(duì)細(xì)胞本身的活性產(chǎn)生影響。Xue等[17]以纖維基質(zhì)為固定化發(fā)酵載體，將拜氏梭菌CC101固定于其上，采取固定化耦合丁醇吸附分離工藝，發(fā)酵液中獲得了54.6 g/L的丁醇，丁醇產(chǎn)率為0.45 g/(L·h)，且經(jīng)后續(xù)分離后獲得640 g/L的高濃度丁醇溶液；Xue等[18]還利用生物膜固定化發(fā)酵的原理，以丙丁梭菌JB200為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)78 h的發(fā)酵，丁醇達(dá)到19.1 g/L，葡萄糖消耗量為86.4 g/L，丁醇收率為0.21 g/g；Qureshi等[19]將拜式梭菌BA101固定于黏土磚顆粒上，生產(chǎn)效率達(dá)到15.8 g/(L·h)；Liu等[3]借助于丙酮丁醇梭菌能夠吸附到載體形成生物膜的特性生產(chǎn)丁醇，提高細(xì)胞對(duì)丁醇的耐受性和產(chǎn)率，在重復(fù)批次發(fā)酵12 h內(nèi)，丁醇平均質(zhì)量濃度達(dá)到15.6 g/L，總?cè)軇┊a(chǎn)率1.88 g/(L·h)。通過(guò)篩選出相應(yīng)的固定化載體，結(jié)合增強(qiáng)微生物形成生物膜的特點(diǎn)，可解決固定化細(xì)胞存在的諸如機(jī)械性損傷、穩(wěn)定性差和自溶等天然缺陷的問(wèn)題，對(duì)推動(dòng)工業(yè)產(chǎn)品的高效清潔生產(chǎn)具有重要意義。

4 生物膜形成的調(diào)控因素

4.1 環(huán)境信號(hào)調(diào)控生物膜的形成

微生物生物膜的形成和擴(kuò)散總是伴隨著碳源和能量的消耗，微生物能感受環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)種類和數(shù)量并對(duì)其做出反應(yīng)。一些環(huán)境因子諸如葡萄糖、金屬離子、氣體分子NO等均能對(duì)生物膜的形成產(chǎn)生影響。

4.1.1 營(yíng)養(yǎng)信號(hào)

葡萄糖是最易被微生物吸收與利用的碳源，對(duì)于金黃色葡萄球菌、鏈球菌和霍亂弧菌等來(lái)說(shuō)，適當(dāng)濃度的葡萄糖恰恰也是形成生物膜的強(qiáng)誘導(dǎo)劑[20]。在葡萄球菌中，培養(yǎng)環(huán)境中的葡萄糖通過(guò)誘導(dǎo)糖鏈合成基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胞外線性葡聚糖物的合成，最終增強(qiáng)生物膜形成能力[21]。當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖過(guò)剩時(shí)，細(xì)胞中成膜的抑制因子被激活，生物膜的形成能力減弱；當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖不足時(shí)，生物膜形成能力增強(qiáng)，即貧營(yíng)養(yǎng)環(huán)境能夠誘導(dǎo)微生物形成生物膜。再者，如釀酒酵母的生物膜形成過(guò)程受到葡萄糖的抑制[22]，銅綠假單胞菌培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)含量減少到最優(yōu)培養(yǎng)基的10%時(shí)，能夠誘導(dǎo)胞外多糖的合成，進(jìn)而促進(jìn)形成生物膜[23]。

4.1.2 金屬離子

環(huán)境中常見(jiàn)的金屬離子也會(huì)影響生物膜的形成。比如對(duì)于某些微生物，鐵離子是其代謝途徑中必不可少的微量元素，但在成膜過(guò)程中的作用卻不盡相同。在金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基中添加10 μmol/L鐵離子會(huì)抑制其生物膜的形成[24]，但是對(duì)于表皮葡萄球菌，在低濃度鐵離子環(huán)境下，生物膜形成能力反而增強(qiáng)[25]。因此，環(huán)境中的金屬離子對(duì)微生物成膜能力發(fā)揮重要作用。

4.1.3 信號(hào)分子

微生物能夠感受一些氣體信號(hào)分子，NO可以調(diào)節(jié)微生物復(fù)雜的生理功能，不同濃度的NO對(duì)生物膜形成的影響不同[26]。高于3×10-7mol/L的NO濃度能夠顯著增強(qiáng)亞硝化單胞菌生物膜的形成，當(dāng)NO濃度低于5×10-6mol/L時(shí)，浮游細(xì)胞的增多導(dǎo)致生物膜的消散[27]。隨著NO濃度的升高，假單胞菌鞭毛以及鞭毛組裝蛋白表達(dá)水平上調(diào)，從而增強(qiáng)了其生物膜的形成[28]。Yang等[29]通過(guò)觀察低濃度NO對(duì)釀酒酵母生物膜形成的影響，確定了添加低濃度的NO供體可以促進(jìn)固定化載體中釀酒酵母的生物膜形成，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，生物膜的形成促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)乙醇的耐受性，為基于酵母生物膜形成的乙醇連續(xù)批次發(fā)酵工藝提供理論支持。除此以外，NO還能通過(guò)影響二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶的相對(duì)活性調(diào)控胞內(nèi)環(huán)二鳥(niǎo)苷酸(c-di-GMP)的水平，例如在NO作用下，假單胞菌中的趨化轉(zhuǎn)導(dǎo)子BdlA誘導(dǎo)分解c-di-GMP的磷酸二酯酶的表達(dá)，促進(jìn)其分解，從而調(diào)控生物膜的擴(kuò)散[30]。

由于自然環(huán)境的復(fù)雜性，目前對(duì)環(huán)境因子誘導(dǎo)生物膜形成的研究較少，大多數(shù)研究?jī)H停留在發(fā)現(xiàn)某種環(huán)境因子誘導(dǎo)生物膜相關(guān)基因的表達(dá)。深入研究特定環(huán)境因子及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)通路，將為生物膜的防控和利用奠定理論基礎(chǔ)。

4.2 群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控生物膜的形成

微生物在合適的固形物表面集聚即可產(chǎn)生群體效應(yīng)，以提高其整體的適應(yīng)生存能力。研究發(fā)現(xiàn)，微生物在固體表面吸附聚集后，會(huì)合成大量多糖、蛋白等胞外聚合基質(zhì)——EPS，從而將自身細(xì)胞包埋其中，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞群落在固體介質(zhì)表面的長(zhǎng)期定植[9]。EPS為細(xì)胞隔離外界毒性物質(zhì)提供了一道天然屏障，提高了EPS中微生物細(xì)胞的抗逆能力，因此，細(xì)胞在EPS中能夠大量增殖形成密集的菌群進(jìn)而展示集群效應(yīng)[31-33]。近年來(lái)的大量研究均致力于削弱一些致病微生物如致病性大腸桿菌和銅綠假單胞菌的群體效應(yīng)，以消除生物膜的形成，這也解釋了微生物形成生物膜對(duì)治療藥物和宿主免疫反應(yīng)的抵抗性[34-35]。在真菌中，群體感應(yīng)被證實(shí)參與單細(xì)胞和絲狀生長(zhǎng)之間的轉(zhuǎn)換[36]。在釀酒酵母中，芳香醇如苯乙醇通過(guò)Ras-cAMPK蛋白激酶Tpk2p誘導(dǎo)FLO11表達(dá)[37]，進(jìn)而誘導(dǎo)其生長(zhǎng)富集；β-吲哚乙醇通過(guò)誘導(dǎo)FLO1表達(dá)使菌體絮凝[38]。此外，芳香醇也會(huì)刺激其他轉(zhuǎn)錄因子如Mig1p和Cat8p，進(jìn)而調(diào)控不同的脅迫反應(yīng)，使基于群體感應(yīng)效應(yīng)的高密度酵母發(fā)酵可以表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性和催化活性[39]。微生物間通過(guò)分泌、釋放一些特定的信號(hào)分子感知濃度變化，檢測(cè)菌群密度、調(diào)控菌群生理功能，除了芳香醇介導(dǎo)的群體感應(yīng)之外，還包括其他信號(hào)分子諸如信號(hào)分子AIP(分泌環(huán)肽)介導(dǎo)的agr群體感應(yīng)系統(tǒng)和信號(hào)分子c-di-GMP介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)。

4.2.1 附屬基因調(diào)節(jié)子agr群體感應(yīng)

agr(accessory gene regulator)系統(tǒng)是革蘭氏陽(yáng)性菌中的群體感應(yīng)系統(tǒng)，由RNAII和RNAIII兩個(gè)單元組成。agrD基因編碼前信號(hào)肽AIP，經(jīng)由膜蛋白AgrB剪切AgrD合成的多肽，形成長(zhǎng)度為8個(gè)氨基酸的硫內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)，成為成熟的AIP，并運(yùn)輸出細(xì)胞膜外。膜感應(yīng)蛋白AgrC和反應(yīng)調(diào)控蛋白AgrA構(gòu)成一個(gè)雙組分調(diào)控系統(tǒng)。當(dāng)胞外AIP達(dá)到一定臨界值，就可磷酸化或去磷酸化來(lái)改變AgrA活性，進(jìn)而啟動(dòng)P2啟動(dòng)子和RNAIII啟動(dòng)子P3的表達(dá)，形成一個(gè)正向的反饋循環(huán)和RNAIII的轉(zhuǎn)錄。在表皮葡萄球菌中，編碼黏附因子的基因atlE被agr群體感應(yīng)系統(tǒng)通路上調(diào)，從而增強(qiáng)了生物膜的形成[40]。agr也能夠通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白酶和DNases來(lái)影響生物膜的形成。生物膜的形成與消散模型中，第五步agr介導(dǎo)的解離需要胞外蛋白酶活性的增強(qiáng)[41]。解離也包括DNase I對(duì)eDNA的降解，而eDNA在生物膜的形成過(guò)程中起到“蜘蛛網(wǎng)”和“腳手架”的作用[42]。

4.2.2 信號(hào)分子c-di-GMP介導(dǎo)的群體感應(yīng)

第二信使c-di-GMP于1987年首次被發(fā)現(xiàn)，其功能是促進(jìn)菌體合成纖維素[43]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，c-di-GMP在細(xì)菌中普遍存在，并具有調(diào)控細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性、致病性、生物膜的形成、細(xì)胞衰亡和細(xì)胞周期等生命過(guò)程的作用[44]。c-di-GMP通過(guò)調(diào)控細(xì)菌鞭毛及菌毛蛋白的合成控制細(xì)菌游動(dòng)翻轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)等。例如高濃度的c-di-GMP會(huì)使細(xì)菌在基質(zhì)表面靜止?fàn)顟B(tài)，低濃度的c-di-GMP則促進(jìn)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)。目前廣泛認(rèn)同的調(diào)控模式為：當(dāng)胞內(nèi)c-di-GMP含量較高時(shí)，胞外多糖合成增多，細(xì)菌表面黏附特性和細(xì)胞集群性增強(qiáng)，生物膜形成增強(qiáng)；當(dāng)胞內(nèi)c-di-GMP含量較低時(shí)，菌體以浮游狀態(tài)生存[45]。

在細(xì)菌細(xì)胞中，2分子三磷酸鳥(niǎo)苷(GTP)在二鳥(niǎo)苷環(huán)化酶(DGC)的催化下合成c-di-GMP。c-di-GMP的降解則通過(guò)磷酸二酯酶(PDE)的催化重新形成2分子GTP進(jìn)行。DGC含有保守的GGDEF結(jié)構(gòu)域，而PDE含有保守的EAL或HD-GYP結(jié)構(gòu)域。其中EAL催化結(jié)構(gòu)域能將c-di-GMP降解為pGpG，隨后再被降解為2分子GMP；而HD-GYP催化結(jié)構(gòu)域能將c-di-GMP直接降解為GMP[46-47]。在對(duì)不同細(xì)菌的基因組的DGC和PDE保守結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)細(xì)菌廣泛含有多個(gè)DGC和PDE酶編碼基因，例如在大腸桿菌中有34個(gè)，沙門(mén)氏菌有27個(gè)，霍亂弧菌有63個(gè)，銅綠假單胞菌有39個(gè)，工業(yè)生產(chǎn)菌株丙酮丁醇梭菌有22個(gè)[48-49]。這可能是因?yàn)榫w的生存環(huán)境復(fù)雜時(shí)，需要更多的DGC和PDE來(lái)組合響應(yīng)不同的環(huán)境信號(hào)，進(jìn)而精確調(diào)控胞內(nèi)c-di-GMP含量，使菌體更適應(yīng)復(fù)雜的生存環(huán)境[50]。

c-di-GMP調(diào)控下游表型的方式有3種。①c-di-GMP可作為核糖開(kāi)關(guān)：它能通過(guò)直接與mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合、調(diào)控mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而控制基因的表達(dá)[51]。②c-di-GMP的受體蛋白為轉(zhuǎn)錄因子：c-di-GMP可通過(guò)直接與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的方式激活或抑制轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控轉(zhuǎn)錄的能力，從而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。如在銅綠假單胞菌中，c-di-GMP通過(guò)結(jié)合鞭毛調(diào)控蛋白FleQ，抑制了FleQ的ATP酶活性，引起其構(gòu)象的變化，使FleQ不能調(diào)節(jié)下游鞭毛基因，將細(xì)菌從浮游狀態(tài)切換至生物膜狀態(tài)[52]。鞭毛功能的抑制將穩(wěn)定細(xì)菌與介質(zhì)表面的相互作用，促進(jìn)菌體向不可逆附著的轉(zhuǎn)變，形成成熟的生物膜。③c-di-GMP的受體蛋白為激活/阻遏蛋白，通過(guò)調(diào)控其靶蛋白的活性展示其功能：在熒光假單胞菌中，當(dāng)c-di-GMP濃度較低時(shí)，蛋白酶LapG能夠剪切LapA，致使其降解，細(xì)胞失去黏附蛋白，菌體吸附能力下降，處于浮游狀態(tài)。熒光假單胞菌的細(xì)胞表面蛋白LapA是導(dǎo)致不可逆黏附的關(guān)鍵蛋白。另外有學(xué)者觀察到在銅綠假單胞菌PAO1中過(guò)表psl基因后，細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP異常升高，隨即在培養(yǎng)基中加入純化后的Psl蛋白也發(fā)現(xiàn)了這樣的現(xiàn)象，于是得出結(jié)論：Psl蛋白(而不是psl基因的表達(dá))刺激c-di-GMP的產(chǎn)生[53]。利用高分辨率顯微鏡和單細(xì)胞追蹤研究發(fā)現(xiàn)，Psl蛋白對(duì)生物膜形成的促進(jìn)作用表現(xiàn)為：促進(jìn)浮游細(xì)胞并入生物膜和/或附著于表面；維持微菌落或大菌落結(jié)構(gòu)。

目前通過(guò)細(xì)菌基因組的鑒定和比對(duì)，能夠找到相對(duì)數(shù)目較多的DGC和PDE，但是對(duì)它們所響應(yīng)的環(huán)境因子信號(hào)和胞內(nèi)交流信號(hào)還缺乏研究，并且c-di-GMP的受體蛋白較難尋找。如果能夠解決這些問(wèn)題，將有助于全面了解c-di-GMP調(diào)控生物膜形成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

5 結(jié)論與展望

1)針對(duì)生物膜固定化發(fā)酵系統(tǒng)，基于細(xì)胞和材料界面的作用機(jī)制，設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)具有更好的EPS誘導(dǎo)作用的固定化載體，從典型的真核生物如酵母和霉菌，原核生物如丙酮丁醇梭菌、大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌出發(fā)，探索不同細(xì)胞對(duì)不同介質(zhì)之間結(jié)合的設(shè)計(jì)策略；2)針對(duì)不同微生物細(xì)胞的生理特點(diǎn)，建立強(qiáng)化EPS合成、優(yōu)化其功能的分子調(diào)控方法，挖掘操縱細(xì)胞增殖的基因和蛋白；3)針對(duì)細(xì)胞間存在的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，強(qiáng)化基于EPS合成的集群效應(yīng)的可行性，實(shí)現(xiàn)EPS催化體系在多種工業(yè)化學(xué)品制造過(guò)程中的應(yīng)用。

目前對(duì)生物膜形成過(guò)程中基于信號(hào)分子介導(dǎo)的集群效應(yīng)的機(jī)制研究尚存在不足，但可以確定的是，若能從分子和代謝層面揭示生物膜體系中細(xì)胞增殖和修復(fù)的現(xiàn)象和規(guī)律，探索生物膜中信號(hào)介導(dǎo)的細(xì)胞集群效應(yīng)及其對(duì)生物催化體系的影響，將為解決固定化發(fā)酵中出現(xiàn)的耐受性差和細(xì)胞易衰老等問(wèn)題提供新的途徑，對(duì)推動(dòng)工業(yè)產(chǎn)品的高效清潔生產(chǎn)具有十分重要的意義。