群體感應(yīng)系統(tǒng)介導(dǎo)細(xì)菌生物膜形成的研究進(jìn)展

張?zhí)煺?，劉伶普，李文超，賈士儒，鐘 成

(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457)

細(xì)菌生物膜是指細(xì)菌通過(guò)分泌細(xì)胞外聚合物(EPS)形成高度組織化、系統(tǒng)化的膜狀結(jié)構(gòu)[1-2]。細(xì)菌可借助生物膜增強(qiáng)自身對(duì)于環(huán)境中多種脅迫、對(duì)抗生素的耐受性以及宿主免疫系統(tǒng)攻擊抵抗能力。雖然部分微生物生物膜的形成會(huì)導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)、致病力增強(qiáng)、加劇耐藥形成等負(fù)面作用[3]，但功能性微生物生物膜具有廣闊的應(yīng)用前景，如細(xì)菌纖維素(BC)。BC是一種三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的胞外纖維素，具有高純度、高抗張強(qiáng)度、優(yōu)良的生物適應(yīng)性等理化性質(zhì)，在食品、醫(yī)療及材料領(lǐng)域廣泛使用[4-5]。目前，銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)[6]、大腸肝菌(E.coli)[7]、金黃色葡萄球菌(S.aureus)[8]與霍亂弧菌(V.cholerae)[9]等微生物的生物膜形成與群體感應(yīng)現(xiàn)象間關(guān)聯(lián)已有部分研究。生物膜的形成過(guò)程與調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，探究群體感應(yīng)與生物膜之間的關(guān)系對(duì)降低細(xì)菌耐藥性、指導(dǎo)食品生產(chǎn)安全以及提高功能性生物膜產(chǎn)量具有現(xiàn)實(shí)意義。

1 群體感應(yīng)系統(tǒng)

Nsalson等[10]在1970年報(bào)道了海洋費(fèi)氏弧菌(Vibriofischeri)的菌體密度與一種夏威夷魷魚(yú)的生物發(fā)光能力成正相關(guān)，該現(xiàn)象受細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)所調(diào)節(jié)。細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中會(huì)不斷生成1種自體誘導(dǎo)物(AI)的化學(xué)信號(hào)分子。它會(huì)隨著細(xì)菌的細(xì)胞種群密度不斷增加而同步增長(zhǎng)[11]，當(dāng)自體誘導(dǎo)物從細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散到細(xì)胞外，其在細(xì)胞外環(huán)境中累積達(dá)到一定閾值后開(kāi)啟細(xì)胞密度依賴(lài)的特定基因表達(dá)，這種細(xì)菌細(xì)胞與細(xì)胞間的通訊系統(tǒng)即為群體感應(yīng)(QS)。細(xì)菌主要的QS信號(hào)分子如表1所示，其調(diào)控的生理功能包括生物體的發(fā)光、Ti 質(zhì)粒的接合與轉(zhuǎn)移、生物膜的形成與生長(zhǎng)、細(xì)菌胞體的分化、抗生素的形成、胞外多糖的生成、病原微生物的毒性、細(xì)菌與生物體的共生等[12-15]。由于眾多人體或植物病原菌的病理反應(yīng)受QS系統(tǒng)的調(diào)控，且許多微生物代謝產(chǎn)物也受到該機(jī)制的介導(dǎo)，QS系統(tǒng)已成為醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)、生物工程學(xué)等多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

表1 細(xì)菌信號(hào)分子及作用Table 1 Structure and function of signal molecules in bacteria

1.1 革蘭氏陽(yáng)性菌經(jīng)典群體感應(yīng)機(jī)制

在革蘭氏陽(yáng)性菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)中，菌體內(nèi)的前導(dǎo)肽被修飾和加工得到的寡肽類(lèi)物質(zhì)(AIPs)，即革蘭氏陽(yáng)性菌的信號(hào)分子。AIPs類(lèi)分子具有保守的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，由C端第5位的半胱氨酸與C末端的氨基酸殘基連接而成。與革蘭氏陰性菌的信號(hào)分子不同，AIPs不能自由地通過(guò)細(xì)胞膜，必須依賴(lài)膜上自誘導(dǎo)肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)或透性酶的協(xié)助。革蘭氏陽(yáng)性菌的群體感應(yīng)機(jī)制主要分為兩大系統(tǒng)：專(zhuān)一性的ATP-結(jié)合盒(ABC) 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[16]和調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)[17]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，負(fù)責(zé)信號(hào)分子的跨膜運(yùn)輸；組氨酸蛋白激酶和天冬氨酸蛋白激酶作為兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)(TCS)負(fù)責(zé)傳遞磷酸基團(tuán)。細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中，大量AIPs被ABC系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，當(dāng)AIPs含量到達(dá)特定閾值后，會(huì)被細(xì)胞膜上的雙組分受體特異性識(shí)別，激活受體激酶蛋白，使得組氨酸殘基磷酸化。隨后響應(yīng)調(diào)節(jié)子蛋白活化，天冬氨酸殘基磷酸化。啟動(dòng)子與活化的響應(yīng)調(diào)節(jié)子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。群體感應(yīng)調(diào)控的目的基因中還包括部分自誘導(dǎo)肽修飾、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)與TCS系統(tǒng)基因，在一定的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)形成自誘導(dǎo)作用[18]。

1.2 革蘭氏陰性菌經(jīng)典群體感應(yīng)機(jī)制

1.2.1 費(fèi)氏弧菌群體感應(yīng)機(jī)制

QS系統(tǒng)首次發(fā)現(xiàn)于由海洋費(fèi)氏弧菌調(diào)控的夏威夷魷魚(yú)的發(fā)光現(xiàn)象中，當(dāng)費(fèi)氏弧菌的菌體密度達(dá)到一定的閾值后，就會(huì)誘導(dǎo)發(fā)光基因的表達(dá)。如圖1所示，費(fèi)氏弧菌的QS系統(tǒng)由調(diào)控蛋白LuxR蛋白、自體誘導(dǎo)物合成酶LuxI蛋白和信號(hào)分子N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類(lèi)化合物(AHLs)三部分組成，被視為革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)的模式系統(tǒng)。許多革蘭氏陰性細(xì)菌的QS系統(tǒng)都與費(fèi)氏弧菌中由LuxR/LuxI蛋白調(diào)控系統(tǒng)相似，如紫色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)[19]、銅綠假單胞菌[20-21]、根瘤菌(Rhizobium)[22]、木醋桿菌(Gluconacetobacterxylinum)[23]等。

圖1 群體感應(yīng)系統(tǒng)LuxR/LuxI調(diào)節(jié)機(jī)制Fig.1 Regulatory mechanism of LuxR/LuxI in quorum sensing

AI合成酶LuxI蛋白能夠合成信號(hào)分子AHLs。LuxI蛋白酶通過(guò)將?；?酰基載體蛋白(acyl-ACP)的?；鶄?cè)鏈與S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的高半胱氨酸基團(tuán)特異性結(jié)合，形成酰化的HSL，隨后內(nèi)酯化形成Acyl-HSL(AHLs)。LuxR家族蛋白是在信號(hào)分子AHLs介導(dǎo)的細(xì)菌QS中一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，具有AI結(jié)合框，能夠與信號(hào)分子結(jié)合并參與細(xì)胞之間的感應(yīng)。LuxR蛋白C端保守的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)可以與目的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)box序列特異性結(jié)合形成二聚體，調(diào)控特異基因表達(dá)。LuxR蛋白作為激活子與DNA作用會(huì)誘導(dǎo)RNA聚合酶與目的基因啟動(dòng)子結(jié)合[24]。當(dāng)AHLs濃度低于閾值時(shí)，N端序列會(huì)抑制C端序列與RNA聚合酶的結(jié)合；當(dāng)AHLs濃度水平較高時(shí)，N端序列與AHLs結(jié)合，N端序列解除對(duì)C端序列的抑制，C-短端參與寡聚化并與啟動(dòng)子DNA結(jié)合[25]。不同屬的微生物間的LuxR的氨基酸序列差異較大，但95%的LuxR型蛋白的AHL結(jié)合框結(jié)構(gòu)處具有6個(gè)保守的氨基酸，分別是57位色氨酸(W57)、61位酪氨酸(Y61)、70位天冬氨酸(D70)、71位脯氨酸(P71)、85位色氨酸(W85)和113位甘氨酸(G113)[26]。不同細(xì)菌中LuxR蛋白具有特殊的AHLs?；Y(jié)合框，每一種細(xì)菌都能對(duì)其自身的群體感應(yīng)信號(hào)識(shí)別、監(jiān)控、并作出反應(yīng)。

毛磊磊等[27]對(duì)嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)的研究發(fā)現(xiàn)：敲除luxR同源基因后，利用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)luxI基因的表達(dá)量顯著降低，表明敲除luxR同源基因會(huì)影響AHLs的合成酶基因表達(dá)量，從而抑制信號(hào)分子AHLs的生成。揭金鑫等[28]構(gòu)建了luxR基因缺失海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)，發(fā)現(xiàn)缺失lusR缺失對(duì)菌體生長(zhǎng)并無(wú)影響，而對(duì)其產(chǎn)硫能力影響顯著，削弱了該菌的致腐能力。Tang等[29]發(fā)現(xiàn)luxI和luxR缺失熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)的生物膜和胞外多糖產(chǎn)量顯著降低，生物膜結(jié)構(gòu)較薄且不致密，添加外源C4-HSL后，luxI缺失菌株的生物膜逐漸恢復(fù)致密。

不同AHLs分子的保守的疏水性的高絲氨酸內(nèi)酯五元環(huán)部分高度保守，差異只在于親水性的酰胺側(cè)鏈的長(zhǎng)度與結(jié)構(gòu)[30]。酰胺側(cè)鏈的碳原子數(shù)從4個(gè)到18個(gè)不等，多為偶數(shù)個(gè)，奇數(shù)僅為7碳，并且鏈上的第3位碳原子上具有氫、羥基和羰基取代基[31]，圖2為一些典型的AHLs分子結(jié)構(gòu)。當(dāng)酰胺側(cè)鏈碳個(gè)數(shù)在8個(gè)以?xún)?nèi)時(shí)，AHLs可穿透磷脂雙層膜自由擴(kuò)散，當(dāng)側(cè)鏈大于10個(gè)碳則需借助于運(yùn)輸載體來(lái)轉(zhuǎn)移[32]。

圖3 群體感應(yīng)系統(tǒng)LasR/LasI和RhlR/RhlI的調(diào)節(jié)機(jī)制 Fig.3 Regulatory mechanism of LasR/LasI and RhlR/RhlI in quorum sensing

圖2 AHLs的基本結(jié)構(gòu)Fig.2 Basic structure of AHLs

1.2.2 銅綠假單胞菌群體感應(yīng)機(jī)制

銅綠假單胞菌的順序型QS系統(tǒng)由Las和Rhl系統(tǒng)組成，這些系統(tǒng)均受自誘導(dǎo)物AHLs調(diào)節(jié)[33]。如圖3所示，Las和Rhl系統(tǒng)分別由轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控因子lasR、rhlR和自誘導(dǎo)物合成酶基因lasI、rhlI組成，它們負(fù)責(zé)檢測(cè)細(xì)胞的濃度，會(huì)隨著細(xì)菌種群數(shù)量變化對(duì)相應(yīng)基因的表達(dá)做出調(diào)節(jié)。當(dāng)LasR的自誘導(dǎo)物結(jié)合框和AHLs的同系物3-oxo-C12-HSL嵌合時(shí)，Las系統(tǒng)被激活并調(diào)控彈性蛋白酶、堿性蛋白酶、外毒素A等毒力因子的表達(dá)[34-36]。RhlR與AHLs另一同系物C4-HSL結(jié)合后可調(diào)控生成鼠李糖脂、幾丁質(zhì)酶、氰化物等次級(jí)代謝產(chǎn)物。Las系統(tǒng)可以調(diào)控毒性基因的表達(dá)，Rhl系統(tǒng)也可以間接地通過(guò)調(diào)控Las系統(tǒng)來(lái)啟動(dòng)毒性基因表達(dá)。Las系統(tǒng)不僅可以激活Rhl系統(tǒng)，還可通過(guò)LasI合成酶蛋白分泌產(chǎn)生的信號(hào)分子AHLs競(jìng)爭(zhēng)性地抑制調(diào)控蛋白R(shí)hlR與其自身信號(hào)分子的結(jié)合，起到相應(yīng)的負(fù)調(diào)控作用[37]。

2 群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)生物膜生成的調(diào)控作用

2.1 群體感應(yīng)系統(tǒng)直接介導(dǎo)生物膜形成

細(xì)菌生物膜的形成過(guò)程主要分為四大階段，如圖4所示。最初為細(xì)菌初始聚集階段，細(xì)菌借助鞭毛的運(yùn)動(dòng)、流體動(dòng)力、布朗運(yùn)動(dòng)等方式到達(dá)載體表面；第二階段為細(xì)胞間的黏附和增殖過(guò)程，吸附到載體表面的細(xì)菌在繁殖過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，分泌出EPS(包括多糖、蛋白質(zhì)、胞外DNA等)黏附于載體表面形成聚集態(tài)；第三階段為生物膜成熟，細(xì)菌通過(guò)生長(zhǎng)和繁殖形成復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)的生物膜；第四階段為生物膜的分散，生物膜中的EPS分解，單個(gè)細(xì)菌脫離生物膜，進(jìn)入周?chē)h(huán)境中，進(jìn)入下一個(gè)生物膜周期。QS系統(tǒng)通過(guò)監(jiān)測(cè)其群體的細(xì)胞密度來(lái)調(diào)節(jié)特定的基因表達(dá)，控制整個(gè)細(xì)菌群體的生長(zhǎng)、代謝等行為，以確保生物膜中微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)與代謝物的正常分泌，避免營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏等，為菌體生長(zhǎng)以及生物膜形成提供保障[38]。

QS系統(tǒng)和環(huán)境信號(hào)應(yīng)答系統(tǒng)調(diào)控細(xì)菌形成成熟的生物膜，主要是通過(guò)細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中不利的環(huán)境因子誘發(fā)細(xì)胞的環(huán)境信號(hào)應(yīng)答系統(tǒng)，使細(xì)菌分泌信號(hào)分子，當(dāng)其累積達(dá)到一定閾值時(shí)，就會(huì)結(jié)合到細(xì)菌的信號(hào)分子應(yīng)答元件上，改變細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控元件轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，從而調(diào)控EPS(多糖基質(zhì)、脂質(zhì)蛋白、纖維蛋白等)的合成控制細(xì)菌的粘附能力，影響生物膜成熟與結(jié)構(gòu)[39-40]。QS系統(tǒng)還可促進(jìn)生物膜的解離過(guò)程，金黃色葡萄球菌的Agr系統(tǒng)可通過(guò)上調(diào)多肽酶和核酸酶的表達(dá)促進(jìn)生物膜解離，加速細(xì)菌分散、感染[41-42]。

圖4 群體感應(yīng)系統(tǒng)在細(xì)菌生物膜形成中的調(diào)控過(guò)程Fig.4 The control process of Quorum sensing in bacterialbiofilm

另一方面，QS系統(tǒng)介導(dǎo)EPS分泌還可使生物膜從延展模式切換為保護(hù)模式，利用EPS應(yīng)對(duì)環(huán)境威脅[43]。QS調(diào)節(jié)系統(tǒng)表明細(xì)菌間的信息交流是一種動(dòng)態(tài)的過(guò)程，受到了營(yíng)養(yǎng)成分、溫度、pH等多種環(huán)境因子的影響，是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程。Kim等[44]發(fā)現(xiàn)假單胞菌產(chǎn)生的鼠李糖脂，可促進(jìn)細(xì)菌從生物膜中分離來(lái)影響生物膜形成，之后鼠李糖脂作為生物表面活性劑被廣泛應(yīng)用于抗菌、防污染等方面[45]。Davies等[46]對(duì)銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)與生物膜關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，不能產(chǎn)生特定AHLs信號(hào)分子的突變菌株只能形成均質(zhì)、扁平的生物膜；在人為添加信號(hào)分子后，突變菌株又能形成成熟的生物膜，從而證實(shí)QS系統(tǒng)可調(diào)控銅綠假單胞桿菌生物膜的形成與結(jié)構(gòu)。Hebert等[47]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌(Escherichiacoli)可通過(guò)SdiA蛋白檢測(cè)其他細(xì)菌分泌的AHLs，來(lái)控制細(xì)胞膜的合成。

2.2 群體感應(yīng)系統(tǒng)協(xié)同其他信號(hào)分子介導(dǎo)生物膜形成

除了基于群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控外，部分細(xì)菌中還存在著同樣可介導(dǎo)生物膜形成的其他信號(hào)分子，在生物膜形成階段中有著重要作用。環(huán)二鳥(niǎo)苷酸(c-di-GMP)是一種對(duì)纖維素合成酶有變構(gòu)激活作用的鳥(niǎo)苷酰寡核苷酸類(lèi)物質(zhì)，為第二信使分子之一[48]。其濃度受自體誘導(dǎo)物的調(diào)節(jié)，它可以快速升降來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)代謝系統(tǒng)的酶活性，控制營(yíng)養(yǎng)成分的吸收利用、能量轉(zhuǎn)移、細(xì)胞代謝物分泌等微生物生命活動(dòng)。第二信使也控制著細(xì)胞的增殖、分化和生存，并參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控[49-50]。c-di-GMP的合成酶和降解酶感受胞外信號(hào)后可改變胞內(nèi)c-di-GMP水平，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后水平上調(diào)控細(xì)菌生物被膜形成、EPS分泌、毒性因子產(chǎn)生、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、黏附性等生理功能。

c-di-GMP調(diào)控的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、EPS分泌、生物膜形成等功能同時(shí)受控于群體感應(yīng)系統(tǒng)，Waters等[51]發(fā)現(xiàn)在霍亂弧菌中當(dāng)存在QS調(diào)節(jié)子HapR時(shí)，QS系統(tǒng)對(duì)生物膜的調(diào)節(jié)作用依賴(lài)于c-di-GMP。Rahman等[52]報(bào)道了維羅納氣單菌(Aeromonasveronii)中c-di-GMP的增加可以促進(jìn)C4-HSL信號(hào)分子的產(chǎn)生。Bomin等[53]報(bào)道了銅綠假單胞菌QS中LasR/LasI系統(tǒng)可通過(guò)誘導(dǎo)DGC活性來(lái)正向調(diào)控c-di-GMP，RhlR/RhlI系統(tǒng)通過(guò)誘導(dǎo)PDE活性來(lái)負(fù)向調(diào)節(jié)c-di-GMP水平，QS系統(tǒng)與c-di-GMP相互交叉調(diào)控細(xì)胞毒力與生物膜形成。Theodora等[54]發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌的QS系統(tǒng)中HapR蛋白可抑制c-di-GMP合成基因的表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)c-di-GMP降解而間接抑制生物膜的形成，由于HapR的合成存在時(shí)間性，因此這種抑制作用僅存在于高細(xì)胞密度時(shí)；而低細(xì)胞密度時(shí)，c-di-GMP的合成未受到抑制，其濃度增加，可促進(jìn)霍亂弧菌的多糖合成，進(jìn)而促進(jìn)生物膜的形成，這一發(fā)現(xiàn)同時(shí)證明了在QS信號(hào)分子未達(dá)到閾值時(shí)，c-di-GMP調(diào)控著細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)聚集、增殖、營(yíng)養(yǎng)吸收、合成EPS等生理功能，隨著細(xì)胞密度增高并到達(dá)閾值，QS系統(tǒng)開(kāi)始調(diào)控生物膜黏附、成熟與分散過(guò)程，進(jìn)而印證了c-di-GMP的信號(hào)通路并不是孤立的，而是與雙組分系統(tǒng)、QS系統(tǒng)等組成了復(fù)雜的信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)，共同介導(dǎo)細(xì)菌生物膜的形成。

3 結(jié)論

微生物中細(xì)胞與細(xì)胞之間的交流是一種極其普遍的現(xiàn)象，不同細(xì)菌的QS機(jī)制與其調(diào)控的生理功能各具特色，可在不同的工業(yè)領(lǐng)域中加以應(yīng)用。例如通過(guò)分子手段抑制信號(hào)分子的生成、信號(hào)分子降解酶制劑、針對(duì)自誘導(dǎo)物結(jié)合域?qū)ふ倚盘?hào)分子類(lèi)似物競(jìng)爭(zhēng)抑制等方式抑制致病菌生物膜的形成，為解決食品安全、醫(yī)療健康問(wèn)題提供新思路。而有益微生物生物膜的形成有利于抵抗環(huán)境脅迫壓力，同時(shí)功能性生物膜也具有良好的應(yīng)用前景及研究意義。隨著對(duì)群體感應(yīng)系統(tǒng)復(fù)雜性的重視程度的加深，對(duì)信號(hào)的生物分子合成及調(diào)控機(jī)制的研究顯得尤為重要，深入探究其介導(dǎo)生物膜形成機(jī)制，為研究細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)拓寬思路。