米曲霉來源的環(huán)二肽對熒光假單胞菌群體感應(yīng)的抑制及其機制

丁 婷，李 勇

(北京大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 營養(yǎng)與食品衛(wèi)生系，北京 100191)

水產(chǎn)品是食品蛋白質(zhì)的重要來源，因其具有熱量低、營養(yǎng)豐富、味道鮮美、富含不飽和脂肪酸等特點，深受消費者的喜愛。但是水產(chǎn)品在運輸、加工及儲存過程中容易受到微生物污染，造成食品質(zhì)量惡化和經(jīng)濟損失[1-2]。微生物是引起食品腐敗的主要原因[3]，腐敗食品中的致病菌會引起食物中毒，給人類的生命健康帶來嚴重危害。冷藏水產(chǎn)品中部分嗜冷菌可以在低溫條件下生長，如假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、微球菌屬(Micrococcussp.)、希瓦氏菌屬(Shewanellasp.)、不動桿菌屬(Acinetobactersp.)和嗜冷桿菌屬(Psychrobactersp.)等[4-6]。它們可以將蛋白質(zhì)分解為各種有毒物質(zhì)，包括吲哚、苯酚、腐胺、尸胺、硫化氫、甲烷和氨等，并釋放異味[7]。冷藏水產(chǎn)品中最常見的假單胞菌是熒光假單胞菌(P.fluorescens)，它是一種常見的食品腐敗菌，常出現(xiàn)在牛奶、雞肉、魚類等各種冷藏食品中，是導(dǎo)致食物變質(zhì)的主要細菌[8-9]。此外，在臨床上，部分患者在接受到由熒光假單胞菌污染的血液和血液制品時，會表現(xiàn)出嚴重的臨床癥狀，如敗血癥、感染性休克和血管內(nèi)凝血等[10]。細菌依靠群體感應(yīng)來調(diào)節(jié)各種表型的表達，如毒力因子的產(chǎn)生、致病性、生物被膜的形成等[11-12]。

群體感應(yīng)(QS)是一種細胞間的通信機制，通過這種機制細菌可以監(jiān)測其種群密度并調(diào)節(jié)各種群體性行為。QS系統(tǒng)是由小分子自體誘導(dǎo)物(AIs)來介導(dǎo)的。大多數(shù)革蘭氏陰性菌利用N-乙酰高絲氨酸內(nèi)酯(AHL)作為信號分子；革蘭氏陽性菌主要由寡肽(AIP)信號分子介導(dǎo)；種間(內(nèi))信息交流主要由呋喃硼酸二酯類(AI-2)信號分子介導(dǎo)。此外，還包括喹諾酮類信號分子、擴散信號因子等[13]。熒光假單胞菌是一類革蘭氏陰性、桿狀、活動性強的細菌，能夠在多種環(huán)境中生存。群體感應(yīng)網(wǎng)絡(luò)和生物被膜的形成特性是它們在環(huán)境中作用的重要組成部分。熒光假單胞菌主要存在LuxI/R型群體感應(yīng)系統(tǒng)。在其QS通路中，信號分子AHLs是由LuxI型蛋白產(chǎn)生并與LuxR型蛋白結(jié)合，從而觸發(fā)相關(guān)基因的表達，使細菌產(chǎn)生特定的生理活動。EI-Sayed等[14]發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌P.fluorescensNCIMB 10586中存在mpuI-mpuR系統(tǒng)。這種LuxI/R型的QS系統(tǒng)調(diào)節(jié)聚酮類抗生素莫匹羅星的生物合成。Laue等[15]發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌P.fluorescensF113的QS系統(tǒng)中唯一已知的成分是AHL合成酶及其產(chǎn)生的AHLs。AHL合成酶(HdtS蛋白)與溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶家族有關(guān)，能產(chǎn)生3種AHLs：N-hexanoyl-HSL、N-(3-hydroxy-7-cis-tetradecenoyl)-HSL和N-decanoyl-HSL。Kwak等[16]研究發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌P.fluorescens2P24也具有LuxI/R型群體感應(yīng)系統(tǒng)，即PcoIR系統(tǒng)，能合成6種AHLs。近年來，AHLs介導(dǎo)的QS系統(tǒng)在食品腐敗和致病性中的作用機制受到了廣泛關(guān)注，多種化合物被確認是群體感應(yīng)抑制劑(QSIs)。QSIs能在不干擾細菌生長、誘導(dǎo)突變和產(chǎn)生抗性的前提下，有效地抑制病原菌的致病性[17]。因此，阻斷其QS系統(tǒng)可能是食品保鮮和控制其毒性的一種新途徑。

本研究中，筆者從米曲霉的代謝產(chǎn)物中分離得到一個環(huán)二肽，即環(huán)(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)，該化合物具有很強的QS抑制活性?；诖?，筆者測定了環(huán)二肽對熒光假單胞菌的QS表型的抑制作用，并通過分子對接分析了其抑制機制，旨在為探究腐敗菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)和控制基于QS系統(tǒng)的腐敗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株和培養(yǎng)條件

正丁?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯(C4-HSL)、正己?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯(C6-HSL)、正辛烷酰基-L-高絲氨酸內(nèi)酯(C8-HSL)、正癸?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯(C10-HSL)、正十二烷基-L-高絲氨酸內(nèi)酯(C12-HSL)和正十四烷基-L-高絲氨酸內(nèi)酯(C14-HSL)，Sigma-Aldrich公司(色譜純)。

紫色桿菌(Chromobacteriumviolaceum) CV026保藏于30%甘油中，于-80 ℃保藏。C.violaceumCV026是mini-Tn5突變體，自身不能產(chǎn)生信號分子，但是遇到外源的短鏈信號分子((C4～C8)-HSLs)時，能產(chǎn)生紫色桿菌素使平板變紫色。熒光假單胞菌分離于腐敗的冷藏水產(chǎn)品；米曲霉(Aspergillusoryzae)D01保存于筆者所在實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1 米曲霉代謝產(chǎn)物萃取

米曲霉用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)(PDA)，添加質(zhì)量分數(shù)0.3%氯霉素。將PDA平板置于培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)7 d后，挑取單菌落接種于沙氏液體培養(yǎng)基(Liquid Sabourand Medium)，30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)6～15 d。將培養(yǎng)物超聲破碎5 min后，紗布進行過濾。將濾液在室溫下用3倍量乙酸乙酯提取2次，靜置過夜。將乙酸乙酯層在35 ℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，直至除去溶劑。將萃取物用適量氯仿溶解，并用0.22 μm濾膜過濾，4 ℃保藏供進一步實驗。

1.2.2 環(huán)二肽的分離純化及鑒定

將萃取物用二氯甲烷和甲醇通過柱層析進行梯度洗脫。用C.violaceumCV026測定各組分的QS抑制活性。各組分經(jīng)Sephadex LH20柱層析后，用二氯甲烷和甲醇以體積比8∶ 1洗脫，用薄層色譜法將相似物質(zhì)合并。合并后的物質(zhì)經(jīng)QS抑制活性測試，用40%甲醇和半制備液相色譜法(Waters 2998,Waters公司)進行分離。用ESI-MS、1H NMR和13C NMR對產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.2.3 環(huán)二肽最小抑菌濃度(MIC)測定

MIC的確定是為了排除物質(zhì)的抗菌性對群體感應(yīng)抑制活性的干擾。將過夜培養(yǎng)的C.violaceumCV026和P.fluorescens(OD600=1.0)按照體積比1∶ 100比例分別接種于LB肉湯培養(yǎng)基，將菌液加入96孔板中，每孔100 μL。在菌液中加入環(huán)二肽，使其最終質(zhì)量濃度為15～120 μg/mL，不加環(huán)二肽的菌液作為對照。28 ℃培養(yǎng)24 h后，用分光光度計測定培養(yǎng)前后600 nm處的吸光度值。以肉眼觀察，96孔板中最低濃度的孔無細菌生長的小分子物質(zhì)的濃度，即為環(huán)二肽的MIC。每組3個平行。環(huán)二肽的QS抑制活性驗證實驗及其對熒光假單胞菌QS表型的影響測定實驗都是在其亞抑菌濃度下進行。

1.2.4 紫色桿菌素實驗

紫色桿菌素實驗參照文獻[18]的方法進行。將過夜培養(yǎng)的C.violaceumCV026按照體積比1∶ 100比例分別接種于100 mL的LB瓊脂培養(yǎng)基(LB瓊脂中需加入10 μL的C6-HSL)。混合均勻后倒平板(平板直徑 90 mm)并用牛津杯打孔。在孔中加入100 μL亞抑菌濃度下的環(huán)二肽，以100 μL氯仿作為空白對照。將培養(yǎng)皿置于28 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察平板顏色變化，孔周圍紫色素減少則表明物質(zhì)具有群體感應(yīng)抑制活性。

1.2.5 生長曲線分析

參照文獻[19]的方法進行細菌生長曲線的測定，稍作修改。將過夜培養(yǎng)的C.violaceumCV026(OD600=1.0)按照體積比1∶ 100比例接種于10 mL LB肉湯培養(yǎng)基，加入環(huán)二肽使其最終質(zhì)量濃度分別為60、30、15和7.5 μg/mL。將試管置于28 ℃培養(yǎng)箱160 r/min搖床培養(yǎng)24 h，每隔4 h用酶標(biāo)儀測定熒光假單胞菌在600 nm處的吸光度值。

1.2.6 熒光假單胞菌無菌上清液的制備

將過夜培養(yǎng)的P.fluorescens(OD600=1.0)按照體積比1∶ 100比例接種于100 mL LB肉湯培養(yǎng)基，加入亞抑菌濃度環(huán)二肽，不加環(huán)二肽的培養(yǎng)基作為對照。28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，12 000 r/min離心15 min，用0.22 μm無菌濾膜過濾上清液，于-20 ℃下保存。

1.2.7 生物被膜的測定

生物被膜的測定參照文獻[20]的方法進行。將過夜培養(yǎng)的P.fluorescens(OD600=1.0)按照體積比1∶ 100比例接種于96孔板，加入亞抑菌濃度的環(huán)二肽，不加環(huán)二肽的孔作為空白對照，將96孔板置于28 ℃下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后，用滅菌水(200 μL)沖洗生物被膜3次，干燥30 min，用200 μL質(zhì)量分數(shù)0.1%結(jié)晶紫(結(jié)晶紫用體積分數(shù)33%冰醋酸溶解)染色30 min后，用滅菌水(200 μL/孔)沖洗生物被膜。每孔加入200 μL 體積分數(shù)95%乙醇，5 min后測定590 nm處吸光度值。每個實驗重復(fù)4次取平均值。

1.2.8 胞外蛋白酶產(chǎn)量的測定

參照文獻[21]的方法測定胞外蛋白酶活性。將10 mL質(zhì)量分數(shù)1.5%脫脂牛奶(115 ℃，0.06 MPa，單獨滅菌30 min)加入90 mL LB瓊脂中，當(dāng)培養(yǎng)基溫度降至50 ℃時，加入100 μL無菌上清液，100 μL氯仿作為空白對照，觀察平板變化。

1.2.9 泳動和群集運動的測定

泳動平板：胰蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂 3 g/L。

群集平板：蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂5 g/L和D-果糖5 g/L。

配制2種培養(yǎng)基，121 ℃滅菌15 min，平板凝固后分別向培養(yǎng)基中心接種1.5 μL菌液，同時加入亞抑菌濃度環(huán)二肽，以不加環(huán)二肽的平板作為對照，將平板置于28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察平板變化。

1.2.10 分子對接分析

酰基高絲氨酸內(nèi)酯合成酶(LuxI蛋白)和LuxR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(LuxR蛋白)的氨基酸序列來自NCBI[acyl-homoserine-lactone synthase (P.fluorescens)，GenBank為OKP72411.1；LuxR family transcriptional regulator (P.fluorescens)，GenBank為KIF57652.1]。利用Swiss-Model[22](https://swiss model.expasy.org)建立LuxI和LuxR蛋白的三維結(jié)構(gòu)。利用SYBYL-X 2.1對配體和受體蛋白結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化。呋喃C-30和C4-HSL的三維結(jié)構(gòu)來自ZINC網(wǎng)站(http://zinc.docking.org/browse/subsets/)。利用SYBYL-X 2.1進行分子對接操作，獲取對接打分并分析配體-蛋白的相互作用。

1.2.11 實時熒光定量PCR驗證

反應(yīng)體系(20 μL)：包含10 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，4 μL超純水，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，5 μL cDNA。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s；55 ℃ 20 s；72 ℃ 20 s；75 ℃ 停留5 s收集熒光信號，反應(yīng)共進行40個循環(huán)，并在65～95 ℃范圍內(nèi)建立溶解曲線。

1.2.12 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，實驗重復(fù)3次。用Origin 8.0進行統(tǒng)計分析及作圖。數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析采用 SPSS Statistics 16.0中的單因素ANOVA多量程檢驗對各組平均值的差異進行分析(p<0.05認為數(shù)據(jù)具有顯著性差異)。

表1 熒光假單胞菌的引物序列Table 1 Primers of candidate genes of P.fluorescens P07

2 結(jié)果與討論

2.1 環(huán)二肽結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

從米曲霉的代謝產(chǎn)物中分離出具有群體感應(yīng)抑制活性的物質(zhì)經(jīng)ESI-MS、1H NMR和13C NMR(圖1)，經(jīng)鑒定為一種環(huán)肽類物質(zhì)(圖2)。ESI-MS結(jié)果顯示：m/z267 [M + Na]+、511 [2M + Na]+和分子量為244，分子式為C14H16N2O2。13C NMR結(jié)果顯示，δ:59.1 (d)，45.4 (t)，28.3 (t)，22.5 (t)，表明該物質(zhì)中有脯氨酸片段；δ:7.29 (5H,m)表明物質(zhì)中具有苯丙氨酸結(jié)構(gòu)。1H NMR (CDCl3,400 MHz)結(jié)果顯示，δ:7.29 (5H,m)，5.81 (1H,br.s,N-H)，4.27 (1H,dd,J= 9.6,2.9,Hz,H-2′)，4.07 (1H,t,J=7.5 Hz,H-2)，3.65 (3H,m,H-3′a,H-5)，2.81 (1H,dd,J= 14.4,9.6 Hz,H-3′b)，2.32 (1H,m,H-3a)，1.95 (3H,m,H-3b,H-4)。13C NMR結(jié)果顯示：(CDCl3,400 MHz)δ:169.4 (s,C-1)，165.1 (s,C-1′) 135.9 (s,C-4′)，129.2 (d,C-5′,C-9′)，129.1 (d,C-6′,C-8′)，127.5 (d,C-7′)，59.1 (d,C-2)，56.2 (d,C-2′)，45.4 (t,C-5)，36.8 (t,C-3′)，28.3 (t,C-3)，22.5 (t,C-4)。通過上述結(jié)果可以得出，這種物質(zhì)為環(huán)- (L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)。

2.2 環(huán)二肽QS抑制活性和對P.fluorescens胞外蛋白酶、泳動、群集的影響

MIC測定結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，環(huán)二肽對C.violaceumCV026和P.fluorescens的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為47.5和80 μg/mL。C.violaceumCV026自身不能產(chǎn)生C6-HSL信號分子，但當(dāng)其遇到外源信號分子時，會產(chǎn)生紫色桿菌素，使平板顯紫色[23]。

圖1 環(huán)二肽的核磁檢測結(jié)果Fig.1 NMR results of the cyclic dipeptide

圖2 環(huán)二肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structure of the cyclic dipeptide

在亞抑菌濃度下，添加環(huán)二肽的孔周圍出現(xiàn)淡黃色的暈圈，而對照組則無明顯變化(圖3(a))，表明環(huán)二肽顯示了群體感應(yīng)抑制活性，且黃色暈圈不透明，表明環(huán)二肽沒有顯示抑菌性，也表明環(huán)二肽的紫色素抑制作用不是由于抑菌性，而是由于群體感應(yīng)抑制活性。

腐敗微生物分泌胞外蛋白酶將食物中的蛋白分解為氨基酸和短肽，并進一步分解為H2S、腐胺醛、酮、酯、有機酸和各種有毒物質(zhì)[24]。在脫脂乳平板中，未經(jīng)環(huán)二肽處理的孔周圍有大而透明的區(qū)域，表明熒光假單胞菌具有產(chǎn)生大量胞外蛋白酶的能力。加入環(huán)二肽后，孔周圍沒有明顯變化(圖3(b))，表明環(huán)二肽顯著抑制了熒光假單胞菌產(chǎn)生胞外蛋白酶的能力。

細菌依靠鞭毛在固體培養(yǎng)基的表面快速遷移，使其能夠逃離抗菌劑和宿主的免疫系統(tǒng)對細菌的殺傷作用。在泳動和群集運動平板上，熒光假單胞菌從接種點開始擴散運動，在平板上形成圓形菌落(圖3(c)、圖3(d))。當(dāng)用環(huán)二肽處理時，菌落的半徑顯著減小，表明環(huán)二肽顯著抑制了熒光假單胞菌的運動性。這一結(jié)果與Norizan等[25]的研究結(jié)果一致，表明咖啡因能抑制銅綠假單胞菌的群集運動[25]。

2.3 環(huán)二肽對熒光假單胞菌生物被膜和生長的影響

細菌產(chǎn)生的生物被膜會對食品工業(yè)造成嚴重危害。生物被膜附著在食品和加工設(shè)備上，即使采用現(xiàn)代技術(shù)也難以徹底清除，給經(jīng)濟帶來巨大損失，對公眾健康也構(gòu)成嚴重威脅。因此，迫切需要尋找能夠干擾或阻斷生物被膜產(chǎn)生的新途徑。生物被膜的產(chǎn)生受到QS系統(tǒng)的調(diào)控。本文中，筆者研究了環(huán)二肽對熒光假單胞菌生物被膜和生長的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 環(huán)二肽對熒光假單胞菌生物被膜和生長的影響Fig.4 Effects of the cyclic dipeptide on bacterial growth and biofilm formation of P.fluorescens

由圖4可知，環(huán)二肽在亞抑菌濃度下，對生物被膜的分泌呈濃度依賴性的抑制作用，環(huán)二肽濃度越高，生物被膜含量越少。特別是當(dāng)環(huán)二肽質(zhì)量濃度為60 μg/mL時，生物被膜含量下降了75.86%。從熒光假單胞菌的生物量可以看出，環(huán)二肽的添加沒有對細菌的生長造成影響。由此表明，環(huán)二肽在沒有干擾細菌生長的前提下，顯著抑制了細菌生物被膜的產(chǎn)生。Husain等[26]發(fā)現(xiàn)丁香油對銅綠假單胞菌P.aeruginosaPAO1和嗜水氣單胞菌AeromonashydrophilaWAF-38的總蛋白酶、綠膿桿菌素、泳動、生物被膜的形成等均有抑制作用。

2.4 環(huán)二肽群體感應(yīng)抑制機制探究

2.4.1 序列比對、同源建模以及模型評價結(jié)果

利用ClustalW程序?qū)δ繕?biāo)蛋白和模板蛋白的序列進行比對，發(fā)現(xiàn)氨基酸序列具有很高的保守性，結(jié)果如圖5所示。從中選擇相似度大于30%的蛋白序列進行同源建模，對模板蛋白的研究表明，分別有3個模板(3p2h.1.A,1ro5.1.A,1k4j.1.A)和9個模板(2q0o.1.A,2q0o.1.B,3qp5.2.A,3qp5.1.B,3qp5.2.B,3qp5.1.A,3szt.1.A,3szt.1.B,3qp6.1.A)適合進行熒光假單胞菌LuxI型蛋白和LuxR型蛋白的建模(表2)。GMQE(global model quality estimation)是指全局模型質(zhì)量評價，其得分用來評價所建模型的質(zhì)量。得分越高，表明模型的質(zhì)量越好。QMEAN(qualitative model energy analysis)定性模型能量分析，是一個綜合評分函數(shù)，能夠在單一模型的基礎(chǔ)上，得出全局和局部的絕對質(zhì)量評估。由表2可知，分別選擇3p2h.1的A鏈和2q0o.1的A鏈作為LuxI型蛋白和LuxR型蛋白的模板蛋白進行同源建模。

圖5 熒光假單胞菌LuxI型蛋白(a)和LuxR型蛋白(b)序列比對結(jié)果Fig.5 Sequence alignment of the acyl-homoserine-lactone synthase (a) and Lux R family transcriptional regulator (b) proteins and template proteins of P.fluorescens

對建好的LuxI型蛋白和LuxR型蛋白模型進行質(zhì)量評價，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，對于LuxI型蛋白和LuxR型蛋白，其QMEAN、Z-score得分別是0.66、-1.08和0.57、-2.16，表明2個模型均具有較好的質(zhì)量。Gnanendra等[27]也通過同源建模的方法建立了鼠傷寒沙門菌SdiA的同源物模型，并將SdiA與AHL進行分子對接分析。

2.4.2 分子對接結(jié)果

基于AHL的QS系統(tǒng)由LuxI型和LuxR型受體蛋白組成。該合成酶產(chǎn)生的AHLs作為信號分子與受體蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)某些QS靶基因的表達。為了探討環(huán)二肽對熒光假單胞菌QS系統(tǒng)的抑制機制，采用分子對接技術(shù)研究其與受體蛋白之間可能的相互作用。P.fluorescens的LuxI型蛋白和LuxR型蛋白模型與環(huán)(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)、C4-HSL和呋喃C-30的對接結(jié)果如圖7所示，從圖7中可以看出，環(huán)二肽嵌于LuxI型蛋白的對接口袋中，二者形成了重要的相互作用。環(huán)二肽與LuxI型蛋白的關(guān)鍵殘基ARG105形成氫鍵；與LuxR型蛋白模型的關(guān)鍵殘基LEU177形成關(guān)鍵氫鍵。C4-HSL和呋喃C-30分別與LuxR型蛋白模型的GLU183和ARG164形成了關(guān)鍵氫鍵。

配體與蛋白的對接得分如表3所示。表中，Crash是碰撞打分，Polar是指氫鍵和鹽橋相互作用對總得分的貢獻。由表3可知：環(huán)二肽與LuxI型蛋白模型對接得分為4.5836，高于LuxR型蛋白(3.1372)。信號分子C4-HSL與LuxR型蛋白模型的總得分為2.8235，高于呋喃C-30(1.7139)。環(huán)(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)與LuxI型蛋白模型的對接得分高于其他模型，特別是天然配體C4-HSL。表明該抑制機制可能是由于環(huán)二肽與LuxI蛋白競爭性結(jié)合，從而抑制了信號分子的產(chǎn)生，從而阻斷了QS通路和相關(guān)基因的表達。

2.5 RT-qPCR驗證結(jié)果

通過RT-qPCR技術(shù)，探究環(huán)二肽對熒光假單胞菌的luxI、luxR以及與細菌運動相關(guān)基因(flgA)的影響，相關(guān)基因的表達差異結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，細菌經(jīng)環(huán)二肽處理后，luxI和flgA基因與對照相比顯著降低，其相對表達量分別減少了42.65%和32.80%，而luxR基因變化不顯著，以上結(jié)果也驗證了分子對接技術(shù)的結(jié)果。

3 結(jié)論

通過探究從米曲霉的代謝產(chǎn)物中分離得到的環(huán)二肽的群體感應(yīng)抑制活性，并測定其對水產(chǎn)腐敗菌——熒光假單胞菌胞外蛋白酶的產(chǎn)生、生物被膜的分泌等的影響，發(fā)現(xiàn)其對熒光假單胞菌的群體感應(yīng)表型具有很好的抑制效果。由此表明，從真菌的代謝產(chǎn)物中篩選出具有較強群體感應(yīng)抑制活性的QSIs是完全可行的，環(huán)二肽可能是一種新的、有潛力的群體感應(yīng)抑制劑。

此外，通過分子對接技術(shù)和RT-qPCR技術(shù)分析環(huán)二肽的抑制機制，發(fā)現(xiàn)環(huán)二肽對熒光假單胞菌的QS系統(tǒng)的抑制作用很可能是因為環(huán)二肽結(jié)合到了LuxI型蛋白中，阻斷了AHLs的產(chǎn)生，導(dǎo)致其不能與LuxR型蛋白結(jié)合，從而阻斷了其QS通路以及相關(guān)基因的表達，最終導(dǎo)致熒光假單胞菌的QS表型的表達受阻，引起一系列QS調(diào)控的表型如群集性、泳動性、生物被膜等的抑制現(xiàn)象。通過同源建模所構(gòu)建的熒光假單胞菌的QS系統(tǒng)的LuxI和LuxR蛋白模型可能成為發(fā)現(xiàn)新的食品防腐劑的潛在靶點。

表2 熒光假單胞菌LuxI型蛋白和LuxR型蛋白同源建模結(jié)構(gòu)和得分Table 2 Structures and scores of template proteins of acyl-homoserine-lactone synthase and LuxR family transcriptional regulator of P.fluorescens

圖6 熒光假單胞菌LuxI型蛋白(a～c)和LuxR型蛋白(d～f)模型評價結(jié)果Fig.6 Assessment of the acyl-homoserine-lactone synthase (a-c) and Lux R family transcriptional regulator (d-f) proteins of P.fluorescens

圖7 環(huán)二肽與熒光假單胞菌LuxI型蛋白和LuxR型蛋白分子對接結(jié)果Fig.7 Molecular docking of the cyclic dipeptide and other ligands with acyl-homoserine-lactone synthase and Lux R family transcriptional regulator models of P.fluorescens

表3 環(huán)二肽、C4-HSL、furanone C-30和熒光假單胞菌的LuxI型蛋白和LuxR型蛋白分子對接結(jié)果Table 3 Docking results of acyl-homoserine-lactone synthase and Lux R family transcriptional regulator models of P.fluorescens with cyclo-(L-phenylalanyl-L-prolyl),C4-HSL and furanone C-30

圖8 環(huán)二肽對熒光假單胞菌基因表達的影響Fig.8 Effects of the cyclic dipeptide on gene expression in P.fluorescens